この研究は、国立心臓、肺、血液研究所グラントHL-103542、およびCAPにBCH麻酔研究財団の識別トレイルブレイザー賞によってサポートされていました。

準備<ol><li> 1 M K-HEPES原液を（KOHでpHを7.2に調整）を準備します。 </li><li> 0.5 M K-EGTAストック溶液を（KOHで8.0にpHを調整）を準備します。 </li><li> 1MのKH 2 PO 4原液を準備します。 </li><li> 1 MのMgCl 2ストック溶液を準備します。 </li><li>均質化緩衝液（pH7.2）300 mMスクロース、10 mMのK-HEPES、および1mM K-EGTAを準備します。 4℃で保存。 </li><li>呼吸バッファー250mMスクロースを調製2mMのKH 2 PO 4、10mMのMgCl 2、20mMのK-HEPES緩衝液（pH7.2）及び0.5mMのK-EGTA液（pH8.0）。 4℃で保存。 </li><li> 1リットル中に再蒸留H 2 O（pH7.4）中のNaCl 80グラムのKCl 2グラムのNa 2 HPO 4 14.4gの、およびKH 2 PO 4 2.4gの溶解して10倍のPBS原液を準備します。 </li><li> 1リットル中に100ミリリットル10倍のPBSをピペットによって1×PBSを準備し、二重蒸留H 2 O </li><li>ズブチリシンA 4mgの中を計量することによりサブチリシンA株式を準備1.5mlマイクロチューブに。使用するまで-20℃で保存してください。 </li><li> 1.5mlマイクロチューブにBSA 20mgを秤量することにより、BSA株式を準備します。使用するまで-20℃で保存してください。 </li></ol>ミトコンドリアの単離（図1） <ol><li>分離の直前に、均質化緩衝液1mlにスブチリシンAを溶解する。 </li><li>分離の直前に、均質化緩衝液1mlにBSAを溶解する。 </li><li>氷上で50ミリリットルコニカル遠心管中で1×PBS中で6ミリメートル生検試料のパンチとストアを使用して2新鮮な組織サンプルを収集します。 </li><li>氷冷均質化緩衝液5mlを含む解離Cチューブに組織の2 6mmのパンチを転送します。 </li><li>組織解離に対する解離Cチューブをフィッティングすることにより、組織をホモジナイズし、予め設定されたミトコンドリアアイソレーション·サイクル（60秒均質化）を選択します。 </li><li>アイスバケットに解離Cチューブを取り外します。 </li><li>にサブチリシンA原液を250μlを追加ホモジネートは、転倒混和し、氷上で10分間ホモジネートをインキュベートする。 </li><li>均質化バッファーで氷とプリウェットフィルター上の50mlの円錐遠心管に40μmのメッシュフィルターを置き、氷上で50ミリリットルコニカル遠心チューブにホモジネートをフィルタリングします。 </li><li>ろ液に新たに調製したBSA原液を250μlを加え、転倒混和。 注：ミトコンドリアタンパク質の決定が必要な場合は、この手順を省略します。 </li><li>均質化バッファーで氷とプリウェットフィルター上の50mlの円錐遠心管に40μmのフィルターを置き、氷上で50ミリリットルコニカル遠心チューブにホモジネートをフィルタリングします。 </li><li>均質化バッファーで氷とプリウェットフィルター上の50mlの円錐遠心管に10μmのフィルターを置き、氷上で50ミリリットルコニカル遠心チューブにホモジネートをフィルタリングします。 </li><li>で10分間、9,000×gで2予備冷却1.5mlマイクロチューブと遠心分離機にろ液を移し4ºC。 </li><li>上清を除去し、再懸濁し、氷冷呼吸緩衝液1mlにペレットを兼ね備えています。 </li></ol> ATPアッセイ注：ATPルミネセンスアッセイはATPアッセイキットを用いて行うことができる単離されたミトコンドリアの代謝活性を測定するため。プロトコル、試薬および標準は、アッセイキットで供給された。手順の概要について説明する。 <ol><li> RTにキット試薬​​を平衡化する。 </li><li>蒸留水の1170μlの凍結乾燥したATPペレットを溶解することにより10 mMのATP原液を準備します。氷上で保存ATP標準原液、準備ミトコンドリアのサンプル。 </li><li>凍結乾燥した基質溶液のバイアルに基質緩衝溶液5mlを追加します。穏やかに混合し、暗所に置きます。 </li><li>黒、不透明な底の96ウェルプレートのすべてのウェルに呼吸緩衝液100μlを追加します。 </li><li> Oよく準備のサンプルからそれぞれにミトコンドリアの10μl添加FA黒、不透明な底の96ウェルプレート。注：サンプルは、三連でプレーティングする。規格および陰性コントロール（呼吸バッファ）のための3つのウエルの行を含めます。 </li><li>標準やコントロールを含む、全てのウェルに、哺乳類細胞溶解液50μlを追加します。 </li><li> 125 rpmでオービタルシェーカー上で5分間37ºCでプレートをインキュベートする。 </li><li>インキュベーション中の10mMのATP原液から0.1ミリメートル、0.05ミリメートル、0.01ミリメートル、0.005ミリモル、0.001 mmであり、0.0001 mMのATPの濃度のATP標準を準備します。氷の上の基準を保管してください。 </li><li>インキュベーション後、プレートマップ上に示されるように、対応するウェルに、ATP標準液10μlを加える。注：標準は二重に実施されている。 </li><li>各ウェルに再構成された基質溶液50μlを追加します。 </li><li> 125 rpmで5分間、オービタルシェーカー上で37ºCでプレートをインキュベートする。 </li><li>分光光度計を用いて接続されたコンピュータ上で開くのGen5 1.11ソフトウェア。 </li><li> &quot;の下で新規アイテムの作成」をクリックして「実験」。 </li><li> 「デフォルトのプロトコル」をクリックします。 「OK」をクリックしてください。 </li><li>左の列で、「プロトコル」、そして「プロシージャ」を選択します。 </li><li> 「遅延」を選択します。夜12時10分00秒に設定します。 「OK」をクリックしてください。 </li><li>選択して「読み取り」。ドロップダウンメニューから「ルミネセンス」を選択します。読み取りタイプエンドポイント、積分時間0：01.00 MM：次のように他の設定を調整しSS.SS、フィルター1セット、排出穴、光学ポジショントップ、感度100、トッププローブ縦1.00ミリメートルオフセット。 </li><li>プレートを分析する準備ができたら、一番上の行の「リード·プレート」アイコンをクリックします。 「読む」をクリックしてください。分光光度計が開いたら、左上隅にあるだけでなく、A1にしてトレイにプレートを置く。温度のボックスが開きます。 「読む」をクリックしてください。注：値が大きいほど、増加したATPレベルより高い代謝活性と相関する。 </li></ol>

