著者は、グロリアAベナビデスの技術的貢献を認めるしたいと思います。この作品は、アメリカ心臓協会13PRE16390001（SR）、NIH T32HL07918（PAK）、NIH T32HL007457（TM）、P30DK056336（BKC）、NIDDK糖尿病合併症コンソーシアム（DiaComp、www.diacomp.org）助成金DK076169（subaward VDU）によってサポートされていましたとオブライエンセンターP30のDK079337（VDU）。

採血、分離、分析のために、この原稿に記載されているすべてのプロトコルは、バーミンガムのアラバマ大学で見直され、治験審査委員会によって承認されている。 1。細胞単離（ヒストシグマアルドリッチプロトコル番号1119とミルテニーバイオテクマイクロビーズ正と負の選択プロトコルから変更） <ol><li>スイングバケットローター（加速度= 5-6、およびブレーキなし）で遠心機で15分間500×gで遠心分離器（ACDまたはEDTAチューブに回収）全血。 </li><li> 1センチメートルは細胞層（赤血球/軟膜）を超えたままになるまで転送ピペットを用いて多血小板血漿（PRP）が含まれている一番上の層を除去する。後で処理するために、室温でPRPを取っておく。 </li><li>無菌50mlコニカルチューブにバフィーコートを転送、基礎RPMIで24ミリリットルに希釈するか、または少なくとも始まる軟膜量を4倍。 注：RBC層の上半分よい時間これは比例するRPMI体積を増加させることになりますが、含まれるべきAVE。 </li><li> 3 15ミリリットルコニカルチューブ（3ミリリットルずつ）の一番下の層には1.119の比重でトップ層と高密度のFicollのために1.077の比重の低密度フィコール（1077）を用いた密度勾配（1119）を準備します。この手順を実行するには、まず各管に1077を追加します。 5ミリリットル狭いピペットを使用して、1077の下にピペットチップを配置することによってチューブの底に1119を追加し、徐々に上部の勾配で混合することなく試薬を放出する。密度勾配メディアの6ミリリットルの合計は3ミリリットルマークの分離の目に見える相と、この段階では存在すべきである。 </li><li>自動ピペットを用いて、傾斜層を乱すことを防止するために、低電力設定を使用して各勾配管を穏やかに（ステップ1.3）から希釈した血液を8mlを加える。総容積は、この段階で14ミリリットルにする必要があります。 </li><li>室温で30分間、700×gで（ACCELEにおける遠心管比6、ブレーキなし）。 注：この段階では、3の異なる細胞バンドが明らかである（ 図1A）。 （1077とプラズマとの間の）一番上のバンドが多形核白血球（PMN）と（1119下）下のバンドが含まれている単核細胞（多国籍企業）および血小板、および（1007と1119の間）中域が含まれているRBCは含まれています。 </li><li>他の細胞のバンドを乱すことなく滅菌ガラスピペットを使用して、別々にMNCおよびPMNを収集します。無菌50mlコニカルチューブに各チューブからMNCの人口を兼ね備えています。同様に、PMNの人口のためにこれを繰り返します。 </li><li>密度勾配を希釈するために、それぞれMNCおよびPMN画分を含む各チューブに、RPMIの4ボリュームを追加します。 </li><li>室温で10分間、700×gで遠心分離チューブ。 </li><li> 1ミリリットルのRPMIに再懸濁MNC細胞ペレットとのPMN細胞ペレットを0.5％超高純度無脂肪酸BSA（RPMI-BSA）を含有し、1.5ミリリットルのチューブを無菌に転送。 30ベンチトップピコフュージを用いて細胞をペレット化秒。 </li><li>上澄み液を捨て、80μlのRPMI-BSA中の各細胞ペレットを再懸濁します。 </li><li>単球の正の選択のためのMNC画分を含む管に磁気ビーズ標識antiCD14抗体20μLを加える。 PMN細胞画分を含むチューブの場合は、好中球の正の選択のために磁気ビーズ標識antiCD15抗体20μLを加える。 4℃で15分間、各細胞懸濁液をインキュベート</li><li> 1ミリリットルのRPMI-BSAメディアで各細胞懸濁液を洗​​浄し、以前のようにペレットを500μlのRPMI-BSA中に各ペレットを再懸濁。 </li><li>標識された細胞（MACS）セパレーターを磁気活性化細胞ソーティングの磁界中で分離される。細胞懸濁液を添加する前にRPMI-BSA 3mlのMACS分離器及び洗浄カラムを配置することによってMACS LSの​​カラム（各細胞懸濁液のためのもの）を準備する。 </li><li>細胞懸濁液を適用した後、メディアのDraIを聞かせてください（RPMI-BSA培地3mlで各列3回洗うN完全に洗浄の間）。滅菌チューブに細胞懸濁液のフロースルーとカラムの洗浄​​を集める。 </li><li> 単球および好中球を単離するために、最後の洗浄後、磁場から列を削除し、列のプランジャーを用いRPMI-BSAを5mlの滅菌チューブに積極的に選択したセルを溶出。 </li><li> リンパ球は 10分間300×gでステップ1.15からの多国籍企業のフロースルー·洗浄画分をペレット単離した。上澄み液を捨て、80μlのRPMI-BSA中で細胞ペレットを再懸濁します。 CD61およびCD235a抗体を20μlを加え、4℃で15分間、細胞懸濁液をインキュベート以前のようにMACS分離を繰り返し、リンパ球を含むものの流れを収集します。 </li><li> （ステップ1.9）、以前のように、単球、好中球、およびリンパ球画分、遠心分離機をペレット、上清を廃棄する。細胞ペレットを、カウントのために1ミリリットルの細胞外フラックスメディア（XF-DMEM）中に再懸濁する必要があります。&lt;BR /&gt;注：全血の8ミリリットルが1〜5×10 6単球/ mlであり、5〜20×10 6リンパ球および好中球/ mlに生じるはずである。 </li><li> 血小板 、室温で1500×gで8月10日分の遠心PRP（ステップ1.2）を単離する 。血漿を除去し、PBSで1μg/ mlののPGI 2、repelletを補足し、滅菌5ミリリットルで一回、細胞ペレットを洗浄し、PBS-PGI 2緩衝液1mlに最終ペレットを一時停止。 </li><li> Walkowiak らによって記載されているように、血小板を分光光度計で、PBS-PGI 2緩衝液に懸濁されると濁度により血小板数を決定し、次の式を使用して：[6.23 /（2.016 - ABS 800）] - 3.09×希釈係数=＃X 10 8。血小板/ mlの12。 </li></ol> 2。細胞のプレー<ol><li>細胞-徳（細胞接着）の調製：180μlに90μlの細胞接着を追加するのdiH 2 0、0.1 Nナトリウムbiの540μL炭酸塩（pH8.0）に、1 N NaOHを用いて7.2〜7.8にpHを調整する。調製した細胞接着性の30μlの各ウェルをコーティングすることによりXFプレート（24ウェル、V7マイクロプレート）を準備します。 注意：細胞接着剤は使用するたびに新たに調製しなければならない。 </li><li>細胞接着を吸引し、二回（1ミリリットル/ウェル）、PBSでウェルを洗った後、20〜30分間37℃で静置します。 </li><li>孤立した単球、リンパ球、好中球や血小板に細胞数を行い、播種単球、リンパ球、および好中球のための250K細胞/ウェルの密度、および血小板のための25×10 6 /ウェルを許可するようにXF-DMEMを使用して、適切な音量にもたらす。あるいは、酸化的バースト応答を測定するために、好中球は125K細胞/ウェルで播種することができる。各細胞懸濁液の最終的な播種量は200μl/ウェルである必要があります。 </li><li>ブレーキなしで1秒間200×gでプレートを遠心分離する。 300×gでブレーキなしで再びプレートを180˚と遠心分離機を回転させます。 </li><li>最終ウェル体積をもたらすUME XF-DMEMで660μLに前XFアッセイと30分間37℃でインキュベートする。注：播種した細胞の前と後のアッセイの顕微鏡写真は、十分なめっきを保証し、細胞剥離を除外するために使用することができる。 </li></ol> 3。 24ウェル細胞外フラックスアッセイプレートの作製（XF24） <ol><li>水和物XFはアッセイ前に2時間の最低キャリブラント溶液でプローブします。 </li><li>上記の順序でカートリッジの注入口に0.5μg/ mlのオリゴマイシン、0.6μMFCCPの10倍株式、XF-DMEMおよび負荷の10μMのアンチマイシンAの原液75μlのを準備します。酸化的バーストの測定値が得られるのであれば、100 ng / mlのPMAの10×ストックの注射は、アンチマイシン-Aの後に注入することができる。 </li><li>水和され、ロードされたカートリッジをキャリブレーションし、XFのアッセイを行う。分析および酸素消費量およびpH変化の両方を解釈するための詳細な方法は、以前の刊行物9,13,14に記載されており、dはされないここでは詳細にiscussed。 </li><li>アッセイプレートからの細胞の損失を防止し、50μlのRIPA細胞溶解緩衝液を追加し、正規化のためにタンパク質アッセイを実行するために後XFアッセイ後、XF-DMEMの最後の50μlが、すべてを吸引する。 </li></ol>

