著者らは、土地、バーデン·ヴュルテンベルク州とアオイ連合ユーロぺフォンエリーゼのためダイエオリエEntwicklungに感謝-資金ZAFH光子N、無資金研究助成金のためにエリーゼのためBundesministerium Bildung undのForschung（BMBF）のために。 1792C08ならびにプロジェクト &quot;Auramiを&quot;資金調達のためのバーデン·ヴュルテンベルク·財団社。

1。細胞の播種およびインキュベーション<ol><li>シード個々の細胞、 例えば U373-MGまたはU-251-MGの神経膠芽腫細胞をスライドガラス上に100細胞/ mm 2の典型的な密度にする（ 例えば RPMI-1640、10％ウシ胎児血清を添加した培地中で4872時間のためにそれらを育てると抗生物質）で37℃、5％CO 2のインキュベーターを用いた。 </li><li> 8μM（培地中の）4、または細胞質マーカーの濃度で60分間適用例 6-ドデカノイル-2 -ジメチルナフタレン（laurdan）、膜マーカーで細胞をインキュベートし、 例えばカルセインacetomethlyesterは、少なくとも40分間印加4,5;5μMの3、または光増感膜関連の濃度は、 例えば、プロトポルフィリンIXは、その前駆体5 -アミノレブリン酸（1mMの5-ALA）を用いて4時間のインキュベーションの際に誘導した。 </li><li>蛍光顕微鏡の前に緩衝生理食塩水（PBS）培地またはリン酸で細胞を洗浄。&lt;/ LI&gt; </ol> 2。 VA-TIRFM <ol><li>正立顕微鏡、 例えばツァイスAxioplanを使用しており、文献に記載されているように、照明装置によって、そのコンデンサーを交換してください。半球状または光学的にオブジェクトをスライドします （ 図1を参照）に結合された半円筒形のガラスプリズムで3。 </li><li>その試料の表面（テレセントリック瞳孔線）上の平行ビームでガラスプリズム、さらに光学部品（ 例えば凹面鏡）による撮影後、再び結果並列コリメートされたレーザービームを使用しています。電場ベクトルが入射面に垂直偏光であるように注意してください。 </li><li>試料面に結像されると発生率（オブジェクトの線）の可変角度で試料に照射されるコンデンサーの内部に位置調整可能なミラーを使用しています。 goniometric測定3によって決定された調整可能なミラーは、それぞれの位置は入射よく定義された角度に対応するステップモータによって駆動することができる</&gt;（商標）。 </li><li> ΘC = 61.3°ガラス-水移行のための固定値として臨界角を使用して調整可能なミラーの角度位置のキャリブレーションを行います。 Θcは蛍光色素（ 例えば 1mMのフラビンモノヌクレオチド、FMN）を水に溶解させ、Θの変化に応じて可視化することができる。でミラーの位置Θ=ΘCミラー位置決めプログラムに格納されています。 </li><li>温度、ゲイン、録音時間と変速速度を含むカメラのパラメータを指定します（バック点灯アンドールIXON EMCCD、DV887DC、アンドールテクノロジー、ベルファースト、イギリス6）、設定します。 </li><li>適切な倍率と優先的に適度な開口数（ 例えば、40×/ 63×0.75 / 0.90水浸）の対物レンズを使用し、顕微鏡内のオブジェクトのスライドをローカライズします。ガラスプリズムと試料の光学的接触を確実にするためにイマージョンオイルを使用しています。の変動により、同一試料の蛍光画像を記録照明の角度（Θ≥ΘΘCとCセル-ガラス界面のための64.5°に対応）。 0.5°または1°刻みで66°-74°の角度範囲が推奨されます。蛍光検出のための適切なロングパスまたはバンドパス·フィルタを使用します。 </li></ol> 3。データ解析<ol><li>様々な角度Θと同様、カメラの設定（背景差別のために）、励起波長とガラス（N 1 = 1.52）と細胞（N 2 = 1.37）に対する屈折率で記録された画像（ 例えば 、ASCIIフォーマットで）読み込む評価プログラム（; NanoCell LabViewの）に挿入します。各パラメータセット浸透深さd（Θ）と透過率のためにTは（Θ）は自動的に計算されます。 </li><li>細胞 - 基質距離Δは式（5）（膜マーカー）または式（4）（細胞質マーカー）によると、不均質を有する個々の画像の評価に使用される画像を選択照明（顕E、G。ストライプ）が除外されることがあります。 </li><li>細胞 - 基質トポロジーの画像を計算して表示するのに適したカラーコードを選択します。 