Name: rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish
Uploaded: 2014-08-19T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 54 s
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この作品は、NIHの助成金R00 CA160574（SFB）でと（SMM）はラトガースバイオテクノロジートレーニングプログラムの交わりによってサポートされています。

この手順は、ラトガース、ニュージャージー州の州立大学で動物実験委員会によって承認された。マウスは、実験動物の管理と使用に関するNI​​Hガイドに従って処理した。科学者たちは、確立され、承認されたガイドラインについては、彼らの国や機関投資家、動物の組織に相談してください。 開始前に、 表1に列挙溶液を調製する。 1 B細胞の単離とアクティベーション頸椎脱臼に続いてCO 2を使用して、マウスを安楽死させる。体の左側がアップしているので、マウスを置き、毛皮が湿っているまで、70％エタノールでマウスをスプレー。 2mLの洗浄緩衝液で35mm組織培養皿に脾臓および場所を解剖。層流フードでは、静かに5ミリリットルの注射器の平らな先端を使って組織培養皿に脾臓を壊す。 <ol><li> 50に70μmのナイロンメッシュを挿入mlチューブとナイロンメッシュに2ミリリットルの洗浄緩衝液で脾臓サンプルを転送する。静かにシリンジの平らな端を使用してメッシュに脾臓を混乱させる。 </li><li> 70μmのナイロンメッシュを通して洗浄バッファーとフィルタ8mlで注射器の背面に35mmのプレートをすすぐ。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。 </li><li>吸引し、上清を廃棄し、ACK溶解バッファー3mlにペレットを再懸濁します。塊を破壊し、5分間インキュベートするようにピペット上下簡潔に。 4℃で10分間300×gでの洗浄緩衝液および遠心の10ミリリットルを追加します。 </li><li>吸引し、上清を廃棄し、洗浄緩衝液1ミリリットル中にピペット操作により、次にチューブの底をタップしてペレットを再懸濁すること。抗CD43 MACSマイクロビーズを50μlを加え、30分間氷上でインキュベートする。 4℃で10分間300×gで、洗浄緩衝液10ミリリットルを追加し、穏やかに混合し、遠心。 4℃で10分間300×gで、洗浄緩衝液10ミリリットルを追加し、穏やかに混合し、遠心。 </li><li>セットアップするMACS磁石に列を配置することによってミニMACSカラム。コラム下のラベル15ミリリットルコニカルチューブを配置します。カラムに洗浄緩衝液1ミリリットルを加え、15 mlチューブに通すことができます。 </li><li>洗浄バッファー1mlに再懸濁上清を吸引。洗浄バッファーが通過実行された後、列にサンプルをロードします。 </li><li>試料がカラムに流した後、カラムを洗浄する1ミリリットルの洗浄緩衝液を加える。 15mlチューブにおける収集されたサンプルを直接洗浄バッファー7mlのを追加します。 </li><li>血球計数器を用いて細胞を数える。 50ミリリットルチューブに/ウェル500万細胞のために必要な細胞の必要量を転送します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。 500およびIL4 1：LPS 1サプリメントB細胞培地1,000 </li><li>上清を吸引1,000,000細胞/ mlの最終濃度のために必要な補充したB細胞培地の適切なボリュームを追加する。 </li><li> humidifi 1,000,000細胞/ mlの場所で細胞を5 mlの6ウェルプレート中の細胞をプレート37°C、5％CO 2での細胞培養インキュベーターエド。 </li></ol> 2のB細胞固定<ol><li>ウエル（100 ngの/ mlの最終濃度のために）B細胞の5ミリリットルを含有し、37℃で1時間インキュベートするコルセミドを50μl加える。 37℃の水浴中でPrewarm 75mMのKCl溶液。ラベルされた15mlチューブにB細胞を移す。 4℃で10分間300×gでテープと遠心分離機を持つラベルをカバー。 </li><li>チューブ内の1ミリリットルを残して上清を吸引し、ピペッティングによりペレットを再懸濁。タッピングあるいはボルテックスに脈動しながら降下によって予め温め塩化カリウム降下の5ミリリットルを追加します。 </li><li> KClを10ミリリットルを加え、転倒混和する。 15分間37℃の水浴中でインキュベートする。反転させ、新鮮な固定液とミックスの5滴を追加します。 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。ピペッティングによりチューブ再懸濁ペレット中の1ミリリットルを残して上清を吸引。 </li><li> VORをタップまたは脈動しながら降下によって新鮮な固定降下の5ミリリットルを追加します。TEX。固定液をさらに10 mlを加え、室温で30分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で10分間、300×gで遠心分離します。ピペッティングによりチューブに再懸濁に1ミリリットルを残して上清を吸引。 4℃で10分間300×gで、新鮮な固定液と遠心の14ミリリットルを追加します。 </li><li>繰り返し手順2.7倍以上である。 </li><li>新鮮な固定液14ミリリットルを追加します。パラフィルムでキャップを密封し、-20℃で一晩保管してください。 </li></ol>中期染色体スプレッドの調製<ol><li> 22.9℃、52％の湿度に調整された環境室を設定します。 </li><li>遠心分離し、4℃で10分間300×gでB細胞を固定。吸引し固定液は、ピペッティングによりチューブに再懸濁に70μLを残す。 </li><li> 35°の角度で湿度室中の標識スライドを配置します。スライド上に再懸濁したB細胞の35μlのを削除し、サンプルあたり2スライドをドロップします。その後、スライドを保存するスライドは30分間湿度室で乾燥することができます37℃でスライドボックス中。 </li></ol> 4。テロメアのPNA FISH <ol><li>プローブの調製<ol><li> 37℃に予備温脱イオンホルムアミド。 7μlの脱イオン予め温めホルムアミドとテロメアPNAプローブ2μlのを混合し、1時間振とうしながら37℃でインキュベートする。 </li><li> 37℃に予備暖かいFISHマスターミックス。ステップ4.1.1からの混合物に7μlを予め温めFISHマスターミックスを追加し、1〜3時間、37℃でインキュベートする。 </li><li> 80℃で8分間のプローブ混合物を変性させる。 37°Cで1時間プローブをあらかじめアニールする。 </li></ol></li><li>染色体スライドの前処理<ol><li>水浴中で37℃に0.01 MのHClを50mlの入ったガラス製スライド染色ジャーを予め温める。 </li><li>室温で5分間、2×SSCを含む別のスライドガラス染色ジャー内の場所スライド。 </li><li>予め温めたスライドガラス染色ジャーにペプシン株式の2μLを加え転倒混和する。このガラスSLにスライドを移し、IDE-染色ジャー、37℃で90秒間インキュベートする。 </li><li>スライドが揺れ、室温で5分間ずつ1×PBSを含む別のガラススライド染色ジャー中で2倍洗う。そして揺れ、室温で1×PBS / MgCl 2を 5分間スライドを洗浄します。 </li><li>室温で10分間、新たに調製した1％ホルムアルデヒド/ 1×PBS / MgCl 2を含むガラススライド染色ジャーにスライドを移す。 </li><li>揺れ、室温で1×PBSを含む別のガラススライド染色ジャー中で5分間スライドを洗浄する。 </li><li> 70％、90％、および100％エタノールを含有する別個のスライドガラス染色ジャーを有することにより、エタノール脱水シリーズを調製する。 </li><li>その後、70％エタノール、90％エタノール、次いで100％エタノールから出発し、3分間、各ジャーにスライドを移す。終了したら、-20℃でのエタノールの瓶を置きます。 </li><li>ペーパータオルの上に過剰のエタノールをタップし、35°の角度でスライドを支えて空気の乾燥にスライドを許可します。乾燥したら、マダイヤモンドペンを使用して、スライドの背面にあるハイブリダイゼーションのために18×18ミリメートルの領域をRK。 </li></ol></li><li> FISH用のスライドの変性<ol><li> 24×60ミリメートルのカバースリップに120μlの70％脱イオン化ホルムアミド/ 2×SSCを適用します。カバーガラススライドをタッチします。 90秒間、ホットプレート上で80℃でスライドを変性さ。 </li><li>迅速かつ丁寧にカバースリップをオフにスライドさせ、90％エタノールに続いて3分間の氷冷70％エタノール、および3分間、100％エタノール各スライドに配置します。スライドを空気乾燥させます。 </li><li>タイトな蓋とウェットティッシュペーパーでプラスチックの箱を並べて湿潤チャンバーを準備します。論文は湿ってもよいが、水で飽和しないようにしてください。 </li><li>湿度の高い室では、18×18ミリメートルのカバースリップでカバーし、1時間、37℃でインキュベート、スライド上のマークされた領域へのステップ4.1.3からプレアニールプローブミックスを適用します。 </li></ol></li><li>ポストインキュベーションウォッシュ<ol><li>前の温かい50％ホルムアミド/ 2×SSC、1×SSC、および4×SSC / 0.1％Tween-20を45°における; Cの水浴。 </li><li>慎重にカバースリップを除去し、暗いし、振盪に予め温めておいた50％ホルムアミド/ 2×SSC 3xfor 5分で、それぞれのスライドを洗う。揺れ、予め温めた1×SSC 3xfor 5分ごとにスライドを洗浄します。最後に、予め温めておいた4×SSC中でスライドを洗浄/ 0.1％のTween-20 3xfor 5分の各。 </li><li>光保護されたガラススライド染色ジャー中DAPIでの3分間のスライドを染色する。 </li><li>揺れ、2×SSC中で5分間スライドを洗浄する。 24×60ミリメートルのカバースリップで覆い、モヴィオール封入剤35μlのを適用し、4℃でスライドを保存します。 </li></ol></li></ol>染色体の顕微鏡分析5。 <ol><li>標準落射蛍光顕微鏡を用いて中期スライドを分析します。最良の結果を得るために、そのようなメタシステムMetaferプラットフォームとして自動化されたステージとイメージングプラットフォームを使用してください。テロメアpから各中期スプレッドは、染色体を可視化するためにDAPI蛍光のために一つの画像を収集し、蛍光シグナルのための一つの画像ローブ。 （ 例えば 、Cy3標識他の蛍光体が利用可能であり、同様に良好に動作します。） </li><li>画像解析プログラムで画像をオーバーレイして分析する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+mammalian+DNA+repair+and+the+DNA+damage+checkpoints.">Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints.</a> Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).</li><li>Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+damage+checkpoints+in+stem+cells,+ageing+and+cancer.">DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer.</a> Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).</li><li>Alexandrov, L. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signatures+of+mutational+processes+in+human+cancer.">Signatures of mutational processes in human cancer.</a> Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).</li><li>Bunting, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+inhibits+homologous+recombination+in+Brca1-deficient+cells+by+blocking+resection+of+DNA+breaks.">53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks.</a> Cell. 141 (2), 243-254 (2010).</li><li>Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spectral+karyotyping+analysis+of+human+and+mouse+chromosomes.">Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).</li><li>Callen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chimeric+IgH-TCRalpha/delta+translocations+in+T+lymphocytes+mediated+by+RAG.">Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG.</a> Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).</li><li>Boboila, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+end-joining+catalyzes+robust+IgH+locus+deletions+and+translocations+in+the+combined+absence+of+ligase+4+and+Ku70.">Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70.</a> Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).</li><li>Benn, P., Delach, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+lymphocyte+culture+and+chromosome+analysis.">Human lymphocyte culture and chromosome analysis.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).</li><li>Nguyen, H. 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Unit 18 14, (2001).</li><li>Morales, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+and+p53+synergize+to+suppress+genomic+instability+and+lymphomagenesis.">53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).</li><li>Halaby, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+interaction+of+Rnf8+and+p53+in+the+protection+against+genomic+instability+and+tumorigenesis.">Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).</li></ol>