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VDUはシーホース·バイオサイエンス科学諮問委員会のメンバーでもあります。

このプロトコルは、生体エネルギー分析のための適切な方法で血球分離のためのいくつかの一般的に利用される技術のコンパイルを表す。連続的な提示技術は、単離された細胞上に配置された最小限のストレスに制御された培地条件下で多数の細胞を単離するそれらの能力のための他の単離方法（ すなわち、FACS分析）に有利で ​​ある。それも、最小限の中断との長いアイソレーションという欠点がある。このプロトコルは、臨床環境および翻訳の研究に外挿することができるヒト被験体からの一次血液細胞の単離のための基礎として機能する。 MACS分離は、全血から直接細胞を単離する可能性を提供する信頼性のある細胞分離技術であるが、この方法は、抗体のより大きな量を必要とし、この方法に記載の通り、すべての4つの異なる細胞型の単離のための最適ではない。 Bは、そこにあります私たちの分離プロトコルを使用して、活性化のMACS分離結果による白血球の正の選択ことを示す証拠はEENん。 MACSカラムは、50 nmの超常磁性粒子に結合させた抗体を用いて、磁場中で標識した細胞の隔離することによって機能する。標識された細胞をカラムから溶出される。正と負の選択が迅速な単離と純度を確実にするために、このプロトコルに実装されています。不十分な細胞数は、単離から得られるか、純度が問題になっている場合、より多くの抗体は、高い純度（ 表2）をもたらし得るLSカラムに通して、ベンダーの指示及び第二の通路に従って試料に添加することができる。当研究室では、FACS分析8によって、最終的な細胞懸濁液を分析することによって、既存のプロトコルを用いて、高純度、メッキ効率を発見した。 細胞外フラックス分析器はオトの上に即座に酸素消費量およびメディア酸性化の両方を監視する機能を有する彼女の電極。 DPIの8による阻害によって示されるように、単球および好中球の酸化的バースト応答によって観察されるように酸素消費量は、NADPHオキシダーゼ依存しています。我々は長期のアイソレーションまたは拡張XFアッセイと酸化的バースト能力の時間依存性損失を見てきました。このプロトコルは、設計·開発XF24での使用のためではなく、ほぼ第三密度を播種XF24細胞（ 図3）の半分にもXF96と互換性がありました。 このプロトコルの設計では、各技術のための既存のプロトコルへの準拠は、単に生体エネルギー分析用の培地条件を制御するために加えられた変更との最適なパフォーマンスを得るために必要とされた。そのようなプロトコルは、治療戦略の有効性または毒性を測定するための並進および研究用途の広い配列に使用することができる技術を習得した後、単球および中性子爆弾によって疾患、およびオキシダント産生の代謝特性を探る炎症状態にあるrophils。

