Name: implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis
Uploaded: 2014-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 52 s
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この作品は、米国心臓協会（AM）、米国国防総省（BC074986）、ボストン小児病院学部キャリア開発フェローシップ（TM、AM）からの資金によってサポートされていました。著者は、技術支援のためのアマンダ江とエリザベート江に感謝。

注：in vivoでの動物実験は、国立衛生研究所の実験動物の管理と使用に関する指針の推奨事項に厳密に従って実施した。プロトコルを見直し、ボストン小児病院の動物実験委員会によって承認された（プロトコル番号：13-10-2526R、14-02-2568R）。このプロトコルで使用されるすべての薬物は、医薬品グレードであり、これらの薬物は、無菌条件下で調製される。 1.フィブリンゲルの準備<ol><li> VEGFおよびbFGFが含まれているフィブリンゲルを準備します。 <ol><li>室温（25℃）に-80℃で保存されたフィブリノーゲンおよびトロンビ​​ンのストック溶液を解凍する。 </li><li>フィブリノゲンへのCaCl 2（最終濃度：45ミリモル）、VEGF（終濃度：0〜100 ng / ml）をおよびbFGF（0-100 / mlの最終濃度）のトロンビン（2.5 U / mlの最終濃度）を添加する溶液（最終濃度：0.9％sodiu 12.5 mg / mlの1.5mlチューブにおけるm食塩43-45）。 </li><li>ピペッティングにより穏やかに混合します。 </li><li>穏やかにp200とのピペットチップを用いて滴下様式で滅菌プラスチックシャーレ上に混合物200μlをピペット。 </li><li>彼らが固化するまで、30〜60分間、37℃で滴をインキュベートする。 注：固化ゲル注入（ 図1a）の前に数時間、室温（25℃）で密封されたプラスチックディッシュに保つことができる。 </li></ol></li><li>移植前に小さな外科用ハサミを用いて約3×3×3 mmの立方体にフィブリンゲルをトリミング。 </li></ol> 2.マウスの準備<ol><li>腹腔内ケタミンの（IP）注射（100mg / kg）およびキシラジン（10mg / kgの）によって成体マウス（8-12週）を麻酔し、マウスが十分にマウスのつま先をつまんで麻酔をかけていることを確認します。 <ol><li>実験中に乾燥を防ぐために、マウスの目に獣医軟膏を使用してください。 </li></ol></li><li>シェーブFUマウスの胸郭の左側の上R。 </li><li>マウスの気管内挿管を行います。 </li><li> 70°の角度をなす挿管スタンドにマウスを置き、スタンドの上部にある小さなゴムバンドの上に、その上部切歯をフックによって所定の位置にマウスを保持する。 </li><li>静かに鈍鉗子を用いて片側に舌を撤回。 </li><li>光ファイバグースネック顕微鏡照明装置を用いて喉頭を視覚化。 </li><li>気管内に気管内弾性カテーテル（21 G）を挿入します。 </li><li>マウスが自然発生的に（通常の100〜150呼吸/分、ない逆説的または浅い呼吸）がスムーズな方法で呼吸していることを確認してください。 </li><li>解剖顕微鏡下で発生しやすい位置にマウスを置きます。 </li><li>機械的にげっ歯類人工呼吸器（150呼吸/分、7ミリリットル/ kgの一回換気量）を使用して、マウスを換気する。 </li><li> 4 番目と5 番目の肋骨の間の肋間スペースを見つけるために肋骨を数える。 </li><li>エリアBの上に無菌のフィールドを作成します。yは徹底的にアルコールやポビドンヨードで拭く。無菌の外科用ドレープで適切に手術野をカバーしています。 </li></ol> 3.マウスの手術<ol><li>皮膚の0.25％ブピバカイン（200μl）を局所注射した後、解剖ハサミを使用して、肋間空間にわたって横断皮膚切開（約1cm長）を作る。 </li><li>肋間筋に0.25％ブピバカイン（200μL）を注入した後、細かい小さなハサミを使用して4 番目と5 番目の肋骨の間の筋肉の切開を作る。 </li><li>完全に左肺を可視化するために、リブの間の解剖リトラクターを挿入します。 <ol><li>細かい鉗子を使用して、左肺の中央の臓側胸膜の小さな領域（1×1mm角）をこすり。 </li><li>出血や空気の漏れが完全に制御されるまで滅菌綿棒を使用して領域に穏やかな圧力を適用します。 </li><li>フィブリノゲン/トロンビン（フィブリン糊）の新鮮な混合物（ステップ1.1.2。20＆＃少量を入れて181、p200とピペットチップを使用して領域にわたってリットル）。 </li></ol></li><li>優しくエリア（ 図1b）の上に小さな鉗子を用いて1フィブリンゲル（ステップ1.2）を配置。 <ol><li>ゲルが十分に肺の呼吸運動中にエリア上に固定されていることを確認します。 </li></ol></li><li>どちらも大規模な空気漏れや肺からの出血があることを確認してください。 </li><li>削除する必要はありません吸収性縫合糸、との緊密な切開（筋肉と皮膚層）。 </li><li>気胸を防ぐために27 G針および1mlシリンジを使用して胸腔を吸引する。 </li><li>機械的な換気を終了します。 </li></ol> 4.マウスの回復<ol><li>マウスが自然発生的にスムーズな方法（定期的な100〜150呼吸/分、ない逆説的または浅い呼吸）で呼吸していることを確認してください。 </li><li> IP脱水を防ぐために、予め温めておいた0.9％のNaClを1ml注入する。 </li><li>マウスは、循環温水パッド上で回復できるようにする。 </li><li> endotracheを削除マウスが安定した呼吸を持っていることを確認した後、他のチューブ。 </li><li>術後の鎮痛剤として3日間、メロキシカム（5 mg / kgを皮下注射（SC）を注入する。 </li><li>それは（その胃の上にロールバックすることが可能と直立のまま）胸骨で、意識的になるまで丁寧に15分間隔の最小のマウスの動きを監視します。 </li><li>回復後、手術をせずにマウスから単離された新しいケージにマウスを返す。 </li><li>毎日、以下の感染の兆候（発赤、腫脹、放電）、動物の基本的な生物学的機能（食品や水の摂取、排尿、排便、体重増加）だけでなく、臨床徴候苦痛のための手術部位（立毛、縮小運動）を監視外科的手技。 </li></ol> 5.収穫肺<ol><li> 7〜30日間、移植後、圧縮ガスの供給源を介してCO 2を使用して、マウスを安楽死させる。 </li><li>剣状突起の先端と胸骨の間に切開を作るノッチ（胸骨正中切開）と気管を切断し、心臓、肺、気管へのすべての接続を解剖することにより組織学的および生化学分析のために注入されたゲルと収穫肺全体。 </li><li> 、、4℃で一晩、4％パラホルムアルデヒド溶液で肺に移植されたゲルを固定OCT化合物に埋め込み、厚さ30μmの連続段部を取る。 </li><li>共焦点顕微鏡22,37,40を使用して（アクアポリン（AQP）5と界面活性タンパク質（SP）-B：CD31、上皮マーカー内皮マーカー）組織学的（ヘマトキシリン及びエオシン染色）および免疫組織化学的分析を実行します。 </li><li> 3D画像解析ソフトウェア37を使用して、肺の内皮および上皮細胞の三次元画像を形成する光学切片（厚さ30μm）のスタックをコンパイルする。 </li><li>画像解析ソフトウェア46を使用して、新しく形成された血管の投影面積を定量化する。 </li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