著者らは、競合する利害を有していない。

一方、活性化Bリンパ球は、他の細胞型も使用することができ、有糸分裂染色体スプレッドの調製に特に適している。 Tリンパ球は脾臓またはリンパ節から精製することができるように、B細胞の利点の多くを共有し、そして適切なマイトジェン8を含む培地中での増殖によって刺激された場合、高い有糸分裂指数を有する。胚性幹細胞（ES細胞）は、中期染色体分析9に適してい?...

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.&#160;Table 1 (the list of solutions to prepare) was omitted from the Protocol section. The contents of Table 1 are as follows:
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Solution</td>
			<td>Reagents</td>
			<td>Comments</td>
			<td>Storage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">B Cell Wash Buffer</td>
			<td>500 ml 1x Hanks Balanced Salt Solution</td>
			<td rowspan="3">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="3">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="8">B Cell Medium</td>
			<td>418.5 ml RPMI-1640</td>
			<td rowspan="8">Filter through 0.22 &#956;m stericup filtration unit</td>
			<td rowspan="8">4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml 50 &#176;C heat inactivated FCS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 100x Pen/Strep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml glutamine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml nonessential amino acids</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.8 ml 14.2 M 2-mercaptoethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 ml 1M HEPES</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fixative</td>
			<td>3:1 v/v methanol/glacial acetic acid</td>
			<td></td>
			<td>Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.075 M KCl</td>
			<td>1.395 g KCl</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">FISH Master Mix</td>
			<td>40 ml 50% Dextran sulfate</td>
			<td rowspan="3">Vortex the solution and leave in a shaking platform overnight</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 ml sterile distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">70% Formamide/2x SSC</td>
			<td>10 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7 with 1M HCl</td>
			<td rowspan="3">Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 ml deionized formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">0.01 M HCl</td>
			<td>1 ml 1M HCl</td>
			<td rowspan="2">Adjust to pH 2.0</td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>99 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">1x PBS/MgCl2</td>
			<td>50 ml 1M MgCl2</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>950 ml 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">50% Formamide/2x SSC</td>
			<td>20 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3">Adjust to pH 7.25 
			Formamide used in this step does not have to be deionized.</td>
			<td rowspan="3">Make fresh</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>80 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml formamide</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="3">4x SSC/0.1% Tween20</td>
			<td>50 ml 20x SSC</td>
			<td rowspan="3"></td>
			<td rowspan="3">Room Temperature</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250 &#956;l Tween20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">DAPI staining solution (80 ng/ml)</td>
			<td>40 &#956;l 0.2mg/ml DAPI stock</td>
			<td rowspan="2"></td>
			<td rowspan="2">4 &#176;C in light protected staining jar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100 ml 2x SSC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="5">Mowiol Mounting Medium</td>
			<td>6 g glycerol</td>
			<td rowspan="5">Incubate at 50 &#176;C with stirring for 2hrs</td>
			<td rowspan="5">Aliquot and store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2.4 g Mowiol 4-88</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 ml distilled H2O</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>12 ml 0.2 M TrisCl pH 8.5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>230 &#956;l 1% Thimerosal (w/v in water)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Table 1. List of solutions.&#160;

A correction was made to: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH.

Erratum: Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

癌は、正常な細胞増殖を調節する遺伝子に影響を与える変異の蓄積によって引き起こされる。突然変異は、DNAの損傷によって引き起こされるゲノムの構造および配列の変化の結果である。 DNA損傷は、電離放射線のような外因性の薬剤を含む、プロセスのさまざまなを通して発生し、副生成物などのヌクレオチド塩基または反応性酸素種1との接触によって生じた損傷の自発的脱アミノ化などの通常の細胞代謝のようにすることができる。 哺乳動物の細胞がDNA損傷を逆転またはブレーク·サイトで順序を復元することができ、修復活動の範囲を有するが、変異は、それにもかかわらず、細胞の生涯を通じて蓄積する。 DNA損傷は、さらに、老化および老化関連疾患2に関連付けられた幹細胞を、2つの方法の効力の喪失に寄与することができる。 DNA損傷の修復を理解することは、2の符号に対処する上で、したがって、中央に重要である公衆衛生におけるificant問題。増加する証拠は、哺乳動物のDNA修復経路は、それが一層急務分子レベルでの突然変異の抑制に関与するプロセスを理解すること、癌細胞ゲノム3,4の進化に寄与し得ることを示唆している。 染色体異常の直接可視化は、特定の細胞型においてゲノム不安定性の程度を決定するための強力かつ定量的な手段である。分裂中期の細胞からの凝縮染色体を単離し、光または蛍光顕微鏡を用いて検査することができる。このような細胞遺伝学的アプローチは、数十年間実際にされており、転座またはDNA修復活性の喪失に関連する染色体異常の特定のタイプの外観を示すために使用することができる。プロトコルは、いくつかの潜在的な機能拡張に適しています：染色体は、in situハイブリダイゼーションスペクトル核型分析のためのプローブ（SKY）または多色の蛍光で標識することができる（mFISH）が転座5,6を識別します。これらの技術はまた、染色体転座の頻度と、このプロトコルで可能なものを超えて、追加情報を提供して決定することが、複雑な染色体転座の構造を、有効にします。代替的に、配列特異的なプローブが生成され、選択されたゲノム部位7においてDNA切断の頻度を試験するために用いることができる。 このプロトコルでは、中期染色体の調製は、Bリンパ球から広がる記述する。テロメア反復のための蛍光標識されたペプチド核酸（PNA）プローブを効率的に分裂中期染色体テロメアマークが使用されるが、このプロトコルはいくつかの利点を有する広がる。 B細胞は、高品質のスプレッドは一貫して製造することができるように、高い分裂指数で成長するように誘導することができる。遺伝的に改変されたマウス由来のB細胞は、はるかに少ない寄与度の分析を混乱させる可能な二遺伝的変異を含む可能性が高いゲノムの完全性の特異的な遺伝子。 PNA-FISH法は、1日で完了し、染色体切断のより正確なスコアリングを可能にすることができます。特に、このプロトコルに記載されている特定の装置と組み合わせて、このアプローチを用いることにより、非常に一貫した、高品質のスプレッドを生成し、急速に速度およびゲノム不安定性のタイプを分析することが可能である。