図2に示すように、個々の画素の評価プロファイルの間に、表示させることができます。これらのプロファイルは、フィットの質の指標として用いることができる。 </li><li>評価プロトコルを格納します。 </li></ol> 4。代表的な結果代表的な実験は、親切教授ヤンモレンハウアー、分子腫瘍学専攻、南デンマーク大学、オーデンセによって供給される遺伝子組み換えU251-MGの神経膠芽腫細胞を用いて行われる。それらのU251細胞のサブクローン2腫瘍抑制遺伝子でTP53またはPTENはテトオン誘導性発現系、これらの細胞が減少し腫瘍形成の可能性を発揮し、より少ない悪性とみなすことができること等を用いて過剰発現されています。抑制遺伝子のない高悪性U251-MG細胞を対照として用い、およびU251-アールMGは野生型細胞は、さらに比較のために役立つ。 （;：391 nmで、パルスエネルギー：12 PJ、繰り返し率：波長ドライバーPDL 800-B Picoquant、ベルリン、ドイツでLDH400 40 MHz）をピコ秒光パルスの準連続シリーズを発するレーザダイオードを励起光源として使用されます。 図において、活性化されたTP53腫瘍抑制遺伝子を持つとlaurdan（8μM、60分）と一緒にインキュベートU251-MGの神経膠芽腫細胞の3 TIRFM画像は、66.0°の入射角69.0°、73.0°の侵入深さに対応するために描かれているそれぞれ約140nm、75 nmおよび60 nmのエバネセント電磁界。侵入深さの蛍光の減少に伴って強度が低下（スケールを参照）、細胞のより表面的な部位（その辺で例えばフォーカルコンタクト）に由来する。細胞-基質間距離（0から600 nmの範囲のカラーコードによって図3dで可視化）に強く間のセルにわたって変化LY数ナノメートル（白黄色）と250から300ナノメートル（暗赤色）、 すなわち焦点連絡先やより大きなセル基板の距離はすぐ近くにあります。細胞-基質距離はU251-MG制御と80から100ナノメートル（黄色の典型的な値を持つ野生型細胞のためではなく、一定である同じことが、活性化抑制遺伝子PTEN（ 図4d）とU251-MGの神経膠芽腫細胞のために保持します。 図4b ）と150から200ナノメートル（橙赤色、 図4a）。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig1.jpg" /> 図1：正立顕微鏡のVA-TIRFM用の照明装置。ステップモータにより駆動される調整可能なミラーが±0.25°の角度分解能を可能にします。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig2.jpg" /> 1つのPIXについては、 図2。評価プロファイルEL（図）。 LN [I、F / Tは（Θ）] 1 / D（Θ）の関数としてプロットすると、傾きは、細胞-基質距離Δを表しています。このスロープは、一般的に±10％程度の精度で決定されます。つの値が - 不均一な照明に起因する - のマークが付けられ、評価から除外されました。 <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/4133/4133fig3.jpg" /> 照明の様々な角度（AC）で記録され、示されて0から600 nmの範囲で細胞-基質間の距離。laurdan（60分8μM）とのインキュベーションにより活性TP53抑制遺伝子とU251-MGの神経膠芽腫細胞の図3 TIRFM画像カラーコードにより、（d）は、励起波長：391 nmで検出：≥420 nmで、画像サイズ：210×210μmのμmの<a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4133/4133fig3large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。 図4に、カラーコードで示さ0から600 nmの範囲でU251-MGのglioblatoma細胞の細胞-基質間距離;（a）は野生型（b）管理;活性化抑制遺伝子TP53と（c）の細胞と、（d）活性化抑制遺伝子PTENと細胞;励起波長：391 nmで検出：≥420 nmで、画像サイズ：210×210μmのμmの<a href="http://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/4133/4133fig4large.jpg" target="_blank">拡大図を表示するには、ここをクリックしてください</a> 。