この記事では、成体マウスの生体の肺表面上の生体材料を注入するための新しい方法を紹介します。このシステムでは、ホスト肺由来の血管新生は、正常に材料内部に要約されている。このシステムは、研究者は内皮細胞、他の細胞（ 例えば 、上皮細胞、間葉系細胞、免疫細胞）とローカル血管新生50〜53と肺胞の再生24,54のために必要とされる様々なECM成分の間のク?...

このプロトコルの全体的な目標は、研究者は肺血管および肺発達の分子機構を特徴づけることができ、成体マウスの肺表面にフィブリンゲルを注入する方法を導入すること、及び可能な生体模倣材料を開発するためにこの知識を活用することである様々な肺疾患を治療するための生理的な肺の血管および肺胞形成を反復するの。 35以上の万人のアメリカ人が慢性閉塞性肺疾患および肺線維症を含む慢性肺疾患に苦しむ。これらの患者は大幅に日常生活1-3を損なうような息切れ、胸部圧迫感、しつこい咳、および疲労などの長期的な慢性呼吸器症状を持っている。これらの肺疾患のための効果的な治療法を開発する努力が多量にもかかわらず、現在、治療法は存在しない。そのため、これらの患者の生活の質が悪いと経済で、人的コストがhiであるGH 4-7。現在、肺移植は、末期慢性肺疾患を有する患者を保存する唯一の方法である。しかし、移植ドナー、高コスト、深刻な合併症、および低い生存率8-11の不足のため、移植が最適なアプローチではありません。組織工学技術の最近の急速な進歩は、前駆細胞または人工多能性幹（iPS）細胞12,13の様々なタイプの脱細胞化肺全体を再増殖することにより、移植可能な肺をbioengineerする研究者を可能にした。しかし、これらの生体工学肺が唯一の注入12,14,15後に数時間の宿主動物において機能的である。肺の複雑な構造および機能を再生するために生体材料を利用しても、かなり成功していない。成人の肺の再生を支配する主要な生物学的プロセスが十分に検討されていないためと考えられる。肺では、血管系の形成が早いと最も重要なイベントの一つ対応時間は限らですNGの開発と再生16-21。肺で新たに形成された血管系は、酸素、栄養素や器官形成に必要な各種の細胞成分を提供するだけでなく、細胞の22〜25の周囲に有益な調節シグナルを提供するだけでなく。このように、血管新生は、成人肺24,26,27回生肺胞形成において重要な役割を果たしている。また、調節解除された血管新生は、慢性閉塞性肺疾患（COPD）28、気管支肺異形成（BPD）、21-23、および肺線維症29のような慢性の肺疾患に寄与する。したがって、肺のエンジニアリングまたは慢性肺疾患を治療するためのより効率的な戦略を開発するためには、肺特異的血管形成の基本的メカニズムを理解する必要がある。 各器官は生理学的および病理学的条件30〜33の間で異なる場合がありますユニークな機械的および化学的特性を、表示されます。これらの器官特異microenvironメンツは、内皮細胞の挙動を調節し、器官特異的に24,34-36に血管網の形成を調整する。したがって、肺の再生のためのより効率的な戦略を開発するために、肺特異的血管形成の基礎となるメカニズムは、理解される必要がある。皮下ヒドロゲル移植のような従来のin vivoでの血管形成アッセイは、血管形成の研究37-39ために広く使用されてきたが、これらの方法は、器官特異的血管形成を再現しない。最近、マウス肺弾性モールドにマトリゲルを移植するための新規な方法が開発され、成功したゲル22中に血管および肺上皮細胞を動員することが示されている。このユニークなアプローチは、研究者は肺特異的血管形成の機構、ならびに生理的および病的状態における血管および非血管肺細胞間の相互作用を探索することを可能にする。 1）マトリゲルは臨床応用には適していないので。 2）Eゲルをキャストするために使用ラスチック金型は、ヒドロゲルおよびホスト肺組織との間の相互作用に影響を与える可能性があり、3）肺弾性モールドは、潜在的に、より臨床的に関連するアプローチ、血管新生因子を含む3次元フィブリンマトリックスとして、呼吸中に肺機能および疼痛障害を引き起こす（血管内皮増殖因子（VEGF）/塩基性線維芽細胞増殖因子（bFGF））、弾性モールドに鋳造することなく、マウス肺に移植された、成功したホスト肺由来の血管新生を要約されている。フィブリンゲル、トロンビン切断されたフィブリノゲンから生成されたポリマー原線維は、トラップする生体 40,41 で血管新生を促進させるようなbFGFおよびVEGFなどの血管新生因子の様々な知られている。 、その再生能力及び生分解性の性質42、フィブリンゲルが広く組織工学の分野で用いられている。 この記事では、生きているADULの肺の表面にフィブリンゲルを注入する新規かつユニークなアプローチを紹介しますトンマウスとホスト肺由来の血管新生は、in vivoでのゲルの内部に要約されていることを示している。肺特異的血管形成を研究するための研究を可能にし、この方法は、可能性肺疾患の様々なタイプの新しい治療アプローチの開発につながると有意に正常成体肺を再生する取り組みを進めます。

