この作品は、NIHの助成金R01 DK060581、R01 DK083583（RGMの両方）によって部分的にサポートされていました。

A.材料は、必要なもの：表1（試薬）を参照して準備する前に<ol><li> HBSS（P / S）：100ミリリットル10×HBSS + 900 mlのH 2 0 +1％ペニシリン/ストレプトマイシン（冷蔵庫で保存したり、氷の上に保たれる）。 </li><li> 20パーセントBSAの在庫は水で作られ、小分けして-20℃で保存されている</li><li> HBSS（BSA）：200ミリリットル1X HBSS（P / S）20％のBSA +3 ml（最終BSAの濃度は0.3％である） </li><li>膵島培地：RPMI + 10％FBS + 1％グルタミン+ 1％ペニシリン/ストレプトマイシン</li><li> HISTOPAQUE 1100：240ミリリットル1119 HISTOPAQUE + 200ミリリットル1077 HISTOPAQUE </li><li> 4から0縫合糸（マッケソンは）：2¾インチの小片に切断し、10cmシャーレに格納されている</li><li>楽器：鉗子のすべての3つのペアの鋸歯状の歯が下90°、およびファイルへのファイン科学ツールから鉗子を曲げます。目標は、それらを削除しないように、退屈な歯になります。 </li><li>コラゲナーゼ/プロテアーゼ混合物を投与するためのカニューレ：27G針½インチ、30½インチ針、ピース12インチにカットPE50チューブ。シャープなエッジを持っていない滑らかな丸みを帯びた端に両方の針を下に提出。 PE50チューブのピース12インチの一端に27G針を挿入します。ケーシング¼たびにターンを回し、プライヤーでケーシングを粉砕することによりケーシングから30G針を外します。ケーシングからプライヤーで針を外して、解剖顕微鏡下PE50チューブのもう一方の端に挿入します。あなたはPE50チューブに針を挿入すると、チューブをねじらないようにしてください。 27G針を使用すると、コラゲナーゼのシリンジを添付することは終わりです。 </li><li>コラゲナーゼ（CI zyme MA）および中性プロテアーゼ（CI zyme BP）。メーカーの指示に従って再構成TDE。酵素活性の濃度を算出する分析多くの特定の証明書を参照してください。再構成されたコラゲナーゼ35万コラーゲン分解活性（CDA）の単位とreconstitの100,000中性プロテアーゼ単位の合計を転送uted BPのコニカルチューブにプロテアーゼ及びHBSS中の15mlの合計（P / S）まで希釈</li></ol> B.ステップバイステップのプロトコル 1。コラゲナーゼ/プロテアーゼ混合物による膵臓のインフレ<ol><li>頸椎脱臼によりマウスを安楽死させる、70％エタノール、任意の解剖ハサミとピンセットで完全に肛門から横隔膜に開いて腹腔内にマウス胴体を飽和させる。 </li><li>解剖顕微鏡のプラットフォーム上にマウスを置きます。 </li><li>盲腸および上行結腸を引き出し、あなたの左に体腔外に設定してください。次の手順の概要は、 図1を参照してください。 </li><li>ダイアフラムに対して肝臓のローブを置き、体腔が十分開いている場合、彼らはそこに残っているはずです。肝動脈、門脈および湾曲鉗子で十二指腸を把持することにより肝臓につながる胆管の束を見つける。湾曲した鉗子の別のペアを使用すると、動脈、静脈の下に到達し、ダクトBUndleや動脈、静脈、胆管の下4から0縫合糸の部分インチ¾2を引き、一度それを結ぶ、できるだけ肝臓の近くにタイトな引き出します。 </li><li>湾曲した鉗子の2ペアを使用して、慎重に十二指腸をつかむと、乳頭で十二指腸に接続されている胆管を見つける。乳頭に近い胆下膵臓および結合組織の右側を通って突くために鉗子のはさみを使用しています。穴を作り、それから通って鉗子のトング両方を入れて、4から0縫合糸の別の2¾インチの部分を介して取得し、それを一度結ぶと小さな円に引いたが、タイトな引っぱらずに臓器を素早くあなたの鉗子を突く。 </li><li> 90°鉗子及び超微細Vannasはさみに変更します。胆管がピンと張ったようになるまで90℃鉗子で、慎重に小腸をつまんで引っ張る。腸内にオープンハサミを刺してから、1つのモーションで切断してハサミで乳頭を挟んで水平にカットしておきます。唯一のoを作ってみるneは乳頭から胆管が外れずに乳頭を横切る。 </li><li>それでも90°鉗子で腸を押さえながら、胆管の長さの半分までの胆管にカニューレを挿入し、静かにカニューレの周りにタイトな縫合糸を引き出します。 </li><li>コラゲナーゼ/プロテアーゼ混合物の2.0ミリリットルを3 mlシリンジを埋め、ゆっくりと、一定のペースでカニューレ内に注入します。 </li><li>膵臓のインフレが完了した後、胆管からカニューレを取り外し、下行結腸から開始して、腸をプルアップするように結合組織を切り取ることによって膨張した膵臓を除去するために湾曲した湾曲した鉗子と春のはさみを使用しています。あなたが胆管に到達するまで、腸から膵臓の削除を続行し、その後、その後脾臓から胃膵臓を削除してから、腹腔の内臓から。縫合糸を離れて切り取ることによって除去を完了します。 HBSSの5ミリリットルを含む50 mlチューブに膵臓を追加（P / S）。