血液から免疫細胞（単球、リンパ球、好中球）および血小板の生体エネルギー状態を監視することは、個々の全体的な生体エネルギー状態を評価するために潜在的に有用な診断ツールとしてしばらくの間認識されている。癌、心血管疾患およびミトコンドリア機能障害の1,2への神経変性疾患などの疾患の数を帰属文学の新たなボディがあります。ミトコンドリア機能障害は、炎症誘発性シグナル伝達経路を促進または細胞死につながる細胞の一連のイベントを開始することができますので、これは臨床的に重要である。いくつかの研究は、線維筋痛、糖尿病、敗血症性ショック、およびアルツハイマー病などの条件3-7の末梢血単核細胞および血小板のミトコンドリア機能を特徴としている。例えば、最近の研究では、ミトコンドリア機能のマーカーとしての血小板の生体エネルギーを評価し、発見したタイプ2 diabetから血小板でIC患者は、ミトコンドリアの酸素消費を減少させた7,8。これらの知見およびその他から、それらは全身循環を調査し、ローカルおよびグローバルな代謝変化を反映することができるので、単球、リンパ球、好中球および血小板が病理学的条件下で生体エネルギーの変化の代理マーカーとして役立つことができることは明らかである。このアプローチは、分析のハイスループット方法を予後または診断値を有し、細胞調製のための一貫性のある方法が必要である。かどうかを決定するために白血球と血小板におけるミトコンドリアの機能を測定する方法は、以前に無傷の細胞4,9における細胞生体エネルギーのミトコンドリアや評価の隔離を含んでいた。細胞外フラックス（XF）分析装置を用いて細胞の生体エネルギー評価の利点は、細胞内のミトコンドリアの機能は、プロトンリークと最大呼吸などの内因性基質および呼吸パラメータを確立することができるということである容量を決定することができる。我々は、他のヒト血液から単離された血小板、単球およびリンパ球における生体エネルギープロファイルは、細胞型8の間に成立し、比較することができることを示すためにこの技術を使用している。また、好中球および単球の両方がNAPDHオキシダーゼが活性化されている酸化的バースト能力を有し、スーパーオキシドを形成するために酸素を消費する。重要なことに、この経路は、先天性免疫の重要な構成要素であり、全身性炎症によって変調される。例えば、酸化的バースト容量の変化は、例えば、多発性硬化症、関節炎、および再発性感染の10,11のような種々の自己免疫疾患と関連していることが示されている。現在、臨床試料中の酸化的バーストを測定するために利用可能な高スループットの定量的アッセイがありません。好中球や単球の酸化的バースト能力を特徴づけることは、いくつかのpatholoための重要な診断ツールとして機能することができるので、これは重要ですGIES。 主要な技術的課題は、従来のポーラログラフィー技術を用いて酸素消費量の測定と、より敏感なマイクロプレート蛍光技術を用いたときに付着した細胞を使用する必要性のために低感度であった。この実用的なビデオでは、我々はこれらの問題に対する技術的な解決策について説明します。我詳細単球、リンパ球、好中球、および血小板と単球およびヒト血液から好中球の酸化的バーストの生体エネルギーの単離、めっき及び測定するための方法は 、この方法は、持っている研究者のための生体エネルギー論及び酸化的バーストの臨床評価に適している患者集団と、新鮮な血液サンプルを入手する機能へのアクセス。

<table><tbody><tr><td>QuadroMACS Starting Kit includes QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-094-833</td><td></td></tr><tr><td>CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-501</td><td></td></tr><tr><td>CD61 MicroBeads, human&amp;nbsp; for platelets</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-051-101</td><td></td></tr><tr><td>CD14 MicroBeads, human&amp;nbsp; for monocytes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-050-201</td><td></td></tr><tr><td>CD15 MicroBeads, human&amp;nbsp; for granulocytes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-046-601</td><td></td></tr><tr><td>LS Columns</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer ACD Blood collection tubes</td><td>Fisher</td><td>02-684-26</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>11835-030</td><td>with L-glutamine and without phenol red</td></tr><tr><td>Prostaglandin I2, sodium salt</td><td>Cayman</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml semi-micro cuvettes</td><td>Phenix Research Products</td><td>SC-2410</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque density gradient, specific gravity 1.077</td><td>Sigma</td><td>10771</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque density gradient, specific gravity 1.119</td><td>Sigma</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin Fraction V</td><td>Roche</td><td>3117405001</td><td>fatty-acid ultra-free</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate</td><td>Sigma</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>XF24 FluxPak</td><td>Seahorse Biosciences</td><td>100850-001</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Fisher</td><td>MT90113PB</td><td>w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate</td></tr><tr><td>L-Glutamine, 200 mM (100x)</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate</td><td>Sigma</td><td>P8574</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak (cell adhesive)</td><td>BD Biosciences</td><td>CB-40242</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycin</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Antimycin A</td><td>Sigma</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone</td><td>Sigma</td><td>C-2920</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay Reagent A</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0113</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay Reagent S</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0015</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay Reagent B</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0114</td><td></td></tr><tr><td>Seahorse</td><td>Seahorse Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator and MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976 and 24039</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioenergetics and the oxidative burst: protocols for the isolation and evaluation of human leukocytes and platelets