<ol>
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R., Giorgi, C., Lebiedzinska, M., Duszynski, J., Pinton, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+mitochondria-associated+membranes+and+mitochondria+from+animal+tissues+and+cells.">Isolation of mitochondria-associated membranes and mitochondria from animal tissues and cells.</a> Nat Protoc. 4 (11), 1582-1590 (2009).</li><li>Gostimskaya, I., Galkin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+highly+coupled+rat+heart+mitochondria.">Preparation of highly coupled rat heart mitochondria.</a> J Vis Exp. (43), (2010).</li><li>Gross, V. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Injection+of+isolated+mitochondria+during+early+reperfusion+for+cardioprotection.">Injection of isolated mitochondria during early reperfusion for cardioprotection.</a> American J Physiol Heart and Circ Physiol. 296 (1), 94-105 (2009).</li><li>Olson, M. S., Von Korff, R. 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全ての動物は、現在の機関のガイドラインに従って処理した。私たちは、開示することなく、競合する金融利害関係はありません。

正常にこのプロトコルを使用してミトコンドリアを分離するためには、ミトコンドリアの生存能力を維持するために氷の上のすべてのソリューションおよび組織サンプルを維持することが不可欠である。氷上に維持した場合でも、単離されたミトコンドリアは、19時間にわたって機能的活性の減少を示すであろう。私たちは、すべてのソリューションや追加が事前に準備することをお...