このチューブは氷の上になければなりません。 </li><li>最大4つの動物にそれぞれの動物については、上記の手順を繰り返します。最適な結果を得るためには、一度に4つしか膵臓を解離させる。最初の4つは、37℃の水浴中であるが、典型的には、我々は別の4膵臓を膨らませる。 </li></ol> 2。膵臓解離<ol><li> 15分間37℃の水浴中に膵臓を含む50 mlチューブを置きます。 </li><li>優しくチューブを揺すると組織解離をチェックするには、蓋で管を保持している間に組織は渦管を次に、簡単にバラバラに12回来てください。 </li><li>最大30 HBSS（BSA）は（これは遠心分離工程のために管のバランスをとるために必要とされるどのくらいに応じて、低量であってもよい）のmlと1分間290×gで遠心分離器を追加します。 </li><li>注意深く上清を吸引除去し、細胞ペレットを妨害しないように、下部に上清（2-3 ml）を少量にしておきます。 </li><li> 30ミリリットル注射器を使用してATTAC14G針にHED、HBSS（BSA）の10以上のミリリットルを追加し、2回ダウンサスペンションを吸引し。 </li><li> 50 mlチューブにプラスチック製の茶こしを通して細胞混合物を濾過し、別の10ミリリットルHBSS（BSA）ですすいでください。 </li><li> 2分間、330×gで遠心分離します。 </li><li>デカントで上清と1分間吸収紙タオルの上に排出するためのチューブを反転させる。 </li><li> 10ミリリットル冷たい1100 HISTOPAQUEで各チューブを再懸濁します。 </li><li> 10ミリリットルHBSS（BSA）でHISTOPAQUEをオーバーレイし、18分間、900×gで遠心分離します。 </li><li>大口径25mlのピペットを用いて上清の全体の20ミリリットルを取り外し、反転70μmのフィルターを通過し、上清を渡す。 </li><li>皿の上に右側を持ち上げながらフィルターを通して10mlの膵島メディアをピペッティングにより10cmペトリ皿に小島をすすぐ。 </li><li>実験の準備が整うまでは文化37℃、5％CO 2の組織培養インキュベーター内膵島を。典型的には、島を手摘みされ、exper前に数えimentation。 </li></ol> 3。代表的な結果膵島収量、形態、品質は膵島分離の成功を判断するために使用される一般的なパラメータである。我々の手では、平均のC57BL / 6マウスからの膵島収量は、このプロトコルを（表2を参照）を使用して150から250膵島の範囲にあり、最適化されたシグマXI型コラゲナーゼを用いて得られたデータに匹敵する。しかし、利回りは使用マウス系統とマウスの年齢に応じて変えることができる。我々は採用して動物のほとんどは8-16週齢の範囲でこのプロトコルは、C57BL / 6（180から250の小島/マウス）、CD1（200-300小島/マウス）、129 /を含む、複数のマウス系統でテストされていますアールB6（200-300小島/マウス）、BLKS-db/db（120から200の小島/マウス）、NOD（10週齢、100から150の小島/マウス）、およびNOD-SCID（100-150小島/マウス）。典型的な膵島の形態は、小島が比較的均一な大きさ（サイズunifものの持つ楕円形状にラウンドを持っている、 図2に示されているormity）がひずみにひずみから変えることができます。 図3のC57BL /精製TDES対シグマXI型コラゲナーゼを用いて単離された6マウスの膵島からグルコース刺激インスリン分泌の私たちの代表的な分析を示している。典型的には、2.5mMのグルコースで観察されるものより6から20倍である25mMグルコースにおけるインスリン刺激で高品質の膵島準備結果。その他のアプリケーションはまた、単離された膵島の品質をテストするために使用され、これらは他の11の間でperifusion技術の使用は、Ca 2 +イメージング（Fura2付き）、逆転写PCRを含めることができます。 <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。胆管カニュレーションの要約。 <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。 24時間以下の分離であるC57BL / 6小島の典型的な外観。画像は内に取得した40Xの倍率でverted顕微鏡。 <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。 C57BL / 6マウス膵島のグルコース刺激インスリン分泌。24時間以下の分離では、100島を37℃で1時間で2.5 mMのグルコースを含むクレブス-リンガーHEPES緩衝溶液中で12ウェルディッシュ中でインキュベートした。小島は、その後、上清を二部位免疫酵素免疫測定法（ELISA）（クリスタルケム）を使用してインスリン測定のために収集された後に、追加の時間2.5mMのグルコースでクレブス - リンガーHEPESに移した。同じ島はその後、25mMのグルコースを含むクレブス - リンガーHEPES緩衝液に移し、培地へのインスリン放出がインキュベーションの1時間後にELISA法により測定した。