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	<li>Gingell, D., Todd, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interference+reflection+microscopy:+a+quantitative+theory+of+image+interpretation+and+its+application+to+cell-substratum+separation+measurement.">Interference reflection microscopy: a quantitative theory of image interpretation and its application to cell-substratum separation measurement.</a> Biophys. J. 26, 507-526 (1979).</li><li>Reichert, W. M., Truskey, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+(TIRF)+microscopy+(I)+Modelling+cell+contact+region+fluorescence.">Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy (I) Modelling cell contact region fluorescence.</a> J. Cell Sci. 96, 219-230 (1990).</li><li>Stock, K., Sailer, R., Strauss, W. S. L., Lyttek, M., Steiner, R., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM):+realization+and+application+of+a+compact+illumination+device.">Variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM): realization and application of a compact illumination device.</a> J. Microsc. 211, 19-29 (2003).</li><li>Wagner, M., Weber, P., Strauss, W. S. L., Lassalle, H. -. P., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanotomography+of+cell+surfaces+with+evanescent+fields.">Nanotomography of cell surfaces with evanescent fields.</a> Adv. Opt. Technol. 2008, 254317 (2008).</li><li>Lassalle, H. -. P., Baumann, H., Strauss, W. S. L., Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+topology+upon+ALA-PDT+using+variable-angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+(VA-TIRFM).">Cell-substrate topology upon ALA-PDT using variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (VA-TIRFM).</a> J. Environ. Pathol. Toxicol Oncol. 26, 83-88 (2007).</li><li>Coates, C. G., Denvir, D. J., McHale, N. G., Thornbury, K. D., Hollywood, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimizing+low-light+microscopy+with+back-illuminated+electron+multiplying+charge-coupled+device:+enhanced+sensitivity,+speed+and+resolution.">Optimizing low-light microscopy with back-illuminated electron multiplying charge-coupled device: enhanced sensitivity, speed and resolution.</a> J. Biomed. Opt. 9, 1244-1252 (2004).</li><li>Gustafsson, M. G. L., Shao, L., Carlton, P. M., Wang, C. J. R., Golubovskaya, I. N., Cande, W. Z., Agard, D. A., Sedat, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+resolution+doubling+in+wide-field+fluorescence+microscopy+by+structured+illumination.">Three-dimensional resolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structured illumination.</a> Biophys. J. 94, 4957-4970 (2008).</li><li>Betzig, E., Patterson, G. H., Sougrat, R., Lindwasser, O. W., Olenych, S., Bonifacino, J. S., Davidson, M. W., Lippincott-Schwartz, J., Hess, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Hess, S. T., Girirajan, T. P. K., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultra-high+resolution+imaging+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Biophys. J. 91, 4258-4272 (2006).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat. Meth. 3, 793-796 (2006).</li><li>Willig, K. I., Harke, B., Medda, R., Hell, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=STED+microscopy+with+continuous+wave+beams.">STED microscopy with continuous wave beams.</a> Nat. Meth. 4, 915-918 (2007).</li><li>Schneckenburger, H., Wagner, M., Weber, P., Bruns, T., Richter, V., Strauss, W. S. L., Wittig, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-Dimensional+Fluorescence+Microscopy+of+Living+Cells.">Multi-Dimensional Fluorescence Microscopy of Living Cells.</a> J. Biophotonics. 3, 143-149 (2011).</li><li>Dougherty, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitizers:+therapy+and+detection+of+malignant+tumours.">Photosensitizers: therapy and detection of malignant tumours.</a> Photochem. Photobiol. 45, 879-889 (1987).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence.">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J. Cell Biol. 89, 141-145 (1981).</li><li>&#214;lveczky, B. P., Periasamy, N., Verkman, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+fluorophore+distribution+in+three+dimensions+by+quantitstive+multiple+angle+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy.">Mapping fluorophore distribution in three dimensions by quantitstive multiple angle total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Biophys. J. 73, 2836-2847 (1997).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+imaging+of+surface+fluorescence+with+vry+high+aperture+microscope+objectives.">Selective imaging of surface fluorescence with vry high aperture microscope objectives.</a> J. Biomed. Opt. 6, 6-13 (2001).</li><li>Schneckenburger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+microscopy:+technical+innovations+and+novel+applications.">Total internal reflection microscopy: technical innovations and novel applications.</a> Curr. Opin. Biotechnol. 16, 13-18 (2005).</li></ol>