A correction was made to: <a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/video/51682">Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.</a> An optional step was added to step 7 of the &#39;Mitochondrial Isolation&#39; section of the protocol. The step is:
1. Optional in the case that the tissue is fibrous: Centrifuge the solution at 750 x g for 4 min.

A correction was made to: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration.

Erratum: Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

ミトコンドリアは、赤血球を除く体内のあらゆる細胞に存在し、重要な細胞及び代謝過程1-4の多数に関与している。そのため、これらの多くの機能により、ミトコンドリアの損傷は有害な影響3を持つことができます。ミトコンドリア機能および機能不全を調べるために、いくつかのミトコンドリアの単離方法が記載されている。 1940 5-8ミトコンドリアアイソ日の最も早い公表さを占めています。最初の文書化された試みは、低速5,8での塩溶液中で遠心分離し、乳鉢で肝組織を粉砕することにより、ミトコンドリアの単離を実証した。その後、他のグループは、元の手順の際に展開され、分画遠心6-8に基づいて、組織の分別を実証した。これらの初期の方法は、しばしば均質化、および/ ​​または分画遠心9-15を組み込む現在の技術の基礎を形成した。 homogenizati数ステップにし、遠心分離プロトコルによって異なります。これらの反復的な手順では、ミトコンドリアの分離のための時間を増加させ、最終的には実行可能性を減らすことができます。正しく10,16を制御しない場合に加えて、手動の均質化は、ミトコンドリアの損傷や一貫性のない結果を引き起こす可能性があります。 最近では、心筋組織17,18への移植のためのミトコンドリアを分離するために均質化および分画遠心を使用していました。この長時間の単離手順は、約90分を要し、このメソッドの臨床的適用可能性は、したがって限られていた。臨床的および外科的治療の急性治療的使用を可能にするために、私たちは30分未満で行うことができる迅速なミトコンドリアの単離法を開発した。 このプロトコルの主な利点は、標準化された組織解離が均一かつ簡単に手動均質化で達成されていない組織の一貫した均質化を可能にすることである。 ADDITでイオン、分画遠心の代わりに、差動ろ過の使用は、時間がかかり、高度に精製された実行可能な呼吸有能なミトコンドリアのより迅速な単離を可能にする、繰り返しの遠心分離工程を排除します。 30分未満で生存可能であり、呼吸有能なミトコンドリアを単離する能力は、臨床応用が可能となる。この分離プロトコルは、冠動脈バイパスグラフト術（CABG）および他の治療手順において使用するための可能性を有する。

<table><tbody><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Substilsin A</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5380</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5379</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6191</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P2173</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374</td><td></td></tr><tr><td>ATPlite Luminescence Assay System,&lt;br/&gt; 1,000 Assay Kit</td><td>Perkin Elmer</td><td>6016941</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Conical Tubes</td><td>BD</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>40 &amp;mu;m Nylon Filters</td><td>BD&amp;nbsp;</td><td>352340</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS C tube</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>120-005-331</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Eppendorf tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>6 mm biopsy punch</td><td>Miltex</td><td>33-36</td><td></td></tr><tr><td>10 &amp;mu;m Pluristrainer</td><td>Pluriselect</td><td>43-500-10-03</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Centrifuge 5415C</td><td>Marshall Scientific</td><td>EP-5415C&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GentleMACS Dissociator&amp;nbsp;</td><td>Miltenyl Biotech</td><td>130-093-235</td><td></td></tr><tr><td>96-well plates, tissue culture treated</td><td>VWR</td><td>82050-732</td><td></td></tr><tr><td>Rotomax 120 orbital shaker</td><td>Heidolph</td><td>544-41200-00</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H4 Hybrid Multi-Mode&lt;br/&gt; &amp;nbsp;Microplate Reader</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multisizer 4 Coulter Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63076</td><td></td></tr><tr><td>Oxytherm System</td><td>Hansatech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Fisher Scientific</td><td>267110</td><td></td></tr></tbody></table>

rapid isolation and purification of mitochondria for transplantation by tissue dissociation and differential filtration