<table><tbody><tr><td>50% Dextran sulfate</td><td>Intergen</td><td>S4030</td><td></td></tr><tr><td>Deionized formamide</td><td>Ambion</td><td>9342</td><td></td></tr><tr><td>Pepsin (5 g)</td><td>Sigma</td><td>P 6887&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>Gemini</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>LPS (100 mg)</td><td>Sigma</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>IL-4 (5 &amp;mu;g)</td><td>Sigma</td><td>I1020</td><td></td></tr><tr><td>PNA Telomere Probe</td><td>PNA Bio Inc</td><td>F1002</td><td>(CCCTAACCCTAACCCTAA)</td></tr><tr><td>Colcemid</td><td>Roche</td><td>295892</td><td></td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma</td><td>81381-50g</td><td></td></tr><tr><td>CD43 (ly-48_) micro-beads</td><td>Miltenyl Biotec.</td><td>130-049-801</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>32670-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E800</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AxioImager.Z2</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber</td><td>Thermotron</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

rapid analysis of chromosome aberrations in mouse b lymphocytes by pna-fish

不良DNA修復は、腫瘍形成につながる変異の根本的な原因であるゲノム不安定性を増加につながる。異なる細胞型における染色体異常の頻度および種類の分析は、DNA修復経路に欠陥を解明することを可能にする。哺乳動物のDNA修復生物学を理解することは、大幅に特定の遺伝子におけるノックアウトとマウスの作製に助けられてきた。このプロトコルの目的は、マウスBリンパ球におけるゲノム不安定性を定量化することである。 PNA-FISHプローブ（ペプチド核酸-蛍光in situハイブリダイゼーション ）を使用してテロメアの標識は、中期染色体スプレッドのゲノム不安定性の迅速な分析を容易にします。彼らは、正常な倍数性及びより高い分裂指数を持っているので、B細胞は、線維芽細胞に対して特有の利点を有する。 B細胞の短期培養は、したがって、より少ない二次遺伝子突然変異を有する可能性がある一次細胞集団におけるゲノム不安定性の正確な測定を可能に一般的に変換された線維芽細胞または患者の細胞株に見られるものより秒。

一つの細胞から誘導された分裂中期染色体は、染色体40（マウス細胞を用いた場合）（ 図1A）を含む別個のクラスタを形成すべきである。各染色体は、水色の球として表示されている、一方の端部に動原体を持っています。正常な染色体では、2つのテロメア信号は、各セントロメアによって染色し、二つの信号の最後に見られる。間期核は同様に、スライド上に存在することに?...

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Rapid Analysis of Chromosome Aberrations in Mouse B Lymphocytes by PNA-FISH

DNA修復経路は、ゲノムの完全性の維持および変異および癌を予防するために必須である。このプロトコルの目的は、中期の染色体異常の直接観察によりゲノム不安定性を定量化することであるテロメアDNA反復のためのin situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光を使用して、マウスのB細胞から広がる。

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

Defective DNA repair leads to increased genomic instability, which is the root cause of mutations that lead to tumorigenesis. Analysis of the frequency ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

16.9K ビュー.  Rutgers, the State University of New Jersey.  DNA修復経路は、ゲノムの完全性の維持および変異および癌を予防するために必須である。このプロトコルの目的は、中期の染色体異常の直接観察によりゲノム不安定性を定量化することであるテロメアDNA反復のためのin situハイブリダイゼーション （FISH）、 蛍光を使用して、マウスのB細胞から広がる。 