特別な利害関係は宣言されません。

メソッドは、ナノメートルの精度で細胞 - 基質間の距離を測定するために記述されている。現在、 例えば構造化照明7または単一分子検出8-10と同様に誘導放出の枯渇に基づく超解像顕微鏡の方法、（STED）顕微鏡11は、かなりの関心が持たれている。これらの技術はいずれも、しかし、50 nm以下の軸方向の分解能を可能にしていません。また、50100 W / cm 2?...

屈折率n 1の媒質中を伝搬する光ビームが屈折率n 2の第2の媒質へのインターフェースを満たしたときに、&lt;nの1、全反射は、臨界角より大きい発生率Θのすべての角度で発生ΘC =アークサイン（N 2 / N 1）。全く反映されているにもかかわらず、入射光ビームは、I（Z）= I 0 EZ / D（Θ）に従ってインターフェイスから垂直距離zで指数関数的に減衰し、第二の媒体に浸透エバネセント電磁界を彷彿とさせます。で与えられるように私は（z）は、波長λにおける浸透深さに電磁場の強度に対応するとd（Θ） D（Θ）=（λ/4π）（N 1 2罪Θ2 - N 2）-1 / 2 文献1,2に報告されているように、私は0 </sUB&gt;は入射光の強度に対応して、私はeが透過率T（Θ）と比n 2 / nは1で乗算。この光の電場ベクトルが入射面（入射と反射ビームによって張ら平面をIE）に対して垂直に偏光である場合は、この透過率は次式で与えられます。 T（Θ）= 4 cosの2Θ/ [1 - （N 2 / NL 1）2] TIRFM測定で検出された蛍光強度は、光吸収は、サンプルのすべての層の上に統合されており、検出Ωの立体角と同様に、関連する色素の蛍光量子収率ηと乗算する必要があります。以前に3報告したように、この強度は次のように記述することができます I F（Θ）=（Θ）OC（z）での電子のz / D（Θ）DZ もし独立したfはすべての要因<html>蛍光色素の濃度c（z）はほぼ一定であるとみなされた場合ROM入射角Θと座標zは実験定数Aの式（3）内に含まれているが、解析的に解くことができます -いずれかのすべての座標のz≥Δ、界面からの距離Δを有する細胞の細胞質内に例えばで。この場合、積分はz =Δがために、Z =∞の結果から計算しなければならない 私はF = A C T（Θ）はD（Θ）のe-Δ/ D（Θ） -インタフェースから距離Δに位置するT / 2とz =Δ+ T / 2、厚さtの薄い層内すなわち 、 例えば細胞膜-またはz =Δの間。この場合、蛍光強度は次のように計算できます 私はF = A C T（Θ）TE-Δ/ D（Θ）は 、 トンはΔに比べて小さい場合。 ENT &quot;&gt;蛍光強度の画像は私がFを Θ、およびln IF可変角度（I、F / T d）は（式4）のために記録されている場合、式（4）及び（5）細胞-基質距離からΔは、計算することができます。またはLN（I、F / T）（式5）は、これらの角度の1 / dの関数として評価されます。本稿で用いる膜マーカーlaurdan（S.以下）については評価は式5に準じて行った。 画像収集と評価が必要では、以前に報告したように3 - サンプルの上に励起光の均一な分布、 - 2層モデルの妥当性（基質と細胞質の屈折率n 1とn 2と、それぞれ）。原形質膜が非常に薄い場合には、保持しており、細胞外培地（セルと基板との間）の層は、入射光の波長に比べて小さい場合。 加えて、適度な開口数（通常≤0.90）顕微鏡対物レンズのは、誘電体の界面近傍界での放射の異方性に起因する輝度のばらつきを避けるために有利である。