以前に分画遠心法および/またはフィコール勾配遠心分離を用いてミトコンドリア単離方法が完了するまで60〜100分を必要とする。私たちは、商業組織の解離及び差動濾過を用いて、哺乳動物の生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法を記載している。このプロトコルでは、手動の均質化は、組織解離の標準化された均質化サイクルに置き換えられる。これは、均一かつ簡単に手動均質化で達成されていない組織の一貫した均質化することができます。組織解離の後、ホモジネートを、繰り返し遠心分離工程を排除ナイロンメッシュフィルターを通して濾過する。結果として、ミトコンドリアの単離は、30分未満で行うことができる。この単離プロトコールは、0.18±0.04グラム（湿重量）組織サンプルから約2×10 10の生存および呼吸有能なミトコンドリアをもたらす。

組織解離および差動濾過を用いてミトコンドリアの単離における処理手順の概要を示す図が図1に示されている。合計手続き時間が30分未満である。 組織サンプルは、6mmの生検パンチを使用して得た。組織重量は0.18±0.04グラム（湿重量）であった。粒径計数によって決定されるように単離したミトコンドリアの数は2.4であった×10 10±0.1×10 6の骨格筋<su...

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Rapid Isolation And Purification Of Mitochondria For Transplantation By Tissue Dissociation And Differential Filtration

哺乳動物の組織生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法が記載されている。ラット肝臓または骨格筋​​調製物は、商業的な組織解離をホモジナイズし、ミトコンドリアをナイロンメッシュフィルターを通して差動濾過により単離した。代替的な方法を用いて100分間 - ミトコンドリアの分離時間は60と比較して&lt;30分である。

組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製

Previously described mitochondrial isolation methods using differential centrifugation and/or Ficoll gradient centrifugation require 60 to 100 min to ...

rapid-isolation-purification-mitochondria-for-transplantation-tissue

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

38.0K ビュー.  Beth Israel Deaconess Medical Center and Harvard Medical School. 哺乳動物の組織生検からのミトコンドリアの迅速な単離のための方法が記載されている。ラット肝臓または骨格筋​​調製物は、商業的な組織解離をホモジナイズし、ミトコンドリアをナイロンメッシュフィルターを通して差動濾過により単離した。代替的な方法を用いて100分間 - ミトコンドリアの分離時間は60と比較して

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Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from the oxidation of reduced compounds such as nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and flavin adenine dinucleotide (FADH2). The complete annotation of the Arabidopsis thaliana genome has established it as the most widely used plant model system, and thus the need to purify mitochondria from a variety of organs (leaf, root, or flower) is necessary to fully utilize the tools that are now available for Arabidopsis to study mitochondrial biology. Mitochondria are isolated by homogenization of the tissue using a variety of approaches, followed by a series of differential centrifugation steps producing a crude mitochondrial pellet that is further purified using continuous colloidal density gradient centrifugation. The colloidal density material is subsequently removed by multiple centrifugation steps. Starting from 100 g of fresh leaf tissue, 2 - 3 mg of mitochondria can be routinely obtained. Respiratory experiments on these mitochondria display typical rates of 100 - 250 nmol O2 min-1 mg total mitochondrial protein-1 (NADH-dependent rate) with the ability to use various substrates and inhibitors to determine which substrates are being oxidized and the capacity of the alternative and cytochrome terminal oxidases. This protocol describes an isolation method of mitochondria from Arabidopsis thaliana leaves using continuous colloidal density gradients and an efficient respiratory measurements of purified plant mitochondria.

Isolation and Respiratory Measurements of Mitochondria from Arabidopsis thaliana

As mitochondria are only a small percentage of the plant cell, they need to be purified for a range of studies. Mitochondria can be isolated from a variety of plant organs by homogenization, followed by differential and density gradient centrifugation to obtain a highly purified mitochondrial fraction.

分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

Mitochondria are essential organelles involved in numerous metabolic pathways in plants, most notably the production of adenosine triphosphate (ATP) from ...