<table><tbody><tr><td>Fibrinogen from human placenta</td><td>Sigma</td><td>F4883</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Thrombin from bovine plasma</td><td>Sigma</td><td>T9549</td><td>For fabrication of fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse VEGF 164</td><td>R&amp;amp;D</td><td>493-MV</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Recombinant mouse bFGF</td><td>R&amp;amp;D</td><td>3139-FB</td><td>For supplementation to fibrin gel</td></tr><tr><td>Rodent Intubation Stand</td><td>Braintree Scientific INC</td><td>RIS 100</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>Fiber-Optic Light Source</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-35</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>21 G Elastic catheter</td><td>B.Braun</td><td>4251652-02</td><td>For intubation</td></tr><tr><td>MiniVent Ventilator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>CGS-8009</td><td>For ventilation</td></tr><tr><td>Stemi DV4 Steromicroscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-070-515</td><td>For surgey</td></tr><tr><td>Absobable suture</td><td>Ethicon</td><td>PDP304</td><td>Surgical suture</td></tr><tr><td>Antibody against CD31</td><td>BD Biosciences</td><td>553370</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against AQP5</td><td>Abcam</td><td>AB78486</td><td>Immunohistochemistry</td></tr><tr><td>Antibody against SP-B</td><td>Abcam</td><td>AB40876</td><td>Immunohistochemistry</td></tr></tbody></table>

implantation of fibrin gel on mouse lung to study lung-specific angiogenesis

幹細胞研究と生物工学技術の最近の重要な進歩は、再生し、整形外科や歯周分野のシンプルな組織における損傷を修復するために生体材料を利用することで大きな進歩を遂げている。臓器再生の生物学的プロセスはよく検討されていないので、肺などのより複雑な三次元（3D）の構造と機能を再生しようとする臓器は非常に成功していない。これは、血管新生は、新しい血管の形成は、臓器再生において重要な役割を果たしていることが明らかになってきている。新たに形成された血管系は、酸素、栄養素や臓器再生のために必要とされる様々な細胞成分を提供するだけでなく、再生地元の組織に有益な信号を提供するだけでなく。首尾成人肺を再生成するため、それは血管新生が局所肺組織の再生を駆動する肺特異的微小環境を再現することが必要である。共同もののnventional インビボでのそのようなヒドロゲル（ 例えば 、フィブリンまたはコラーゲンゲルまたはマトリゲル-エンゲルブレス-ホルム-スウォームマウス肉腫細胞によって分泌ECMタンパク質の混合物）がリッチ細胞外マトリックス（ECM）の皮下移植などの血管新生アッセイ、広く探求するために利用される肺における生体材料の同所移植のための方法は十分に確立されていないため、血管新生の一般的なメカニズムは、肺特異的血管新生は、十分に特徴付けられていない。このプロトコルの目的は、ゲル内部ホスト肺由来の血管新生の成功要約を可能に、生きている成体マウスの肺の表面にフィブリンゲルを注入するユニークな方法を導入することである。このアプローチは、肺特異的微小環境が正常および病的両方の条件で血管新生および肺胞の再生を制御するメカニズムを探求する研究者を可能にします。注入された生体材料のリリース以来隣接lの物理的および化学的な信号を供給し、長官組織、罹患肺におけるこれらの生体材料の注入は、潜在的に肺疾患の様々なタイプの新しい治療アプローチを開発するための研究を可能にする、隣接した病変組織を正常化することができる。

ホスト肺由来の血管形成は、肺に移植生体材料の中に要約されているかどうかを調べるために、主要な血管新生因子のVEGFおよびbFGF（0、10および100ng / mlの各）を補充したフィブリンゲルのように生きたマウスの肺の表面に移植したマトリゲル22を用いて報告した。 図1aに示すように、これらの血管新生増殖因子を含むフィブリンゲル47を作製した。開胸後、左肺表...