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> タイプ </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>ヌンク</td><td>ヌンクCellstar QM1300SVBA </td><td></td></tr><tr><td>層流</td><td>セーフHolten </td><td> S2010 1.2 EN GG 1LN </td><td></td></tr><tr><td> DMEM +10％FCS + 1％ペニシリン/ストレプトマイシン</td><td> BIOCHROM </td><td></td><td>培養媒体</td></tr><tr><td>ガラスのオブジェクトのスライド</td><td> Marienfeld </td><td>純粋な白ガラス</td><td>使用される特殊なクリーニング手順</td></tr><tr><td> 6-ドデカノイル-2 - ジメチルナフタレン（laurdan） </td><td>分子プローブ</td><td></td><td>蛍光マーカー（ストック溶液：エタノールさ2mm） </td></tr><tr><td>顕微鏡</td><td>カールツァイス</td><td> Axioplan 1 </tD&gt; <td></td></tr><tr><td>半導体レーザー</td><td> PicoQuant </td><td>ドライバのPDL 800-BとLDH 400 </td><td>波長：391 nmの</td></tr><tr><td>シングルモード光ファイバシステム</td><td>点光源</td><td> kineFlex </td><td>平行光学系と一緒に使用</td></tr><tr><td> EMCCDカメラ</td><td>アンドール</td><td> DV887DC </td><td>戻る照らさカメラ</td></tr></tbody></table>

nanotopology of cell adhesion upon variable-angle total internal reflection fluorescence microscopy (va-tirfm)

表面トポロジー、基板上に成長する細胞の例は 、可変アングル全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で決定されます。細胞は透明なスライド上で培養し、均一にそれらの形質膜に分布する蛍光マーカーと共にインキュベートする。照明はエバネセント電磁界の様々な侵入深さを持つ内部全反射（TIR）の可変角度の下で平行レーザビームによって発生します。約10異なる角度で照射により蛍光画像の記録は、数ナノメートルの精度で細胞 - 基質の距離を計算することを可能にする。種々の細胞株、 例えばがん細胞と少ない悪性細胞との間の密着性の違いは、このように決定されています。また、化学的又は光線力学的治療の際の細胞接着の変化の可能性を調べることができます。超解像顕微鏡光曝露の他の方法と比較して保持されます生きている細胞の非常に小さい、無被害が発生することが予想されています。

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Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy VA-TIRFM

基板上への細胞接着のトポロジーは、可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で測定されます。

可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）の際に、細胞接着のナノトポロジー

Surface topology, e.g. of cells growing on a substrate, is determined with nanometer precision by Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence ...

nanotopology-cell-adhesion-upon-variable-angle-total-internal

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Nanotopology of Cell Adhesion upon Variable-Angle Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (VA-TIRFM)

10.1K ビュー.  Institut für Angewandte Forschung. 基板上への細胞接着のトポロジーは、可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）によってナノメートルの精度で測定されます。

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Investigating Single Molecule Adhesion by Atomic Force Spectroscopy

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. At the same time the AFM tip is passivated to prevent unspecific interactions between the tip and the substrate, which is a prerequisite to study single molecules attached to the AFM tip. Analyses to determine the adhesion force, the adhesion length, and the free energy of these molecules on solid surfaces and bio-interfaces are shortly presented and external references for further reading are provided. Example molecules are the poly(amino acid) polytyrosine, the graft polymer PI-g-PS and the phospholipid POPE (1-palmitoyl-2-oleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine). These molecules are desorbed from different surfaces like CH3-SAMs, hydrogen terminated diamond and supported lipid bilayers under various solvent conditions. Finally, the advantages of force spectroscopic single molecule experiments are discussed including means to decide if truly a single molecule has been studied in the experiment.