生化学

Rapid Isolation of the Mitoribosome from HEK Cells

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative phosphorylation complexes encoded by the mitochondrial genome. Since all proteins synthesized by human mitoribosomes are integral membrane proteins, human mitoribosomes are tethered to the mitochondrial inner membrane during translation. Compared to the cytosolic ribosome the mitoribosome has a sedimentation coefficient of 55S, half the rRNA content, no 5S rRNA and 36 additional proteins. Therefore, a higher protein-to-RNA ratio and an atypical structure make the human mitoribosome substantially distinct from its cytosolic counterpart.
Despite the central importance of the mitoribosome to life, no protocols were available to purify the intact complex from human cell lines. Traditionally, mitoribosomes were isolated from mitochondria-rich animal tissues that required kilograms of starting material. We reasoned that mitochondria in dividing HEK293-derived human cells grown in nutrient-rich expression medium would have an active mitochondrial translation, and, therefore, could be a suitable source of material for the structural and biochemical studies of the mitoribosome. To investigate its structure, we developed a protocol for large-scale purification of intact mitoribosomes from HEK cells. Herein, we introduce nitrogen cavitation method as a faster, less labor-intensive and more efficient alternative to traditional mechanical shear-based methods for cell lysis. This resulted in preparations of the mitoribosome that allowed for its structural determination to high resolution, revealing the composition of the intact human mitoribosome and its assembly intermediates. Here, we follow up on this work and present an optimized and more cost-effective method requiring only ~1010 cultured HEK cells. The method can be employed to purify human mitoribosomal translating complexes, mutants, quality control assemblies and mitoribosomal subunits intermediates. The purification can be linearly scaled up tenfold if needed, and also applied to other types of cells.

Mitochondria have specialized ribosomes that diverged from their bacterial and cytoplasmic counterparts. Here we show how mitoribosomes can be obtained from their native compartment in HEK cells. The method involves isolation of mitochondria from suspension cells and consequent purification of mitoribosomes.

HEK 細胞から Mitoribosome の急速な隔離

The human mitochondria possess a dedicated set of ribosomes (mitoribosomes) that translate 13 essential protein components of the oxidative ...

Purification of Mitochondria from Yeast Cells

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play essential roles in apoptotic cell death2, cell survival3, mammalian development4, neuronal development and function4, intracellular signalling5, and longevity regulation6. Our understanding of these complex biological processes controlled by mitochondria relies on robust methods for assessing their morphology, their protein and lipid composition, the integrity of their DNA, and their numerous vital functions. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and well-defined proteome, is a valuable model for studying the molecular and cellular mechanisms underlying essential biological functions of mitochondria. For these types of studies, it is crucial to have highly pure mitochondria. Here we present a detailed description of a rapid and effective method for purification of yeast mitochondria. This method enables the isolation of highly pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification. Mitochondria purified by this method are suitable for cell-free reconstitution of essential mitochondrial processes and can be used for the analysis of mitochondrial structure and functions, mitochondrial proteome and lipidome, and mitochondrial DNA.

We describe a rapid and effective method for purification of mitochondria from the yeast Saccharomyces cerevisiae. This method enables the high-yield isolation of pure mitochondria that are essentially free of contamination by other organelles and retain their structural and functional integrity after their purification.

酵母細胞からミトコンドリアの精製

Mitochondria are the main site of ATP production during aerobic metabolism in eukaryotic non-photosynthetic cells1. These complex organelles also play ...

生物学

Preparation and Respirometric Assessment of Mitochondria Isolated from Skeletal Muscle Tissue Obtained by Percutaneous Needle Biopsy

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining samples of human Vastus lateralis, isolating mitochondria from minimal amounts of skeletal muscle tissue, and plate based respirometric profiling using an extracellular flux (XF) analyzer. Comparison of respirometric profiles obtained using 1.0, 2.5 and 5.0 &#956;g of mitochondria indicate that 1.0 &#956;g is sufficient to measure respiration and that 5.0 &#956;g provides most consistent results based on comparison of standard errors. Western blot analysis of isolated mitochondria for mitochondrial marker COX IV and non-mitochondrial tissue marker GAPDH indicate that there is limited non-mitochondrial contamination using this protocol. The ability to study mitochondrial respirometry in as little as 20 mg of muscle tissue allows users to utilize individual biopsies for multiple study endpoints in clinical research projects.