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Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis

Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.

肺特異的血管形成を研究するためにマウスの肺にフィブリンゲルの移植

Recent significant advances in stem cell research and bioengineering techniques have made great progress in utilizing biomaterials to regenerate and ...

implantation-fibrin-gel-on-mouse-lung-to-study-lung-specific

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

10.0K ビュー.  Boston Children's Hospital and Harvard Medical School. Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse. 

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Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of micrometastases by radiologic imaging and the success in their therapeutic eradication remain limited.
While animal models have proven to be invaluable tools for cancer research1, the monitoring/visualization of micrometastases remains a challenge and inaccurate evaluation of metastatic spread in preclinical studies potentially leads to disappointing results in clinical trials2. Consequently, there is great interest in refining the methods to finally allow reproducible and reliable detection of metastases down to the single cell level in normal tissue. The main focus therefore is on techniques, which allow the detection of tumor cells in vivo, like micro-computer tomography (micro-CT), positron emission tomography (PET), bioluminescence or fluorescence imaging3,4. We are currently optimizing these techniques for in vivo monitoring of primary tumor growth and metastasis in different osteosarcoma models. Some of these techniques can also be used for ex vivo analysis of metastasis beside classical methods like qPCR5, FACS6 or different types of histological staining. As a benchmark, we have established in the present study the stable transfection or transduction of tumor cells with the lacZ gene encoding the bacterial enzyme &beta;-galactosidase that metabolizes the chromogenic substrate 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside (X-Gal) to an insoluble indigo blue dye7 and allows highly sensitive and selective histochemical blue staining of tumor cells in mouse tissue ex vivo down to the single cell level as shown here. This is a low-cost and not equipment-intensive tool, which allows precise validation of metastasis8 in studies assessing new anticancer therapies9-11. A limiting factor of X-gal staining is the low contrast to e.g. blood-related red staining of well vascularized tissues. In lung tissue this problem can be solved by in-situ lung perfusion, a technique that was recently established by Borsig et al.12 who perfused the lungs of mice under anesthesia to clear them from blood and to fix and embed them in-situ under inflation through the trachea. This method prevents also the collapse of the lung and thereby maintains the morphology of functional lung alveoli, which improves the quality of the tissue for histological analysis. In the present study, we describe a new protocol, which takes advantage of a combination of X-gal staining of lacZ-expressing tumor cells and in-situ perfusion and fixation of lung tissue. This refined protocol allows high-sensitivity detection of single metastatic cells in the lung and enabled us in a recent study to detect "dormant" lung micrometastases in a mouse model13, which was originally described to be non-metastatic14.

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

The novel protocol reported in the present study allows selective detection of lung metastases at single cell resolution in mice by combined in-situ lung perfusion and fixation and X-Gal staining of lacZ-tagged tumor cells.

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上<em&gt;のin-situ</em肺組織とのX-gal染色の&gt;灌流<em&gt; lacZを</em&gt;タグ付き腫瘍細胞

Metastasis is the main cause of death in the majority of cancer types and consequently a main focus in cancer research. However, the detection of ...

医学

Programming Stem Cells for Therapeutic Angiogenesis Using Biodegradable Polymeric Nanoparticles

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, heart attack or peripheral arterial diseases. Direct delivery of angiogenic growth factors has the potential to stimulate new blood vessel growth, but is often associated with limitations such as lack of targeting and short half-life in vivo. Gene therapy offers an alternative approach by delivering genes encoding angiogenic factors, but often requires using virus, and is limited by safety concerns. Here we describe a recently developed strategy for stimulating vascular growth by programming stem cells to overexpress angiogenic factors in situ using biodegradable polymeric nanoparticles. Specifically our strategy utilized stem cells as delivery vehicles by taking advantage of their ability to migrate toward ischemic tissues in vivo. Using the optimized polymeric vectors, adipose-derived stem cells were modified to overexpress an angiogenic gene encoding vascular endothelial growth factor (VEGF). We described the processes for polymer synthesis, nanoparticle formation, transfecting stem cells in vitro, as well as methods for validating the efficacy of VEGF-expressing stem cells for promoting angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

We describe the method of programming stem cells to overexpress therapeutic factors for angiogenesis using biodegradable polymeric nanoparticles. Processes described include polymer synthesis, transfecting adipose-derived stem cells in vitro, and validating the efficacy of programmed stem cells to promote angiogenesis in a murine hindlimb ischemia model.