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Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. To assess the impact of PM on nuclear genetic integrity, structural chromosomal aberrations are scored in the metaphase spreads of mouse RAW264.7 macrophage cells. PM is collected from ambient air with a high volume total suspended particles sampler. The collected material is solubilized and filtered to retain the water-soluble, fine portion. The particles are characterized for chemical composition by nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Different concentrations of particle suspension are added onto an in vitro culture of RAW264.7 mouse macrophages for a total exposure time of 72 hr, along with untreated control cells. At the end of exposure, the culture is treated with colcemid to arrest cells in metaphase. Cells are then harvested, treated with hypotonic solution, fixed in acetomethanol, dropped onto glass slides and finally stained with Giemsa solution. Slides are examined to assess the structural chromosomal aberrations (CAs) in metaphase spreads at 1,000X magnification using a bright-field microscope. 50 to 100 metaphase spread are scored for each treatment group. This technique is adapted for the detection of structural chromosomal aberrations (CAs), such as chromatid-type breaks, chromatid-type exchanges, acentric fragments, dicentric and ring chromosomes, double minutes, endoreduplication, and Robertsonian translocations in vitro after exposure to PM. It is a powerful method to associate a well-established cytogenetic endpoint to epigenetic alterations.

Analysis of the Ambient Particulate Matter-induced Chromosomal Aberrations Using an In Vitro System

This protocol describes techniques for the quantification and characterization of chromosomal aberrations in vitro in RAW264.7 mouse macrophages after treatment with ambient air particulate matter.

使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析<em&gt;インビトロ</em&gt;システム

Exposure to particulate matter (PM) is a major world health concern, which may damage various cellular components, including the nuclear genetic material. ...

遺伝学

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization (mFISH) and Spectral Karyotyping (SKY) in Irradiated Mice

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially compromised, can easily be identified by conventional chromosome staining techniques. However, detection of stable aberrations, which involve exchange or translocation of genetic materials without considerable modification in the chromosome morphology, requires sophisticated chromosome painting techniques that rely on in situ hybridization of fluorescently labeled DNA probes, a chromosome painting technique popularly known as fluorescence in situ hybridization (FISH). FISH probes can be specific for whole chromosome/s or precise sub-region on chromosome/s. The method not only allows visualization of stable aberrations, but it can also allow detection of the chromosome/s or specific DNA sequence/s involved in a particular aberration formation. A variety of chromosome painting techniques are available in cytogenetics; here two highly sensitive methods, multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY), are discussed to identify inter-chromosomal stable aberrations that form in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation. Although both techniques rely on fluorescent labeled DNA probes, the method of detection and the process of image acquisition of the fluorescent signals are different. These two techniques have been used in various research areas, such as radiation biology, cancer cytogenetics, retrospective radiation biodosimetry, clinical cytogenetics, evolutionary cytogenetics, and comparative cytogenetics.

Detection of Inter-chromosomal Stable Aberrations by Multiple Fluorescence In Situ Hybridization mFISH and Spectral Karyotyping SKY in Irradiated Mice

The present protocol describes the usefulness of multiple fluorescence in situ hybridization (mFISH) and spectral karyotyping (SKY) in identifying inter-chromosomal stable aberrations in the bone marrow cells of mice after exposure to total body irradiation.

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出<em&gt;その場で</em&gt;ハイブリダイゼーション（mFISH）と照射されたマウスにおけるスペクトル核型分析（SKY）

Ionizing radiation (IR) induces numerous stable and unstable chromosomal aberrations. Unstable aberrations, where chromosome morphology is substantially ...

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis 

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a cohort generated by assisted reproduction technology (ART). This selection may be required because of familial monogenic disease (e.g. cystic fibrosis), or because one partner carries a chromosome rearrangement (e.g. a two-way reciprocal translocation). PGD is available for couples who have had previous affected children, and/or in the case of chromosome rearrangements, recurrent miscarriages, or infertility. Oocytes aspirated following ovarian stimulation are fertilized by in vitro immersion in semen (IVF) or by intracytoplasmic injection of an individual spermatozoon (ICSI). Pre-implantation cleavage-stage embryos are biopsied, usually by the removal of a single cell on day 3 post-fertilization, and the biopsied cell is tested to establish the genetic status of the embryo. Fluorescence in situ hybridization (FISH) on the fixed nuclei of biopsied cells with target-specific DNA probes is the technique of choice to detect chromosome imbalance associated with chromosome rearrangements, and to select female embryos in families with X-linked disease for which there is no mutation-specific test. FISH has also been used to screen embryos for spontaneous chromosome aneuploidy (also known as PGS or PGD-AS) in order to try and improve the efficiency of assisted reproduction; however, the predictive value of this test using the spreading and FISH technique described here is likely to be unacceptably low in most people's hands and it is not recommended for routine clinical use. We describe the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to PGD in a clinical setting.