ミトコンドリア機能障害は、アテローム性動脈硬化症、糖尿病、敗血症性ショック、神経変性疾患はなく挑戦している患者における生体エネルギー機能の変化を評価するような多くの病的状態において重要な役割を果たすことが知られている。特定の臓器障害を伴う糖尿病やアテローム性動脈硬化症などの疾患の臨床的に存在しますが、このような高血糖や炎症などの病態の全身のコンポーネントは、白血球や血小板の循環に生体エネルギー機能を変更することができます。この概念は、しばらくの間認識されてきたが、その広範な適用は生体エネルギー分析に必要な主要な多数の細胞によって制限されてきました。この技術的制限は、磁気ビーズ分離技術、細胞接着技術は、細胞はマイクロプレートへの活性化なしに取り付けることを可能にし、ハイスループットマイク用に設計された新しい技術の感度の特異性を組み合わせることによって克服されているroplate呼吸計測。この機器の一例は、細胞外フラックスアナライザーです。このような機器は、通常、その後代謝に関連することができ、接着性細胞では、これらのパラメータの変化率を測定するために、酸素とpH感受性プローブ​​を使用しています。ここでは詳細にはヒトの血液、これらの細胞内のミトコンドリアの生体エネルギー機能の解析から、活性化することなく、単球、リンパ球、好中球や血小板の単離およびめっきのための方法を私たち。加えて、我々は、単球および好中球の酸化的バーストは、同じ試料中で測定することができる方法を実証する。これらの方法は唯一8〜20ミリリットルヒト血液を使用するので、それらは臨床現場で反応性酸素種の生成および生体エネルギーを監視するための可能性を有する。