A protocol to couple a large variety of single molecules covalently onto an AFM tip is presented. Procedures and examples to determine the adhesion force and free energy of these molecules on solid supports and bio-interfaces are provided.

原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

Atomic force spectroscopy is an ideal tool to study molecules at surfaces and interfaces. An experimental protocol to couple a large variety of single ...

工学

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

生物工学

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. Total-internal-reflection-fluorescence (TIRF) microscopy has a high signal-to-background ratio, but it suffers from photobleaching and photodamage of the fluorescent proteins. Label-free techniques such as interference reflection microscopy (IRM) and interferometric scattering microscopy (iSCAT) circumvent the problem of photobleaching but cannot readily visualize single molecules. This paper presents a protocol for combining IRM with a commercial TIRF microscope for the simultaneous imaging of microtubule-associated proteins (MAPs) and dynamic microtubules in vitro. This protocol allows for high-speed observation of MAPs interacting with dynamic microtubules. This improves on existing two-color TIRF setups by eliminating both the need for microtubule labeling and the need for several additional optical components, such as a second excitation laser. Both channels are imaged on the same camera chip to avoid image registration and frame synchronization problems. This setup is demonstrated by visualizing single kinesin molecules walking on dynamic microtubules.

We present a protocol for implementing interference-reflection microscopy and total-internal-reflection-fluorescence microscopy for the simultaneous imaging of dynamic microtubules and fluorescently labeled microtubule-associated proteins.

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

生化学

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and regulated by different suites of binding proteins unique for each polymer. Many studies now demonstrate that the dynamics of both cytoskeletal polymers are intertwined and that this crosstalk is required for most cellular behaviors. A number of proteins involved in actin-microtubule interactions have already been identified (i.e., Tau, MACF, GAS, formins, and more) and are well characterized with regard to either actin or microtubules alone. However, relatively few studies showed assays of actin-microtubule coordination with dynamic versions of both polymers. This may occlude emergent linking mechanisms between actin and microtubules. Here, a total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy-based in vitro reconstitution technique permits the visualization of both actin and microtubule dynamics from the one biochemical reaction. This technique preserves the polymerization dynamics of either actin filament or microtubules individually or in the presence of the other polymer. Commercially available Tau protein is used to demonstrate how actin-microtubule behaviors change in the presence of a classic cytoskeletal crosslinking protein. This method can provide reliable functional and mechanistic insights into how individual regulatory proteins coordinate actin-microtubule dynamics at a resolution of single filaments or higher-order complexes.

Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence TIRF Microscopy

This protocol is a guide for visualizing dynamic actin and microtubules using an in vitro total internal fluorescence (TIRF) microscopy assay.

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

Traditionally, the actin and microtubule cytoskeletons have been studied as separate entities, restricted to specific cellular regions or processes, and ...

Visualizing Adhesion Formation in Cells by Means of Advanced Spinning Disk-Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to visualize these highly dynamic events, two complementary light microscopy techniques that allow fast imaging of live samples were combined: spinning disk microscopy (SD) for fast and high-resolution volume recording and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy for precise localization and visualization of the plasma membrane. A comprehensive and complete imaging protocol will be shown for guiding through sample preparation, microscope calibration, image formation and acquisition, resulting in multi-color SD-TIRF live imaging series with high spatio-temporal resolution. All necessary image post-processing steps to generate multi-dimensional live imaging datasets, i.e. registration and combination of the individual channels, are provided in a self-written macro for the open source software ImageJ. The imaging of fluorescent proteins during initiation and maturation of adhesion complexes, as well as the formation of the actin cytoskeletal network, was used as a proof of principle for this novel approach. The combination of high resolution 3D microscopy and TIRF provided a detailed description of these complex processes within the cellular environment and, at the same time, precise localization of the membrane-associated molecules detected with a high signal-to-background ratio.