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	<li>Li, D. -. S., Yuan, Y. -. H., Tu, H. -. J., Liang, Q. -. L., Dai, L. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas.">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+pancreatic+islet+isolation.">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255 (2007).</li><li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation.">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li><li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation.">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , (2012).</li><li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation.">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li><li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets.">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li><li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting.">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li><li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics:+comparison+study+with+Ficoll,+iodixanol+and+dextran.">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li><li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment.">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li><li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PPAR-{gamma}+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure.">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li></ol>

NDSは、土、RGMは開示することは何もありません。著者AGBはVitaCyteで採用されています。著者RCMはVitaCyteにおける所有持分を有しています。

このプロトコルでは、ランゲルハンス島を単離することを目標に、カニュレーション、コラゲナーゼ灌流、及びネズミの膵臓の解離のために私たちの手順を説明してきました。技術的には、我々の方法は、一度マスターして、動物の安楽死の4分以内に膵臓の分離を可能にする必要があり、1時間することで、単一の動物から膵島の分離をもたらすべきである。技術の速さは、それによって3000小島までの分離で、その結果、私たちは典型的なストレッチで12匹までから膵島を分離することができます。 コラゲナーゼの粗調製物を使用する他のプロトコルとは異なり、我々のプロトコルは、精製されたプロテアーゼは、CI zymeコラゲナーゼマサチューセッツおよびCI zyme BPのプロテアーゼの使用を特徴とする。市販されているTDE製剤の一貫性のばらつきは各ロットは個別に一般的に使用する前にテストされ、最適化されている必要があります。このロット間変動は、私たちはプリの使用を考慮するために導いVitaCyteからfied TDES。これらの高度に精製されたTDESは敏感な蛍光標識基質アッセイの使用を含む複数の方法によって特徴づけられる。蛍光CDAのアッセイが劣化天然コラーゲンで異なる動態を持っコラゲナーゼの異なる分子形態の影響を受けやすくなります。歴史的なペプチド基質アッセイは、コラゲナーゼの不完全なアセスメントを提供します。複数のメソッドでコラゲナーゼを特徴付けることはロット間の大きい酵素活性を確実にします。 市販のコラゲナーゼ製剤のさまざまな方法を使って、社内テストに基づいて、我々は、精製酵素の組み合わせが再現可能なロットの結果をもたらしたことがわかった。最適な酵素組成物を定義した後、このアプリケーションで高度に精製され、厳格に特徴付けTDESを使用する主な利点は、ロット間の性能の一貫性が保証されています。この一貫性は、通常必要とされる多くの資格の労働集約的なプロセスを排除原油または濃縮コラゲナーゼ製品の。精製TDESはまた、異なるマウス系統から回収された膵島の収量と品質を向上させるための組成物の追加の変更を有効にしてください。マウスの異なる系統から膵島を分離するための最適な酵素組成物を報告することは、より効果的に伝達することができます。これは、順番に、実験的なデザインのリソースと柔軟性の向上をより生産的な利用につながる。 我々のプロトコルを使用して、膵島単離の結果に影響を与えることができる多くの重要なステップがあります。第一は、酵素製剤の血中に、膵臓の効果的なインフレ率を達成する必要があります。シリンジに優しい力でインフレを起動して、膵臓が膨らむような力を高めることが重要である。それが腸を移動し、コラゲナーゼ全体臓器を灌流ように膨張時に膵臓を持ち上げておくと便利です。