生分解性ポリマーナノ粒子を用いた治療的血管形成のためのプログラミング幹細胞

Controlled vascular growth is critical for successful tissue regeneration and wound healing, as well as for treating ischemic diseases such as stroke, ...

生物工学

Angiogenesis in the Ischemic Rat Lung

The adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that responds to a need for enhanced lung perfusion and shows robust neovascularization. Pulmonary vascular ischemia induced by pulmonary artery obstruction has been shown to result in rapid systemic arterial angiogenesis in man as well as in several animal models. Although the histologic assessment of the time course of bronchial artery proliferation in rats was carefully described by Weibel 1, mechanisms responsible for this organized growth of new vessels are not clear. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia in the rat that leads to bronchial neovascularization. Quantification of the extent of angiogenesis presents an additional challenge due to the presence of the two vascular beds within the lung. Methods to determine functional angiogenesis based on labeled microsphere injections are provided.

The lung is perfused by both the systemic bronchial artery and pulmonary arteries. In most lung pathologies, it is the smaller systemic vasculature that shows robust neovascularization. Cessation of pulmonary blood flow promotes brisk bronchial angiogenesis. We provide surgical details of inducing left pulmonary artery ischemia that promotes bronchial neovascularization.

虚血ラットの肺の血管新生

The  adult lung is perfused by both the systemic bronchial artery and the entire  venous return flowing through the pulmonary arteries. In most lung ...

A Permanent Window for Investigating Cancer Metastasis to the Lung

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as the bone, brain, and lung. Although extensively studied, the mechanistic details of this process remain poorly understood. While common imaging modalities, including computed tomography (CT), positron emission tomography (PET), and magnetic resonance imaging (MRI), offer varying degrees of gross visualization, each lacks the temporal and spatial resolution necessary to detect the dynamics of individual tumor cells. To address this, numerous techniques have been described for intravital imaging of common metastatic sites. Of these sites, the lung has proven especially challenging to access for intravital imaging owing to its delicacy and critical role in sustaining life. Although several approaches have previously been described for single-cell intravital imaging of the intact lung, all involve highly invasive and terminal procedures, limiting the maximum possible imaging duration to 6-12 h. Described here is an improved technique for the permanent implantation of a minimally invasive thoracic optical Window for High-Resolution Imaging of the Lung (WHRIL). Combined with an adapted approach to microcartography, the innovative optical window facilitates serial intravital imaging of the intact lung at single-cell resolution across multiple imaging sessions and spanning multiple weeks. Given the unprecedented duration of time over which imaging data can be gathered, the WHRIL can facilitate the accelerated discovery of the dynamic mechanisms underlying metastatic progression and numerous additional biologic processes within the lung.

Here, we present a protocol for the surgical implantation of a permanently indwelling optical window for the murine thorax, which enables high-resolution, intravital imaging of the lung. The permanence of the window makes it well-suited to the study of dynamic cellular processes in the lung, especially those that are slowly evolving, such as metastatic progression of disseminated tumor cells.

肺への癌転移を調査するための永久的な窓

Metastasis, accounting for ~90% of cancer-related mortality, involves the systemic spread of cancer cells from primary tumors to secondary sites such as ...

がん研究

Implantation of Inferior Vena Cava Interposition Graft in Mouse Model

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. The long-term clinical results showed excellent patency rates, however, with significant incidence of stenosis. To investigate the cellular and molecular mechanisms of vascular neotissue formation and prevent stenosis development in tissue engineered vascular grafts (TEVGs), we developed a mouse model of the graft with approximately 1 mm internal diameter. First, the TEVGs were assembled from biodegradable tubular scaffolds fabricated from a polyglycolic acid nonwoven felt mesh coated with &#949;-caprolactone and L-lactide copolymer. The scaffolds were then placed in a lyophilizer, vacuumed for 24 hr, and stored in a desiccator until cell seeding. Second, bone marrow was collected from donor mice and mononuclear cells were isolated by density gradient centrifugation. Third, approximately one million cells were seeded on a scaffold and incubated O/N. Finally, the seeded scaffolds were then implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. The implanted grafts demonstrated excellent patency (&#62;90%) without evidence of thromboembolic complications or aneurysmal formation. This murine model will aid us in understanding and quantifying the cellular and molecular mechanisms of neotissue formation in the TEVG.