血液細胞の生体エネルギーを評価するために、全血をEDTAまたはACDバキュテナーコレクションチューブに静脈穿刺によりヒト被験体から採取される。採血以下の白血球および血小板の単離は、プロトコルに詳述されるように、図1Aに視覚化される。全血サンプルは、細胞死および活性化を避けるために、コレクションの8時間以内に処理される。 8時間よりも大きな拡張記憶時間がテストされていませんが、変更された生体エネルギーをもたらし、生理学的条件のあまりを表すことができる。クエン酸デキストロース（ACD-8 ml）およびEDTAバキュテナーチューブは、単離された細胞の生体エネルギー機能に無影響で細胞単離のために使用されている。血餅は、得られた細胞の数を減らすフィコール勾配遠心分離中に適切な相形成を妨害し、遠心分離し、血清で得られていない血小板をほとんどもたらすような抗凝固薬が必要である。すべての血液はBIOLOGを表しiCalの有害性と、適切な個人用保護具は、細胞集団が隔離されているか、細胞溶解物が生成された後でも、全体の手順全体に実装されなければならない。サンプルは、金融機関の人間の廃棄物処理基準に従って処分しなければならない。 全血バフィーコート白血球を含有するだけでパックされた赤血球前記白色層から多血小板血漿を分離するために遠心分離される。バフィーコートは、密度勾配に適用し、末梢血単核細胞（単球およびリンパ球）および多形核細胞（顆粒球）を得るために遠心分離する。個々のMNCおよびPMN細胞相の赤血球汚染は、この段階では一般的であり、MACS精製の間に解決しなければならない。種々の細胞型は、その後、純粋な画分を得るために、磁気抗体とのインキュベーションにより得られる。単球は、CD14、フロースルーからtでPBMC画分のインキュベーションによって収集される彼はその後、赤血球および血小板の枯渇しているリンパ球を、含まれている単球。好中球は、CD15抗体（ 図1A）を有する多形核細胞層をインキュベートすることによって得られる。その後、血小板は、多血小板血漿の遠心分離によってペレット化し、他の血漿成分を除去するために洗浄することができる。これらの選択の後に血小板は、CD14 +単球、リンパ球は、CD15 +好中球は生体エネルギー及び酸化的バースト分析のための細胞接着媒体でコーティングされたXFのアナライザ·プレート上で計数し、めっきすることができる。 手順の各ステージは、無菌条件下で行われるべきであり、単球および好中球の酸化的バースト応答の早期活性化を防止することが奨励される。基礎条件で、酸素消費量にはほとんどを持っている好中球は、上昇したOCRの測定と細胞外フラックスアッセイを開始するときに、分離中に無菌条件未満の指標は明らかである徐々に増加またはアッセイ全体で減少となりました。私たちは、活性化の形態学的兆候は、アッセイの前に発生していないことを確実にするために200X以上に光学顕微鏡を用いて細胞を画像化することの重要性を強調している。 図1Bに示すように、例えば、好中球は、通常、顕著な細胞境界を有する不規則な形状に丸みを表示する。しかしながら、これらの細胞が活性化されると、プレートの表面に対して平坦化及びその別個の細胞形態を失うことになる。我々は以前、このプロトコルを使用して活性化白血球や血小板の形態変化を報告しているし、追加的な措置は、アクティベー8に遭遇した場合は、無菌状態を確保するために注意する必要があります。 プロトコルの単純化されたスキームは、細胞分離、XFプレート調製およびXFアッセイの主要なステップが詳述されたタイムテーブルとして図2に示されている。単離は、細胞型の密度勾配分離で構成され、磁気分離が続く。細胞分離工程に平行な、XF板製剤は、細胞又はめっきXFアッセイ開始の遅延を回避する必要がある。大幅な遅延が細胞の活性化と減少生体エネルギーのパラメータにつながる可能性があるため、これは非常に重要です。 単離後の不十分な細胞濃度は、一般的な問題は、各遠心分離プロセスの最適化は、細胞の損失を避けるために必要である。成功した単離は、血液のわずか6などの溶液に対して実施されたが、変化は、所望の細胞型の循環濃度に応じて行うことができる。密度勾配が不適切用意されている場合は、異なる細胞相が表示されない可能性があり、細胞の損失が発生する可能性があります（視覚的なデモンストレーション用のJoveの教育ビデオを見てください）​​。 PRPから単離された不十分な血小板はまれであるが、分離は室温以下で行われる場合、洗浄緩衝液は、PGI 2を含有しない場合、または発生している。血小板Aのリスク血小板を単離するための最後のセルである場合には、しばしばctivati​​on防止され、血小板が長時間洗浄バッファーに残っている場合しかし、生体エネルギーが影響を受けることになる。 1500 XGの遠心分離中にペレット化しておらず、これらの細胞の生体エネルギーが広範に特徴付けられていない小さい血小板集団の事例があった。より完全なトラブルシューティングガイドについては、表2を参照してください。 白血球および血小板の生体エネルギープロファイルは、非侵襲的に細胞におけるリアルタイムのO 2消費量を測定するXF分析器を用いて決定することができる。 図3Aに示すように、各セルタイプは、5つの複製を有するXF24プレート上にメッキされる。 表1に示しウェルあたりアッセイおよび平均タンパク質濃度の間に細胞の種類によって期待される基礎および酸化バースト値。高いスループット技術は、が可能になりXF96として、ご利用いただけます図3Bに示すように、4人のドナーを同時に評価することができる。分析した後、データが適切なXFソフトウェアとMicrosoft Excelを使用して分析用のワークステーションコンピュータにエクスポートされます。 OCR値は、対応するウェル中の総タンパク質含有量に対して標準化し、ピコモル/分/ mgタンパク質として表した。各細胞型の代表的な生体エネルギー酸化的バーストプロファイルは、最近我々のグループ8で報告された。先に示した、 図8の下に記載のアッセイ（基底、ATP結合、プロトンリーク、最大、nonmitochondrial及び酸化的バースト）の生体エネルギーのパラメータのさらなる分析は、個々のウェルについて計算することができる。 図4Aに示すように、基礎酸素消費速度（OCR）は第3の測定によって確立される。オリゴマイシン（0.5μg/ mlの）は、ミトコンドリアのATP合成酵素の阻害剤は、OCRがATP合成的表現とに結合された推定するためにXF媒体中に注入する<html> ATP-リンクとしてテッド。残留OCRマイナスnonmitochondrial OCRはプロトンリークに起因することができます。次いで、FCCP脱共役剤は、酸素消費nonmitochondrial源を決定するために、アンチマイシン-A、ミトコンドリア呼吸の阻害剤、続いて、最大のOCRを決定するために添加される。予備容量は、エネルギー需要の下で生産することができ、呼吸の最大速度と基礎との間の差として計算することができるATPの量の尺度である。酸化的バースト能力を決定するために、ホルボール12 -ミリステート13 -アセテート（PMA）PKCアゴニストは、NADPHオキシダーゼ活性を増加させるために注入され、PMA刺激後の酸素消費速度の増加は、XFアナライザーを用いて測定することができる。 図4Bミトコンドリア機能と酸化的バーストの異なるパラメータを計算する方法を示しています。 <html> 1301/51301fig1highres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig1.jpg &quot;/&gt; 図1。全血から白血球や血小板の単離。 A）新たに採取した検体を遠心分離によりそれらの血漿および細胞成分に分離し、Ficoll密度勾配により精製し、血小板が高いにより単離している間に磁気活性化細胞は、正（単球及び好中球）又は陰性選択（リンパ球）によって（MACS）でソートされている一度XF DMEM中に再懸濁し、指示された細胞密度でプレーティング単離された細胞集団の高速多血小板血漿を遠心分離する。B）の画像が。 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/51301/51301fig1highres.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。</a> ghres.jpg &quot;SRC =&quot; / files/ftp_upload/51301/51301fig2.jpg &quot;/&gt; 図2。白血球と血小板の生体エネルギー研究のためのXF24プレートの調製細胞の単離とメッキとカートリッジの潤いと噴射口の読み込み中XF24アッセイプレートを調製するための詳細な時系列。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig3.jpg" /> XF24およびXF96アナライザプレート。A）、白血球（125〜250,000細胞/ウェル）単一ドナーからの血小板（25×10 6細胞/ウェル） に白血球および血小板の図3のレイアウトは、背景のうち、XF24アッセイプレート上にプレーティングされているコントロール。オリゴマイシンの10倍の株式の75μL（0.5μg/ ml）を、FCCP（0.6μM）、アンチマイシンA（10μM）、およびPMA（100 ng / mlのは）XF培地で希釈がにロードされ指示された注入口へ。B）白血球（75-150K細胞/ウェル）、血小板（10×10 6細胞/ウェル）最大4つのドナーが180μlのXF-DMEMの総容量XF96にめっきすることができるから。オリゴマイシンの10倍の株式の20μL（1.0μg/ ml）を、FCCP（0.6μM）、アンチマイシンA（10μM）、およびPMA（100 ng / mlのは）XF-DMEM中で希釈され、示された注入口にロードされます。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51301/51301fig4.jpg" /> ミトコンドリアや単球における酸化的バーストによる酸素消費速度（OCR）の図4。生体エネルギー指標の分析。A）代表トレース。基礎OCRは（円内の数字で示す第3の料金）を設立している。オリゴマイシンのその後の順次追加（O; 0.5μg/ ml）を、FCCP（F; 0.6μM）および抗マイシンA（;10μM）ミトコンドリアおよび非活性化細胞のnonmitochondrial呼吸を決定するために注入される。最後に、PMA（100 ng / mlの）酸化的バーストを測定するために添加される。B）に示すようにモジュラミトコンドリア機能の分析および酸化的バーストは速度の差によって計算される。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:215px;"></td><td style="width:215px;">最適な播種密度</td><td style="width:215px;">平均。基礎OCR（ピコモルO 2 /分） </td><td style="width:215px;">平均。酸化的バーストのOCR（ピコモルO 2 /分） </td><td style="width:215px;">平均。タンパク質濃度（μg）/ウエル</td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;">単球</td><td> 250K細胞/ウェル</td><td> 83.9（13.0±） </td><td> 300.3（58.8±） </td><td> 19.0（±2.4） </td></tr><tr height="40"><td height="40"スタイル= &quot;高さ：40pxに;&quot;&gt;好中球</td><td> 250K細胞/ウェル</td><td> 6.1（2.2±） </td><td> 1411.8（233.3±） </td><td> 20.6（±2.7） </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;">リンパ球</td><td> 250K細胞/ウェル</td><td> 52.9（±7.7） </td><td> 15（±4.1） </td><td> 13.2（±2.1） </td></tr><tr height="40"><td height="40" style="height:40px;">血小板</td><td> 25×10 6細胞/ウェル</td><td> 199.4（20.3±） </td><td> 24（±2.7） </td><td> 47.5（±3.1） </td></tr></tbody></table> 表1。 XF24アッセイのための通常のパラメータ：平均基礎（レート3）および酸化的バースト（レート7）OCRはnonmitochondrial OCRまたはタンパク質に補正していないが、示された細胞密度で平板培養細胞の種類によって表示されます。 DC Lowryアッセイによって実行されるウェルあたりの平均タンパク質含有量が示されている。これらのデータは、平均値を表す±SEMを含む括弧で6-8健康なドナー。 <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="4" /></colgroup><tbody><tr height="66"><td>ステップ</td><td>問題</td><td>考えられる理由</td><td>ソリューション</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.2 </td><td style="width:199px;">明確なプラズマ</td><td style="width:199px;">遠心分離中にペレット化した血小板</td><td style="width:199px;"> 10分の遠心分離時間を短縮するか、400 XGに遅い</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;">乳白色のプラズマ</td><td style="width:199px;">過剰な脂質</td><td style="width:199px;">食後のコレクションを避ける</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.6 </td><td style="width:199px;">不完全なセルのバンドが形成される</td><td style="width:199px;">小鬼ローパー勾配の準備、冷たい試薬</td><td style="width:199px;">ピペッティングの際に勾配を中断しないよう、常温試薬を使用</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;">セル帯で塊</td><td style="width:199px;">血液の凝固が発生している可能性が</td><td style="width:199px;">このようなACDまたはEDTAなどの抗凝固剤を用いて血液を収集</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.10 </td><td style="width:199px;">ない細胞ペレットん</td><td style="width:199px;">ステップ1.6を​​参照してください。 </td><td style="width:199px;">上澄みはかすん以下を参照した場合</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"></td><td style="width:199px;">かすん上清</td><td style="width:199px;">重フィコール勾配汚染、血小板汚染</td><td style="width:199px;"> 900 XGに遠心分離速度を増加させ、ジより多くのRPMIでリュート</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.16、1.17 </td><td style="width:199px;">白血球の低い収率</td><td style="width:199px;">重いRBC汚染、十分ではない全血、凝固</td><td style="width:199px;">二重抗体およびRPMI-BSAボリューム、抗凝固剤を追加し、より多くの血液を収集</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.19 </td><td style="width:199px;">血小板凝集</td><td style="width:199px;"> PGI 2を省略し、冷たいメディア、血漿中の長期保管への暴露</td><td style="width:199px;">血小板の洗浄緩衝液を使用し、室温試薬にPGI 2を追加</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 1.20 </td><td style="width:199px;">血小板数の低下</td><td style="width:199px;">主な遠心分離、血小板凝集中の紛失</td><td style="width:199px;">見る1.2と1.19ステップ</td></tr><tr height="66"><td height="66" style="height:67px;width:199px;"> 2.3 </td><td style="width:199px;"> RBC汚染</td><td style="width:199px;"></td><td style="width:199px;"> MACS分離を繰り返します</td></tr></tbody></table> 表2。白血球と血小板の分離、トラブルシューティング。表には、全血およびトラブルシューティングのプロセスを使用してユーザーをガイドすることが解決策の白血球と血小板の細胞単離の間に遭遇する一般的な問題を示しています。