もう一つの重要なステップは、1つは、チューブafteを振るする力である37℃（ステップ2.2）において、rはインキュベーション。私たちは、チューブのキャップかたい膵臓を振ると、膵島の断片化が発生しますが、この段階で機械的解離の任意のフォームなしで、膵島収量が劇的に減少することを見出した。それは、シリンジ（ステップ2.5）との解離工程中に、中レベルの力は、プランジャと上下運動中に適用されることも不可欠ですが、これはフィルタリングステップ（2.6）の前に十分な組織解離を保証し、どこに非常に少ない組織は、茶漉しフィルター上に保持されるべきである。最後に、慎重にフォローするための最後のステップは、HISTOPAQUE画し膵島の全体の20ミリリットルの願いです。小島はHISTOPAQUEし、HBSSの界面に典型的であるが、我々は唯一のインタフェースを削除しようとしたとき私たちは島を失うことを発見したのではなく、我々は今、大口径25mlのピペットを使用することで全体の20ミリリットルを削除します。我々は、cに必要性を排除するために反転さ70μmのフィルター（ステップ2.11）を通して濾過を追加しましたHISTOPAQUEを洗い流すために繰り返し膵島をentrifuge。

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬の名称 </td><td> 会社 </td><td></td><td> カタログ＃ </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td>ライフテクノロジーズ</td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 10から040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td>シグマアルドリッチ</td><td>任意の</td><td></td></tr><tr><td> HISTOPAQUE 1077 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> HISTOPAQUE 1119 </td><td>シグマアルドリッチ</td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4から0縫合糸100ヤードロール</td><td>マッケソン</td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14グラム平滑末端針</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>VannasのスーパーファインSciss </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td>湾曲した春のはさみ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td>湾曲した鉗子（2） </td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td>湾曲した鉗子（90°用） </td><td>ファイン科学ツール</td><td> 11052から10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2インチ針</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G 1/2インチ針</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PEの管</td><td>ベクトン·ディッキンソン</td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td>コラゲナーゼマサチューセッツ</td><td> Vitacyte、LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BPプロテアーゼ</td><td> Vitacyte、LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3ミリリットルのシリンジ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30mlのシリンジ</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70μmのフィルター</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10cm 2のペトリ皿</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td>プラスチック製の茶こし</td><td>どんなキッチンサプライ</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表1試薬および器具 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> シグマXI型 （l010M8618） </td><td> MA（100615） BP（110329） </td><td> MA（081104） BP（100823） </td><td> MA（091211） BP（101109） </td></tr><tr><td> 216（±74） </td><td> 260（±45） </td><td> 157（±37） </td><td> 200（±4） </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 表2異なるTDEロット*を使用して平均膵島収量（±SD） ※データは、少なくとも10匹のマウスの平均膵島収量を表す。括弧内のロット番号</td></tr></tbody></table>

mouse islet of langerhans isolation using a combination of purified collagenase and neutral protease