Methods for biopsy of Vastus lateralis, preparation of purified mitochondria, and respirometric profiling are described. The use of small muscle volume makes this technique suitable for clinical research applications.

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

Respirometric profiling of isolated mitochondria is commonly used to investigate electron transport chain function. We describe a method for obtaining ...

医学

ミトコンドリア接触部位の分離

An Improved Method to Isolate Mitochondrial Contact Sites

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the synthesis of iron-sulfur clusters, lipids, or proteins, Ca2+ buffering, and the induction of apoptosis. Likewise, mitochondrial dysfunction results in severe human diseases such as cancer, diabetes, and neurodegeneration. In order to perform these functions, mitochondria have to communicate with the rest of the cell across their envelope, which consists of two membranes. Therefore, these two membranes have to interact constantly. Proteinaceous contact sites between the mitochondrial inner and outer membranes are essential in this respect. So far, several contact sites have been identified. In the method described here, Saccharomyces cerevisiae mitochondria are used to isolate contact sites and, thus, identify candidates that qualify for contact site proteins. We used this method to identify the mitochondrial contact site and cristae organizing system (MICOS) complex, one of the major contact site-forming complexes in the mitochondrial inner membrane, which is conserved from yeast to humans. Recently, we further improved this method to identify a novel contact site consisting of Cqd1 and the Por1-Om14 complex.

著者スポットライト:ミトコンドリアの接触部位と建築的洞察の発表 

Mitochondrial contact sites are protein complexes that interact with mitochondrial inner and outer membrane proteins. These sites are essential for the communication between the mitochondrial membranes and, thus, between the cytosol and the mitochondrial matrix. Here, we describe a method to identify candidates qualifying for this specific class of proteins.

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

Mitochondria are present in virtually all eukaryotic cells and perform essential functions that go far beyond energy production, for instance, the ...

超複合体分析のための小さな組織サンプル中のミトコンドリア分画

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial electron transport chain organization, giving rise to the proposal of the "plasticity model." This model postulates the coexistence of different proportions of SCs and complexes depending on the tissue or the cellular metabolic status. The dynamic nature of the assembly in SCs would allow cells to optimize the use of available fuels and the efficiency of electron transfer, minimizing reactive oxygen species generation and favoring the ability of cells to adapt to environmental changes. 
More recently, abnormalities in SC assembly have been reported in different diseases such as neurodegenerative disorders (Alzheimer's and Parkinson's disease), Barth Syndrome, Leigh syndrome, or cancer. The role of SC assembly alterations in disease progression still needs to be confirmed. Nevertheless, the availability of enough amounts of samples to determine the SC assembly status is often a challenge. This happens with biopsy or tissue samples that are small or have to be divided for multiple analyses, with cell cultures that have slow growth or come from microfluidic devices, with some primary cultures or rare cells, or when the effect of particular costly treatments has to be analyzed (with nanoparticles, very expensive compounds, etc.). In these cases, an efficient and easy-to-apply method is required. This paper presents a method adapted to obtain enriched mitochondrial fractions from small amounts of cells or tissues to analyze the structure and function of mitochondrial SCs by native electrophoresis followed by in-gel activity assays or western blot.

著者スポットライト:健康と疾患における酸化的リン酸化システムのダイナミクスとミトコンドリアの役割の解明

This protocol describes a technique for the analysis of respiratory supercomplexes when only small amounts of samples are available.

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples) 

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

組織解離と差動濾過により移植のためにミトコンドリアの迅速な単離および精製

要約

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分離とシロイヌナズナ由来のミトコンドリアの呼吸測定

HEK 細胞から Mitoribosome の急速な隔離

酵母細胞からミトコンドリアの精製

経皮針生検によって得られた骨格筋組織から単離されたミトコンドリアの調製と呼吸計測評価

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

ミトコンドリア接触部位を単離するための改良された方法

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples)

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples)

ミトコンドリアスーパーコンプレックス解析のためのミトコンドリアの単離 (Small Tissue and Cell Culture Samples)