An advanced microscope that permit fast and high-resolution imaging of both, the isolated plasma membrane and the surrounding intracellular volume, will be presented. The integration of spinning disk and total internal reflection fluorescence microscopy in one setup allows live imaging experiments at high acquisition rates up to 3.5 s per image stack.

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

In living cells, processes such as adhesion formation involve extensive structural changes in the plasma membrane and the cell interior. In order to ...

Control of Cell Adhesion using Hydrogel Patterning Techniques for Applications in Traction Force Microscopy

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat soft substrates that deform under cell traction (2D-TFM). TFM relies on the use of linear elastic materials, such as polydimethylsiloxane (PDMS) or polyacrylamide (PA). For 2D-TFM on PA, the difficulty in achieving high throughput results mainly from the large variability of cell shapes and tractions, calling for standardization. We present a protocol to rapidly and efficiently fabricate micropatterned PA hydrogels for 2D-TFM studies. The micropatterns are first created by maskless photolithography using near-UV light where extracellular matrix proteins bind only to the micropatterned regions, while the rest of the surface remains non-adhesive for cells. The micropatterning of extracellular matrix proteins is due to the presence of active aldehyde groups, resulting in adhesive regions of different shapes to accommodate either single cells or groups of cells. For TFM measurements, we use PA hydrogels of different elasticity by varying the amounts of acrylamide and bis-acrylamide and tracking the displacement of embedded fluorescent beads to reconstruct cell traction fields with regularized Fourier Transform Traction Cytometry (FTTC).
To further achieve precise recording of cell forces, we describe the use of a controlled dose of patterned light to release cell tractions in defined regions for single cells or groups of cells. We call this method local UV illumination traction force microscopy (LUVI-TFM). With enzymatic treatment, all cells are detached from the sample simultaneously, whereas with LUVI-TFM traction forces of cells in different regions of the sample can be recorded in sequence. We demonstrate the applicability of this protocol (i) to study cell traction forces as a function of controlled adhesion to the substrate, and (ii) to achieve a greater number of experimental observations from the same sample.

Near-UV lithography and traction force microscopy are combined to measure cellular forces on micropatterned hydrogels. The targeted light-induced release of single cells enables a high number of measurements on the same sample.

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

Traction force microscopy (TFM) is the main method used in mechanobiology to measure cell forces. Commonly this is being used for cells adhering to flat ...

Oligomerization Dynamics of Cell Surface Receptors in Living Cells by Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy Combined with Number and Brightness Analysis

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of clustering. Here, we describe an imaging approach to determine the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor homocomplexes in the membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis. N&#38;B is a method similar to fluorescence-correlation spectroscopy (FCS) and photon counting histogram (PCH), which are based on the statistical analysis of the fluctuations of the fluorescence intensity of fluorophores diffusing in and out of an illumination volume during an observation time. In particular, N&#38;B is a simplification of PCH to obtain information on the average number of proteins in oligomeric mixtures. The intensity fluctuation amplitudes are described by the molecular brightness of the fluorophore and the average number of fluorophores within the illumination volume. Thus, N&#38;B considers only the first and second moments of the amplitude distribution, namely, the mean intensity and the variance. This is, at the same time, the strength and the weakness of the method. Because only two moments are considered, N&#38;B cannot determine the molar fraction of unknown oligomers in a mixture, but it only estimates the average oligomerization state of the mixture. Nevertheless, it can be applied to relatively small time series (compared to other moment methods) of images of live cells on a pixel-by-pixel basis, simply by monitoring the time fluctuations of the fluorescence intensity. It reduces the effective time-per-pixel to a few microseconds, allowing acquisition in the time range of seconds to milliseconds, which is necessary for fast oligomerization kinetics. Finally, large cell areas as well as sub-cellular compartments can be explored.

We describe an imaging approach for the determination of the average oligomeric state of mEGFP-tagged-receptor oligomers induced by ligand binding in the plasma membrane of living cells. The protocol is based on Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy combined with Number and Brightness (N&#38;B) analysis.