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Bioenergetics and the Oxidative Burst: Protocols for the Isolation and Evaluation of Human Leukocytes and Platelets

血液白血球および血小板は、個体の全体的な生体エネルギー健康のマーカーとして使用されるので、病理学的プロセスと治療の影響を監視する可能性を有することができる。ここでは、ミトコンドリアの機能と、これらの細胞における酸化的バーストを分離し、測定する方法を記載している。

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

Mitochondrial dysfunction is known to play a significant role in a number of pathological conditions such as atherosclerosis, diabetes, septic shock, and ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

37.0K ビュー.  University of Alabama at Birmingham. 血液白血球および血小板は、個体の全体的な生体エネルギー健康のマーカーとして使用されるので、病理学的プロセスと治療の影響を監視する可能性を有することができる。ここでは、ミトコンドリアの機能と、これらの細胞における酸化的バーストを分離し、測定する方法を記載している。 

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LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic pathways requires a model in which external factors can be well controlled, allowing for reproducible and meaningful results. Many studies employ transformed cellular models for these purposes; however, metabolic reprogramming that occurs in many cancer cell lines may introduce confounding variables. For this reason primary cells are desirable, though attaining adequate biomass for metabolic studies can be challenging. Here we show that human platelets can be utilized as a platform to carry out metabolic studies in combination with liquid chromatography-tandem mass spectrometry analysis. This approach is amenable to relative quantification and isotopic labeling to probe the activity of specific metabolic pathways. Availability of platelets from individual donors or from blood banks makes this model system applicable to clinical studies and feasible to scale up. Here we utilize isolated platelets to confirm previously identified compensatory metabolic shifts in response to the complex I inhibitor rotenone. More specifically, a decrease in glycolysis is accompanied by an increase in fatty acid oxidation to maintain acetyl-CoA levels. Our results show that platelets can be used as an easily accessible and medically relevant model to probe the effects of xenobiotics on cellular metabolism.

Here we show isolated human platelets can be used as an accessible ex vivo model to study metabolic adaptations in response to the complex I inhibitor rotenone. This approach employs isotopic tracing and relative quantification by liquid chromatography-mass spectrometry and can be applied to a variety of study designs.

ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

Perturbed mitochondrial metabolism has received renewed interest as playing a causative role in a range of diseases. Probing alterations to metabolic ...

環境学

Assessment of the Metabolic Profile of Primary Leukemia Cells

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic pathways is tested in many types of tumors. Thus, characterization of cancer cell metabolic setup is inevitable in order to target the correct pathway to improve the overall outcome of patients. Unfortunately, in a majority of cancers, the malignant cells are quite difficult to obtain in higher numbers and the tissue biopsy is required. Leukemia is an exception, where a sufficient number of leukemic cells can be isolated from the bone marrow. Here, we provide a detailed protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and subsequent analysis of their metabolic state using extracellular flux analyzer. Leukemic cells are isolated by the density gradient, which does not affect their viability. The next cultivation step helps them to regenerate, thus the metabolic state measured is the state of cells in optimal conditions. This protocol allows achieving consistent, well-standardized results, which could be used for the personalized therapy.

Here we present a protocol for the isolation of leukemic cells from leukemia patients bone marrow and analysis of their metabolic state. Assessment of the metabolic profile of primary leukemia cells could help to better characterize the demand of primary cells and could lead up to more personalized medicine.

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

The metabolic requirement of cancer cells can negatively influence survival and treatment efficacy. Nowadays, pharmaceutical targeting of metabolic ...

がん研究

Measuring Granulocyte and Monocyte Phagocytosis and Oxidative Burst Activity in Human Blood

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides the necessary methodology to add this assay to an exercise immunology arsenal. The first step in this assay is to prepare two aliquots ("H" and "F") of whole blood (heparin). Then, dihydroethidium is added to the H aliquot, and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Next, Staphylococcus aureus (S. aureus) is added to the H aliquot and fluorescein isothiocyanate-labeled S. aureus is added to the F aliquot (bacteria:phagocyte = 8:1), and both aliquots are incubated in a warm water bath followed by a cold water bath. Then, trypan blue is added to each aliquot to quench extracellular fluorescence, and the cells are washed with phosphate-buffered saline. Next, the red blood cells are lysed, and the white blood cells are fixed. Finally, a flow cytometer and appropriate analysis software are used to measure granulocyte and monocyte phagocytosis and OB activity. This assay has been used for over 20 years. After heavy and prolonged exertion, athletes experience a significant but transient increase in phagocytosis and an extended decrease in OB activity. The post-exercise increase in phagocytosis is correlated with inflammation. In contrast to normal weight individuals, granulocyte and monocyte phagocytosis is chronically elevated in overweight and obese participants, and is modestly correlated with C-reactive protein. In summary, this flow cytometry-based assay measures the phagocytosis and OB activity of phagocytes and can be used as an additional measure of exercise- and obesity-induced inflammation.

The purpose of this manuscript is to present a method for measuring monocyte and granulocyte phagocytosis and oxidative burst activity in human blood samples.

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

The granulocyte and monocyte phagocytosis and oxidative burst (OB) activity assay can be used to study the innate immune system. This manuscript provides ...

免疫・感染学

Fast and Specific Assessment of the Halogenating Peroxidase Activity in Leukocyte-enriched Blood Samples

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on the hypotonic lysis of erythrocytes and can be applied to human samples as well as to blood of non-human origin. The small initial sample volume of about 50 to 100 &#181;l makes this method applicable to recurrent blood sampling from small laboratory animals. Moreover, leukocyte enrichment is achieved within minutes and with low material efforts regarding chemicals and instrumentation, making this method applicable in multiple laboratory environments.
Standardized purification of leukocytes is combined with a highly selective staining method to evaluate halogenating peroxidase activity of the heme peroxidases, myeloperoxidase (MPO) and eosinophil peroxidase (EPO), i.e., the formation of hypochlorous and hypobromous acid (HOCl and HOBr). While MPO is strongly expressed in neutrophils, the most abundant immune cell type in human blood as well as in monocytes, the related enzyme EPO is exclusively expressed in eosinophils. The halogenating activity of these enzymes is addressed by using the almost HOCl- and HOBr-specific dye aminophenyl fluorescein (APF) and the primary peroxidase substrate hydrogen peroxide. Upon subsequent flow cytometry analysis all peroxidase-positive cells (neutrophils, monocytes, eosinophils) are distinguishable and their halogenating peroxidase activity can be quantified. Since APF staining may be combined with the application of cell surface markers, this protocol can be extended to specifically address leukocyte sub-fractions. The method is applicable to detect HOCl and HOBr production both in human and in rodent leukocytes.
Given the widely and diversely discussed immunological role of these enzymatic products in chronic inflammatory diseases, this protocol may contribute to a better understanding of the immunological relevance of leukocyte-derived heme peroxidases.

This protocol describes the quick enrichment of leukocytes from small blood samples for a subsequent specific determination of the halogenating peroxidase activity within the cells. The method can be applied to human and non-human material and may contribute to the evaluation of new inflammatory markers.

白血球に富んだ血液サンプル中のハロゲンペルオキシダーゼ活性の迅速かつ具体的な評価

In this paper a protocol for the quick and standardized enrichment of leukocytes from small whole blood samples is described. This procedure is based on ...

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration and differentiation, and cytokine production. All of these events are tightly linked to the energy status of the cell, and therefore studying the energy-producing pathways may give clues about the overall functionality of these cells. The extracellular flux analyzer is a commonly used device for evaluating the performance of glycolysis and mitochondrial respiration in many cell types. This system has been used to study immune cells in a few published reports, yet a comprehensive protocol optimized particularly for lymphocytes is lacking. Lymphocytes are fragile cells that survive poorly in ex vivo conditions. Oftentimes lymphocyte subsets are rare, and working with low cell numbers is inevitable. Thus, an experimental strategy that addresses these difficulties is required. Here, we provide a protocol that allows for rapid isolation of viable lymphocytes from lymphoid tissues, and for the analysis of their metabolic states in the extracellular flux analyzer. Furthermore, we provide results of experiments in which the metabolic activities of several lymphocyte subtypes at different cell densities were compared. These observations suggest that our protocol can be used to achieve consistent, well-standardized results even at low cell concentrations, and thus it may have broad applications in future studies focusing on the characterization of metabolic events in immune cells.