To improve our knowledge of cellular and molecular neotissue formation, a murine model of the TEVG was recently developed. The grafts were implanted as infrarenal vena cava interposition grafts in C57BL/6 mice. This model achieves similar results to those achieved in our clinical investigation, but over a far shortened time-course.

マウスモデルにおける下大静脈介在移植の移植

Biodegradable scaffolds seeded with bone marrow mononuclear cells (BMCs) are often used for reconstructive surgery to treat congenital cardiac anomalies. ...

A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which causes significant deterioration in lung function and subsequent death from respiratory failure.
The pathogenesis of IPF in experimental animal models has been induced by bleomycin administration. In this study, we investigate an IPF-like mouse model induced by a double intratracheal bleomycin instillation. Standard histological assessments used for studying lung fibrosis are invasive terminal procedures. The goal of this work is to monitor lung fibrosis through noninvasive imaging techniques such as Fluorescent Molecular Tomography (FMT) and Micro-CT. These two technologies validated with histology findings could represent a revolutionary functional approach for real time non-invasive monitoring of IPF disease severity and progression. The fusion of different approaches represents a step further for understanding the IPF disease, where the molecular events occurring in a pathological condition can be observed with FMT and the subsequent anatomical changes can be monitored by Micro-CT.

We describe a non-invasive multimodal imaging approach based on Micro-CT and fluorescence molecular tomography for longitudinal assessment of the mouse lung fibrosis model induced by double intratracheal instillation of bleomycin.

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチ モーダル イメージング手法

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a fatal lung disease characterized by the progressive and irreversible destruction of lung architecture, which ...

免疫・感染学

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

ブレオマイシンの気管内注射によるマウス肺損傷の誘導

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...

Pre-Conditioning the Airways of Mice with Bleomycin Increases the Efficiency of Orthotopic Lung Cancer Cell Engraftment

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of thoracic malignancies, additional animal models that can recapitulate diverse human lung cancer subtypes and stages are needed. Allograft or xenograft models are versatile and enable the quantification of tumorigenic capacity in vivo, using malignant cells of either murine or human origin. However, previously described methods of lung cancer cell engraftment have been performed in non-physiological sites, such as the flank of mice, due to the inefficiency of orthotopic transplantation of cells into the lungs. In this study, we describe a method to enhance orthotopic lung cancer cell engraftment by pre-conditioning the airways of mice with the fibrosis inducing agent bleomycin. As a proof-of-concept experiment, we applied this approach to engraft tumor cells of the lung adenocarcinoma subtype, obtained from either mouse or human sources, into various strains of mice. We demonstrate that injuring the airways with bleomycin prior to tumor cell injection increases the engraftment of tumor cells from 0-17% to 71-100%. Significantly, this method enhanced lung tumor incidence and subsequent outgrowth using different models and mouse strains. In addition, engrafted lung cancer cells disseminate from the lungs into relevant distant organs. Thus, we provide a protocol that can be used to establish and maintain new orthotopic models of lung cancer with limiting amounts of cells or biospecimen and to quantitatively assess the tumorigenic capacity of lung cancer cells in physiologically relevant settings.

We describe a method to significantly enhance orthotopic engraftment of lung cancer cells into the murine lungs by pre-conditioning the airways with injury. This approach may also be applied to study stromal interactions within the lung microenvironment, metastatic dissemination, lung cancer co-morbidities, and to more efficiently generate patient derived xenografts.

同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

Lung cancer is a deadly treatment refractory disease that is biologically heterogeneous. To understand and effectively treat the full clinical spectrum of ...