FISH for Pre-implantation Genetic Diagnosis

This article describes the selection of suitable probes for single-cell FISH, spreading techniques for blastomere nuclei, and in situ hybridization and signal scoring, applied to pre-implantation genetic diagnosis (PGD) in a clinical setting.

着床前遺伝子診断のためのFISH

Pre-implantation genetic diagnosis (PGD) is an established alternative to pre-natal diagnosis, and involves selecting pre-implantation embryos from a ...

医学

Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding the chromosome events that take place during meiotic prophase, including the pairing, synapsis, and recombination events that ensure proper chromosome segregation. While the mouse has been an important model for understanding the molecular mechanisms underlying these processes, not all meiotic events in this system are analogous to human meiosis. We recently demonstrated the exciting potential of the zebrafish as a model of human spermatogenesis. Here we describe, in detail, our methods to visualize meiotic chromosomes and associated proteins in chromosome spread preparations. These preparations have the advantage of allowing high resolution analysis of chromosome structures. First, we describe the procedure for dissecting testes from adult zebrafish, followed by cell dissociation, lysis, and spreading of the chromosomes. Next, we describe the procedure for detecting the localization of meiotic chromosome proteins, by immunofluorescence detection, and nucleic acid sequences, by fluorescence in situ hybridization (FISH). These techniques comprise a useful set of tools for the cytological analysis of meiotic chromatin architecture in the zebrafish system. Researchers in the zebrafish community should be able to quickly master these techniques and incorporate them into their standard analyses of reproductive function.

Nuclear surface spreads are an indispensable tool for studying chromosome events during meiosis. Here we demonstrate a method to prepare and visualize meiotic chromosomes during prophase I from zebrafish spermatocytes.

ゼブラフィッシュの精子細胞からのマイオサイト染色体の広がりの調製

Meiosis is the key cellular process required to create haploid gametes for sexual reproduction. Model organisms have been instrumental in understanding ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

神経芽細胞腫転移のゼブラフィッシュモデル

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

がん研究

Chromosomics: Detection of Numerical and Structural Alterations in All 24 Human Chromosomes Simultaneously Using a Novel OctoChrome FISH Assay

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell nuclei1. The technique uses DNA probes with unique sequences that hybridize to whole chromosomes or specific chromosomal regions, and serves as a powerful adjunct to classic cytogenetics. For instance, many earlier studies reported the frequent detection of increased chromosome aberrations in leukemia patients related with benzene exposure, benzene-poisoning patients, and healthy workers exposed to benzene, using classic cytogenetic analysis2. Using FISH, leukemia-specific chromosomal alterations have been observed to be elevated in apparently healthy workers exposed to benzene3-6, indicating the critical roles of cytogentic changes in benzene-induced leukemogenesis. 
Generally, a single FISH assay examines only one or a few whole chromosomes or specific loci per slide, so multiple hybridizations need to be conducted on multiple slides to cover all of the human chromosomes. Spectral karyotyping (SKY) allows visualization of the whole genome simultaneously, but the requirement for special software and equipment limits its application7. Here, we describe a novel FISH assay, OctoChrome-FISH, which can be applied for Chromosomics, which we define here as the simultaneous analysis of all 24 human chromosomes on one slide in human studies, such as chromosome-wide aneuploidy study (CWAS)8. The basis of the method, marketed by Cytocell as the Chromoprobe Multiprobe System, is an OctoChrome device that is divided into 8 squares, each of which carries three different whole chromosome painting probes (Figure 1). Each of the three probes is directly labeled with a different colored fluorophore, green (FITC), red (Texas Red), and blue (Coumarin). The arrangement of chromosome combinations on the OctoChrome device has been designed to facilitate the identification of the non-random structural chromosome alterations (translocations) found in the most common leukemias and lymphomas, for instance t(9;22), t(15;17), t(8;21), t(14;18)9. Moreover, numerical changes (aneuploidy) in chromosomes can be detected concurrently. The corresponding template slide is also divided into 8 squares onto which metaphase spreads are bound (Figure 2), and is positioned over the OctoChrome device. The probes and target DNA are denatured at high-temperature and hybridized in a humid chamber, and then all 24 human chromosomes can be visualized simultaneously. 
OctoChrome FISH is a promising technique for the clinical diagnosis of leukemia and lymphoma and for detection of aneuploidies in all chromosomes. We have applied this new Chromosomic approach in a CWAS study of benzene-exposed Chinese workers8,10.