β細胞の遺伝子発現とin vitroでの機能の尋問は、真正面から、げっ歯類の腫瘍形成性細胞株の研究から単離されたげっ歯類の小島の研究に長年にわたってシフトしている。主要な島は、彼らがより忠実に細胞内シグナル伝達経路および分泌応答の生物学を反映していることの明確な利点を提供します。組織解離酵素（TDE）の製剤を用いた膵島分離の方法は、多くの実験室1月4日に設立されているのに対して、任意のげっ歯類の系統から膵島収量と品質の一貫性の変動は、主膵島研究の範囲と実現可能性を制限します。これらの変化はしばしば膵島分離手順で使用される部分的に精製された原油TDESの結果として発生します。頻繁に活動のロット間のばらつきを示し、多くの場合、使用する酵素の投与量の調整が必要になるTDES。レポートの数が少ないの齧歯類の細胞単離のためのTDES 5,6を精製し使用している</supは&gt;が​​、実際には、ヒト膵島単離のためのTDES、精製の日常的な使用と利点にもかかわらず普及していない。 VitaCyte、LLC（インディアナポリス、インディアナ州）と共同で、我々は、を介して粗組織分画に続いTDESをマウスの膵管に直接灌流されている後藤7,8、、によって記載されたものに基づいて修正されたマウスの膵島単離プロトコルを開発HISTOPAQUE勾配9、および精製された膵島の単離。我々のプロトコルには有意差は、精製されたコラゲナーゼ（CI zyme MA）および中性プロテアーゼ（CI zyme BP）の組み合わせを使用することである。コラゲナーゼは、基板6のように蛍光標識された水溶性の子牛の皮の繊維を利用して6蛍光コラーゲン分解活性（CDA）のアッセイの使用によって特徴づけられた。それは基質として天然コラーゲンに依存しているので、この基板は、組織マトリックスにおけるコラーゲン分解の動力学のより予測です。プロテアーゼはchであった感受性蛍光カイネティックアッセイ10でaracterized。より伝統的な生化学的な分析とともに、これらの改善されたアッセイを活用することでロット間の改良された性能の一貫性につながる、より一貫して製造することTDEを有効にしてください。ここで説明されたプロトコルは、最大限の膵島収量およびC57BL / 6マウスを用いて最適な膵島の形態用に最適化された。このプロトコルの開発時には、コラゲナーゼと中性プロテアーゼのいくつかの組み合わせが異なる濃度で評価し、コラゲナーゼの最終比：35:10の中性プロテアーゼ、シグマXI型に匹敵する酵素の性能を表しています。ラットやマウスの異なる株から平均膵島収量の大幅な変動が報告されているので、TDEの組成物の追加変更は、異なる種や菌株から回収された膵島の収量と品質を向上させるためになされるべきである。

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Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

マウス膵島分離の詳細な説明はコラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製組み合わせのin situ膵管カニュレーションと灌流の技法を用いて説明する。

コラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製の組合せを用いて単離ランゲルハンスマウスの膵島

The interrogation of beta cell gene expression and function in vitro has squarely shifted over the years from the study of rodent tumorigenic cell lines ...

mouse-islet-langerhans-isolation-using-combination-purified

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

43.3K ビュー.  Indiana University School of Medicine. マウス膵島分離の詳細な説明はコラゲナーゼと中性プロテアーゼの精製組み合わせのin situ膵管カニュレーションと灌流の技法を用いて説明する。

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Murine Pancreatic Islet Isolation

マウス膵島単離

生物学

Effective Isolation of Functional Islets from Neonatal Mouse Pancreas

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories due to the large size of the pancreatic duct that allows for ready collagenase injection and subsequent tissue perfusion. In contrast, islet isolation from small pancreata, like that of neonatal mice, is challenging because perfusion is not readily achievable in the small pancreata. Here we describe a detailed simple procedure that recovers substantial numbers of islets from newly born mice with visual assistance. Freshly dissected whole pancreata were digested with 0.5 mg/mL collagenase IV dissolved in Hanks&#39; Balanced Salt Solution (HBSS) at 37 &#176;C, in microcentrifuge tubes. Tubes were tapped regularly to aid tissue dispersal. When most of the tissue was dispersed to small clusters around 1 mm, lysates were washed three to four times with culture media with 10% fetal bovine serum (FBS). Islet clusters, devoid of recognizable acinar tissues, can then be recovered under dissecting stereoscope. This method recovers 20 - 80 small- to large-sized islets per pancreas of newly born mouse. These islets are suitable for most conceivable downstream assays, including insulin secretion, gene expression, and culture. An example of insulin secretion assay is presented to validate the isolation process. The genetic background and degree of digestion are the largest factors determining the yield. Freshly made collagenase solution with high activity is preferred, as it aids in endocrine-exocrine isolation. The presence of cations [calcium (Ca2+) and magnesium (Mg2+)] in all solutions and fetal bovine serum in the wash/picking media are necessary for good yield of islets with proper integrity. A dissecting scope with good contrast and magnification will also help.