Direct Intrabronchial Administration to Improve the Selective Agent Deposition Within the Mouse Lung

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.&#160; However, distribution of intratracheally-administered agents to the distal mouse lung is often asymmetric, with lung parenchymal concentrations increased in the smaller (but equally accessible) left lung of the mouse.&#160; Described in this report is a novel intrabronchial (IB) approach to cannulate the left and/or right lungs of living mice non-operatively.&#160; It is also demonstrated how this approach can be used to selectively administer agents to one lung or adapted (via dose-adjusted IB delivery) to improve the left-right symmetry of lung delivery of experimental agents, thereby improving models of diffuse lung disease such as bleomycin-induced pulmonary fibrosis.

Intratracheal (IT) administration of experimental agents in mice often results in asymmetric delivery to the distal lungs.&#160; In this report, we describe a direct intrabronchial (IB) approach to cannulate each lung in living mice non-operatively.&#160; This approach can be used to selectively administer agents to one lung or may be adapted to improve the symmetric agent delivery to both lungs.

マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与

Intratracheal (IT) administration of experimental agents is an essential technique in murine models of diffuse lung diseases, such as bleomycin-induced ...

Transplantation of Bioengineered Lung Using Decellularized Mouse Lungs and Primary Human Endothelial Cells

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor shortages and posttransplant complications persist. Bioengineered lungs, integrating patient-specific cells into decellularized animal scaffolds, present a promising alternative. Despite progress in using bioengineered lungs in animal models, functionality and structure remain immature. This protocol addresses a critical barrier in organ bioengineering: the need for a cost-effective experimental platform. By using mouse models instead of larger animals like rats or swine, researchers can significantly reduce the resources required for each experiment, accelerating research progress. 
The protocol outlines a detailed procedure for lung bioengineering using mouse heart-lung blocks and human primary cells, focusing on isolation strategy for the mouse heart-lung block, decellularization, bioreactor setup, perfusion-based organ culture, and orthotopic transplantation of bioengineered lungs. This mouse-scale platform not only reduces experimental costs but also provides a viable framework for optimizing cell types and numbers for recellularization, testing different cell types using histological and molecular methods, and ensuring blood flow post-transplantation. The method holds potential for broad applications, including studying cell interactions in three-dimensional culture conditions, cell-matrix interactions, and ex vivo cancer modeling, thereby advancing the field of organ bioengineering.

This paper describes how to create bioengineered mouse lungs using decellularization and recellularization methods. It also details subsequent orthotopic lung transplantation.

脱細胞化マウス肺と初代ヒト内皮細胞を用いた生体工学的肺移植

Lung transplantation is a critical treatment for patients with end-stage lung diseases like idiopathic pulmonary fibrosis, but challenges such as donor ...

肺特異的血管形成を研究するためにマウスの肺にフィブリンゲルの移植

要約

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この動画の章

組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上

生分解性ポリマーナノ粒子を用いた治療的血管形成のためのプログラミング幹細胞

虚血ラットの肺の血管新生

肺への癌転移を調査するための永久的な窓

マウスモデルにおける下大静脈介在移植の移植

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチモーダルイメージング手法

ブレオマイシンの気管内注射によるマウス肺損傷の誘導

同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与

脱細胞化マウス肺と初代ヒト内皮細胞を用いた生体工学的肺移植

肺特異的血管形成を研究するためにマウスの肺にフィブリンゲルの移植

要約

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組み合わせによるマウスのシングルセル解像度で肺転移の可視化の向上

生分解性ポリマーナノ粒子を用いた治療的血管形成のためのプログラミング幹細胞

虚血ラットの肺の血管新生

肺への癌転移を調査するための永久的な窓

マウスモデルにおける下大静脈介在移植の移植

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチ モーダル イメージング手法

ブレオマイシンの気管内注射によるマウス肺損傷の誘導

同所性同種肺がん細胞生着の効率を高めるブレオマイシンとマウスの気道をプレコンディショニング

マウス肺内の選択的剤沈着を改善するための直接気管支内投与

脱細胞化マウス肺と初代ヒト内皮細胞を用いた生体工学的肺移植

マウスにおけるブレオマイシン誘発肺線維症の縦断的評価マイクロ CT と蛍光分子トモグラフィーに基づくマルチモーダルイメージング手法