A novel fluorescence in situ hybridization (FISH) method that simultaneously examines both numerical and structural chromosome alterations, particularly the specific chromosomal translocations associated with leukemia and lymphoma, of all 24 human chromosomes on a single device in one hybridization, is described.

Chromosomics：同時に新規OctoChrome FISHアッセイを使用した全24ヒト染色体における数値と構造変化の検出

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a technique that allows specific DNA sequences to be detected on metaphase or interphase chromosomes in cell ...

生物学

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

3D原子力組織の変化を研究するために3D保存状態間期核に組み合わさ免疫やDNA FISH

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Analysis of Somatic Hypermutation in the JH4 intron of Germinal Center B cells from Mouse Peyer's Patches

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the variable coding exons of the Ig heavy and light chain gene loci. This process of somatic hypermutation (SHM) requires the enzyme activation-induced cytidine deaminase (AID), which converts deoxycytidines (C), into deoxyuridines (U). Processing the AID-generated U:G mismatches into mutations by the base excision and mismatch repair pathways introduces new Ig coding sequences that may produce a higher affinity Ig. Mutations in AID or DNA repair genes can block or significantly alter the types of mutations observed in the Ig loci. We describe a protocol to quantify JH4 intron mutations that uses fluorescence activated cell sorting (FACS), PCR, and Sanger sequencing. Although this assay does not directly measure Ig affinity maturation, it is indicative of mutations in Ig variable coding sequences. Additionally, these methods utilize common molecular biology techniques which&#160;analyze&#160;mutations in Ig sequences of multiple B cell clones. Thus, this assay is an invaluable tool in the study of SHM and Ig diversification.

Presented here is an assay to quantify somatic hypermutation within the immunoglobulin heavy chain gene locus using germinal center B cells from mouse Peyer&#8217;s patches.

マウスペイヤーパッチからの胚芽センターB細胞のJH4イントロンにおける体細胞ハイパー突然変異の解析

Within the germinal centers of lymphoid organs, mature B cells alter their expressed immunoglobulin (Ig) by introducing untemplated mutations into the ...

免疫・感染学

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

直接標識プローブを用いた堅牢な3DのDNA FISH

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and T lymphocytes. Studies of zebrafish lymphopoiesis are difficult because antibodies recognizing D. rerio cell surface markers are generally not available, complicating isolation and characterization of different lymphocyte populations, including B-lineage cells. Transgenic lines with lineage-specific fluorophore expression are often used to circumvent this challenge. The transgenic lck:eGFP line has been used to study D. rerio T cell development, and has also been utilized to model T cell development and acute lymphoblastic leukemia (T-ALL). Although lck:eGFP fish have been widely used to analyze the T-lineage, they have not been used to study B cells. Recently, we discovered that many zebrafish B cells also express lck, albeit at lower levels. Consequently, lck:eGFP B cells likewise express low levels of GFP. Based on this finding, we developed a protocol to purify B-lineage cells from lck:eGFP zebrafish, which we report here. Our method describes how to utilize a fluorescent-activated cell sorter (FACS) to purify B cells from lck:eGFP fish or related lines, such as double-transgenic rag2:hMYC; lck:eGFP fish. In these lines, B cells, particularly immature B cells, express GFP at low but detectable levels, allowing them to be distinguished from T cells, which express GFP highly. B cells can be isolated from marrow, thymus, spleen, blood, or other tissues. This protocol provides a new method to purify D. rerio B cells, enabling studies focused on topics like B cell development and B lymphocyte malignancies.

Isolating Malignant and Non-Malignant B Cells from lck:eGFP Zebrafish

Transgenic lck:eGFP zebrafish express GFP highly in T lymphocytes, and have been used to study T cell development and acute lymphoblastic leukemia. This line can be used to study B cells, which express lck at lower levels. This protocol describes purification of malignant and non-malignant B cells from lck:eGFP zebrafish.

Lck:eGFPゼブラフィッシュから悪性と非悪性 B 細胞を分離すること

Zebrafish (Danio rerio) are a powerful model to study lymphocyte development. Like mammals, D. rerio possess an adaptive immune system that includes B and ...

PNA-FISHによるマウスのBリンパ球における染色体異常の迅速分析

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使用周囲粒子状物質によって誘発される染色体異常の解析

複数の蛍光によるインター染色体安定型異常の検出