We describe a protocol herein for isolating intact islets from neonatal mice. Pancreata were partially digested with collagenase, followed by washing and hand picking. 20 - 80 islet clusters can be obtained per pancreas from newly born mice, which are suitable for several islet studies.

新生児マウスの膵臓からの機能性膵島の効果的な分離

Perfusion-based islet-isolation protocols from large mammalian pancreata are well established. Such protocols are readily conducted in many laboratories ...

発生生物学

Single-cell Transcriptomic Analyses of Mouse Pancreatic Endocrine Cells

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, including insulin-secreting &#946; cells, are differentiated from common endocrine progenitors during the embryonic stage. Immature endocrine cells expand via cell proliferation and mature during a long postnatal developmental period. However, the mechanisms underlying these processes are not clearly defined. Single-cell RNA-sequencing is a promising approach for the characterization of distinct cell populations and tracing cell lineage differentiation pathways. Here, we describe a method for the single-cell RNA-sequencing of isolated pancreatic &#946; cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases.

We describe a method for the isolation of endocrine cells from embryonic, neonatal and postnatal pancreases followed by single-cell RNA sequencing. This method allows analyses of pancreatic endocrine lineage development, cell heterogeneity and transcriptomic dynamics.

マウス膵臓内分泌細胞の単一細胞トランスクリプトーム解析

Pancreatic endocrine cells, which are clustered in islets, regulate blood glucose stability and energy metabolism. The distinct cell types in islets, ...

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

免疫・感染学

Isolation of Lamina Propria Mononuclear Cells from Murine Colon Using Collagenase E

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous antigens and modulate responses to potent microbially derived immune stimuli. For this reason, the intestine is a major target site of immune dysregulation and inflammation in many diseases including but, not limited to inflammatory bowel diseases such as Crohn&#8217;s disease and ulcerative colitis, graft-versus-host disease (GVHD) after bone marrow transplantation (BMT), and many allergic and infectious conditions. Murine models of gastrointestinal inflammation and colitis are heavily used to study GI complications and to pre-clinically optimize strategies for prevention and treatment. Data gleaned from these models via isolation and phenotypic analysis of immune cells from the intestine is critical to further immune understanding that can be applied to ameliorate gastrointestinal and systemic inflammatory disorders. This report describes a highly effective protocol for the isolation of mononuclear cells (MNC) from the colon using a mixed silica-based density gradient interface. This method reproducibly isolates a significant number of viable leukocytes while minimizing contaminating debris, allowing subsequent immune phenotyping by flow cytometry or other methods.

The goal of this protocol is to isolate mononuclear cells that reside in the lamina propria of the colon by enzymatic digestion of the tissue using collagenase. This protocol allows for the efficient isolation of mononuclear cells resulting in a single cell suspension which in turn can be used for robust immunophenotyping.

コラゲナーゼEを用いてマウスコロンからのラミナプロプリア単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞の単核細胞

The intestine is the home to the largest number of immune cells in the body. The small and large intestinal immune systems police exposure to exogenous ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue (ISWAT) Transplantation Model of Murine Islets

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for islet transplantation in rodent models. However, the tight kidney capsule limits the transplantation of sufficient islets in large animals and humans. The inguinal subcutaneous white adipose tissue (ISWAT), a new subcutaneous space, was found to be a potentially valuable site for islet transplantation. This site has better blood supply than other subcutaneous spaces. Moreover, the ISWAT accommodates a larger islet mass than the kidney capsule, and transplantation into it is simple. This manuscript describes the procedure of mouse islet isolation and transplantation in the ISWAT site of syngeneic diabetic mouse recipients. Using this protocol, murine pancreatic islets were isolated by standard collagenase digestion and a basement membrane matrix hydrogel was used for fixing the purified islets in the ISWAT site. The blood glucose levels of the recipient mice were monitored for more than 100 days. Islet grafts were retrieved at day 100 after transplantation for histological analysis. The protocol for islet transplantation in the ISWAT site described in this manuscript is simple and effective.