The study of metabolism is becoming increasingly relevant to immunological research. Here, we present an optimized method for measuring glycolysis and mitochondrial respiration in mouse splenocytes, and T and B lymphocytes.

リンパ球における解糖およびミトコンドリア呼吸を分析するために最適化されたプロトコル

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Real-time Monitoring of Mitochondrial Respiration in Cytokine-differentiated Human Primary T Cells

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is indispensable for T cell activation, and the survival of memory T cells is dependent on mitochondrial remodeling. Consequently, this affects the long-term clinical outcome of cancer immunotherapies. Changes in T cell quality are often studied by flow cytometry using well-known surface markers and not directly by their metabolic state. This is an optimized protocol for measuring real-time mitochondrial respiration of primary human T cells using an Extracellular Flux Analyzer and the cytokines IL-2 and IL-15, which differently affect T cell metabolism. It is shown that the metabolic state of T cells can clearly be distinguished by measuring the oxygen consumption when inhibiting key complexes in the metabolic pathway and that the accuracy of these measurements is highly dependent on optimal inhibitor concentration and inhibitor injection strategy. This standardized protocol will help implement mitochondrial respiration as a standard for T cell fitness in monitoring and studying cancer immunotherapies.

Metabolic adaptation is fundamental for T cells as it dictates differentiation, persistence, and cytotoxicity. Here, an optimized protocol for monitoring mitochondrial respiration in ex vivo cytokine-differentiated human primary T cells is presented.

サイトカイン分化型ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング

During activation, the metabolism of T cells adapts to changes that impact their fate. An increase in mitochondrial oxidative phosphorylation is ...

Real-Time Measurement of the Mitochondrial Bioenergetic Profile of Neutrophils

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and oxidative burst, and create neutrophil extracellular traps (NETs) for microbial clearance. New insights into the metabolic activities of neutrophils challenge the early concept that they primarily rely on glycolysis. Precise measurement of metabolic activities can unfold different metabolic requirements of neutrophils, including the tricarboxylic acid (TCA) cycle (also known as the Krebs cycle), oxidative phosphorylation (OXPHOS), pentose phosphate pathway (PPP), and fatty acid oxidation (FAO) under physiological conditions and in disease states. This paper describes a step-by-step protocol and prerequirements to measure oxygen consumption rate (OCR) as an indicator of mitochondrial respiration on mouse bone marrow-derived neutrophils, human blood-derived neutrophils, and the neutrophil-like HL60 cell line, using metabolic flux analysis on a metabolic extracellular flux analyzer. This method can be used for quantifying the mitochondrial functions of neutrophils under normal and disease conditions.

We describe stepwise protocols measuring the mitochondrial respiration of mouse and human neutrophils and HL60 cells using the metabolic extracellular flux analyzer.

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

Neutrophils are the first line of defense and the most abundant leukocytes in humans. These effector cells perform functions such as phagocytosis and ...

ミトコンドリア生体エネルギー分析のためのPBMCコレクションと凍結保存

Cryopreservation and Bioenergetic Evaluation of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases and aging. Oxidative phosphorylation plays a decisive role, as it is crucial for the maintenance of energetic homeostasis. PBMCs have been identified as a minimally invasive sample to measure mitochondrial function and have been shown to reflect disease conditions. However, measurement of mitochondrial bioenergetic function can be limited by several factors in human samples. Limitations are the amount of samples taken, sampling time, which is often spread over several days, and locations. Cryopreservation of the collected samples can ensure consistent collection and measurement of samples. Care should be taken to ensure that the parameters measured are comparable between cryopreserved and freshly prepared cells. Here, we describe methods for isolating and cryopreserving PBMCs from human blood samples to analyze the bioenergetic function of the mitochondria in these cells. PBMC cryopreserved according to the protocol described here show only minor differences in cell number and viability, adenosine triphosphate levels, and measured respiratory chain activity compared with freshly harvested cells. Only 8-24 mL of human blood is needed for the described preparations, making it possible to collect samples during clinical studies multicentrally and determine their bioenergetics on site.

著者スポットライト:凍結保存後の末梢血単核細胞における生体エネルギーパラメータの保存 

Isolated peripheral blood mononuclear cells can be used for the analysis of immune functions and disorders, metabolic diseases, or mitochondrial functions. In this work, we describe a standardized method for the preparation of PBMCs from whole blood and the subsequent cryopreservation. Cryopreservation makes this time and place independent.

ヒト末梢血単核細胞の凍結保存と生体エネルギー評価

The physiological functions of eukaryotic cells rely on energy mainly provided by mitochondria. Mitochondrial dysfunction is linked to metabolic diseases ...

ヒト白血球と血小板の単離と評価のためのプロトコル：生体エネルギーと酸化バースト

要約

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ミトコンドリア代謝を研究するためのプラットフォームとしてのヒト血小板のLC-MS分析

主な白血病細胞の代謝プロファイルの評価

ヒト血液中の測定顆粒球と単球食作用および酸化バースト活動

白血球に富んだ血液サンプル中のハロゲンペルオキシダーゼ活性の迅速かつ具体的な評価

リンパ球における解糖およびミトコンドリア呼吸を分析するために最適化されたプロトコル

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

サイトカイン分化型ヒト初代T細胞におけるミトコンドリア呼吸のリアルタイムモニタリング

好中球のミトコンドリア生体エネルギープロファイルのリアルタイム測定

ヒト末梢血単核細胞の凍結保存と生体エネルギー評価

ヒト末梢血単核細胞の凍結保存と生体エネルギー評価