数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス

Despite the importance and ubiquity of receptor oligomerization, few methods are applicable for detecting clustering events and measuring the degree of ...

生物学

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

Tension Gauge Tether Probes for Quantifying Growth Factor Mediated Integrin Mechanics and Adhesion

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate multiple functions, including adhesion, proliferation, migration, and differentiation. Mechanical forces can be transmitted from the cell via the adhesion receptor integrin to ligands in the ECM. The amount and spatial organization of these cell-generated forces can be modulated by growth factor receptors, including epidermal growth factor receptor (EGFR). The tools currently available to quantify crosstalk-mediated changes in cell mechanics and relate them to&#160;focal adhesions, cellular morphology, and signaling are limited. DNA-based molecular force sensors known as tension gauge tethers (TGTs) have been employed to quantify these changes. TGT probes are unique in their ability to both modulate the underlying force threshold and report piconewton scale receptor forces across the entire adherent cell surface at diffraction-limited spatial resolution. The TGT probes used here rely on the irreversible dissociation of a DNA duplex by receptor-ligand forces that generate a fluorescent signal. This allows quantification of the cumulative integrin tension (force history) of the cell. This article describes a protocol employing TGTs to study the impact of EGFR on integrin mechanics and adhesion formation. The assembly of&#160;the TGT mechanical sensing platform is systematically detailed and the procedure to image forces, focal adhesions, and cell spreading is outlined. Overall, the ability to modulate the underlying force threshold of the probe, the adhesion ligand, and the type and concentration of growth factor employed for stimulation make this a robust platform for studying the interplay of diverse membrane receptors in regulating integrin-mediated forces.

TGT surface is an innovative platform to study growth factor-integrin crosstalk. The flexible probe design, specificity of the adhesion ligand, and precise modulation of stimulation conditions allow robust quantitative assessments of EGFR-integrin interplay. The results highlight EGFR as a 'mechano-organizer' tuning integrin mechanics, influencing focal adhesion assembly and cell spreading.

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

Multicellular organisms rely on interactions between membrane receptors and cognate ligands in the surrounding extracellular matrix (ECM) to orchestrate ...

TIRF Microscopy to Visualize Actin and Microtubule Coupling Dynamics

Source: Henty-Ridilla, J.L., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/64074">Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy.</a> J. Vis. Exp. (2022)
This video describes TIRF, a total internal reflection microscopy-based technique to visualize actin and microtubule polymerization dynamics. The method allows the high-resolution imaging of actin and microtubule coupling dynamics in real-time, which is essential for understanding cellular crosstalks.

アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

Source: Henty-Ridilla, J.L., Visualizing Actin and Microtubule Coupling Dynamics In Vitro by Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopy. J. ...

可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）の際に、細胞接着のナノトポロジー

要約

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原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのインビトロでの可視化

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

可変角度全内部反射蛍光顕微鏡（VA-TIRFM）の際に、細胞接着のナノトポロジー

要約

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原子間力分光法による単一分子の接着性を調査

全内部反射蛍光顕微鏡を用いた微生物のCortex組織とダイナミクスの可視化、

動的微小管および関連タンパク質をイメージングするための同時干渉反射および全内部反射蛍光顕微鏡

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのイン ビトロでの 可視化

回転ディスク全内部反射蛍光顕微鏡による細胞の接着の形成の可視化詳細

牽引力顕微鏡における応用のためのハイドロゲルパターン法を用いた細胞接着制御

数と明るさの分析と組み合わせた全内部反射蛍光顕微鏡による生細胞における細胞表面受容体のオリゴマー化ダイナミクス

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

成長因子媒介インテグリン力学と接着を定量するためのテンションゲージテザープローブ

アクチンと微小管の結合ダイナミクスを可視化するTIRF顕微鏡法

全内部反射蛍光(TIRF)顕微鏡によるアクチンと微小管結合ダイナミクスのインビトロでの可視化