Inguinal Subcutaneous White Adipose Tissue ISWAT Transplantation Model of Murine Islets

In this protocol, a method of murine islet isolation and transplantation into the inguinal subcutaneous white adipose tissue is described. Isolated syngeneic murine islets are transplanted into a murine recipient using a basement membrane hydrogel. The blood glucose level of the recipients is monitored, and histology analysis of the islet grafts is performed.

マウス島の口内皮下白色脂肪組織(ISWAT)移植モデル

Pancreatic islet transplantation is a well-established therapeutic treatment for type 1 diabetes. The kidney capsule is the most commonly used site for ...

医学

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Isolation and Characterization of Mouse Primary Liver Sinusoidal Endothelial Cells

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. LSECs have a distinct morphology characterized by the presence of fenestrae and the absence of basement membrane. LSECs play essential roles in many pathological disorders in the liver, including metabolic dysregulation, inflammation, fibrosis, angiogenesis, and carcinogenesis. However, little has been published about the isolation and characterization of the LSECs. Here, this protocol discusses the isolation of LSEC from both healthy and nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD) mice. The protocol is based on collagenase perfusion of the mouse liver and magnetic beads positive selection of nonparenchymal cells to purify LSECs. This study characterizes LSECs using specific markers by flow cytometry and identifies the characteristic phenotypic features by scanning electron microscopy. LSECs isolated following this protocol can be used for functional studies, including adhesion and permeability assays, as well as downstream studies for a particular pathway of interest. In addition, these LSECs can be pooled or used individually, allowing multi-omics data generation including RNA-seq bulk or single cell, proteomic or phospho-proteomics, and Assay for Transposase-Accessible Chromatin using sequencing (ATAC-seq), among others. This protocol will be useful for investigators studying LSECs&#39; communication with other liver cells in health and disease and allow an in-depth understanding of the role of LSECs in the pathogenic mechanisms of acute and chronic liver injury.

Here we outline and demonstrate a protocol for primary mouse liver sinusoidal endothelial cell (LSEC) isolation. The protocol is based on liver collagenase perfusion, nonparenchymal cell purification by low-speed centrifugation, and CD146 magnetic bead selection. We also phenotype and characterize these isolated LSECs using flow cytometry and scanning electron microscopy.

マウス初代肝臓正弦波内皮細胞の単離と特性評価

Liver sinusoidal endothelial cells (LSECs) are specialized endothelial cells located at the interface between the circulation and the liver parenchyma. ...

<meta charset="utf8"></head><body>疾患研究のためのマウス膵臓内皮細胞抽出の合理化

Isolation of Mouse Pancreatic Endothelial Cells

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and glucagon, as well as digestive enzymes. The pancreas is also a highly vascularized organ, a feature facilitated by the intricate network of pancreatic capillaries. This extensive capillary network is made up of highly fenestrated endothelial cells (ECs) important for pancreas development and function. Accordingly, the dysfunction of ECs can contribute to that of the pancreas in diseases like diabetes and cancer. Thus, researching the function of pancreatic ECs (pECs) is important not only for understanding pancreas biology but also for developing its pathologies. Mouse models are valuable tools to study metabolic and cardiovascular diseases. However, there has not been an established protocol with sufficient details described for the isolation of mouse pECs due to the relatively small population of ECs and the abundant digestive enzymes potentially released from the acinar tissue that can lead to cell damage and, thus, low yield. To address these challenges, we devised a protocol to enrich and recover mouse pECs, combining gentle physical and chemical dissociation and antibody-mediated selection. The protocol presented here provides a robust method to extract intact and viable ECs from the whole mouse pancreas. This protocol is suitable for multiple downstream assays and may be applied to various mouse models.

<meta charset="utf8"></head><body>マウス膵臓内皮細胞の単離

This protocol describes the isolation of mouse endothelial cells from whole pancreas.

マウス膵臓内皮細胞の単離

The pancreas is a vital organ for maintaining metabolic balance within the body, in part due to its production of metabolic hormones such as insulin and ...