この作品は、ビクトリア州政府のOIS​​プログラムによる国民健康、オーストラリアの医学研究評議会（NHMRC）（526615と545906）から、一部の補助金によって支えられている。 DSはNHMRCの仲間です。

1。 [3 H] -コレステロールの調製<ol><li>ドラフトでは、1.5ミリリットル遠心チューブ（0.5ウェル当たりμCiの（19放射能）が典型的なアッセイのために必要とされる）に[3 H]コレステロールの必要量を分注する。 </li><li> [3 H] -コレステロールをトルエン中に懸濁されている場合は、同様に1μCi（37放射能/μL。ボルテックスし、ミックスの最終濃度の100％エタノールのN2ガスを再懸濁して完全にそれを乾燥させてください。 </li></ol> 2。メッキ細胞およびラベリング細胞コレステロールヒト単球4,5、THP-1ヒト単球-マクロファージ6,7,8、RAW 264.7マウスマクロファージ5,9,10,11、HeLa細胞12、内皮細胞、ヒト臍帯静脈：このプロトコルは、次のセルタイプを使用してテストされています血小板由来の細胞（HUVEC）、BHK-21細胞9、ヒトとマウスの線維芽細胞13,14、HepG2細胞、ヒト肝癌細胞15と、修正された形で、&lt;&gt; 16のsup。 <ol><li>細胞を再懸濁し、それらをカウントします。 0.9ミリリットルの完全培地でウェルあたり0.2x10 6個の細胞の最終濃度で12ウェルプレートに細胞をプレート。細胞が成長し続け、流出実験の時間帯によって、ウェルあたり0.8×10 6個の細胞に到達します。そのような分化したTHP-1細胞として分裂しない細胞については、播種密度は、ウェルあたり0.8×10 6個の細胞である必要があります。それぞれ、24ウェルプレート、ダブルまたはウェルあたりの細胞数の半分 - 6を使用している場合。井戸の数は、各実験条件のために四重決定のための十分なはずです。 </li><li> THP-1細胞の分化が必要な場合は、48〜72時間のためにメディアにPMA（最終濃度0.1μg/ ml）を追加します。 </li><li> [3 H]コレステロールを含むマイクロチューブにメディアの小アリコートを追加します。 </li><li>完全なメディアの別のアリコート（100μl/ウェル）に[3 H] のコレステロールを添加する前にメディアでチューブの側面を洗ってください。 </li> &lt;LI&gt;細胞（ウェルあたり最終容量が1 mlである）で各ウェルに[3 H]コレステロールを含むメディアを追加します。細胞のない治療がラベリングの前に必要でない場合、細胞は、[3 H]コレステロール含有培地に播種することができます。 </li><li>細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で48時間細胞をインキュベートします。 </li></ol> 3。平衡インキュベーション<ol><li> 48時間インキュベーションした後、顕微鏡下で細胞を確認してください。彼らは健康であり、約80％コンフルエントであることを確認してください。 </li><li> [3 H]コレステロールを含むメディアを削除します。 PBSで穏やかに細胞を洗浄します。 3洗浄回数を繰り返します。 </li><li>無血清培地を準備します。血清フリー培地に、必要な場合には、LXRアゴニスト（例えば、1から4 mmol / lの時TO-901317など）やcAMPを（唯一のマウス由来の細胞を0.3モル/ l）を添加することにより細胞を活性化する。 </li><li>各ウェルに500μlの無血清培地を追加します。 </li><li> （37℃、5％CO 2）細胞培養インキュベーター中で18時間インキュベートする。 </li></ol> &lt;Pクラス= &quot;jove_title&quot;&gt; 4。コレステロール流出インキュベーション<ol><li>無血清培地で18時間インキュベーションした後、顕微鏡下で細胞を確認してください。彼らは（最低80％のコンフルエンシー）健康とコンフルエントであることを確認します。 </li><li>無血清培地中のコレステロール流出受容体の溶液を調製します。受容体の例は次のとおりです。 アポリポタンパク質AI（アポA-I）（最終濃度10μg/ ml）を 高密度リポタンパク質（HDL）（最終濃度20μg/ ml）を シクロデキストリン（最終濃度200μg/ ml）を 血漿（最終濃度1-2％） </li><li> PBSで穏やかに細胞を洗浄します。 </li><li>各ウェルにアクセプターと無血清培地250μlを添加します。 </li><li>背景の流出を（NOアクセプターと無血清培地への流出）を決定するために井戸のセットを1つ残す</li><li>細胞培養インキュベーター（37℃、5％CO 2）で2時間細胞をインキュベートします。必要に応じて流出インキュベーションの持続時間は30分〜8時間と異なる場合があります。 </li></ol> 5。処理土mples <ol><li> 2時間インキュベートした後、顕微鏡で細胞を確認してください。 </li><li> 1.5mlマイクロチューブにメディアを収集します。細胞の残骸を削除するには、室温で1から10分間14,000 rpmでスピン。 </li><li> 7mlのシンチレーションバイアルに100μlのメディアを転送します。不安定 - ゲルプラス（パーキンエルマー）と渦混合物の5mlのを追加します。 4℃で、残りのサンプルを保存</li><li> 30分のために冷凍庫にプレートを置きます。各ウェルに500μlのdH 2 Oを追加します。すべての細胞がウェルの底から持ち上げていることを確認し顕微鏡下で細胞を確認してください。まだ付着した場合、4℃で一晩またはこすっ井戸でdH 2 Oでプレートを残してどちらか。 </li><li>すべてのセルがリフトオフした後、細胞塊を分割するために上下にピペッティングします。 7mlのシンチレーションバイアルに100μLを転送します。不安定 - ゲルプラス（パーキンエルマー）と渦混合物の5mlのを追加します。 4℃で残りのプレートを保存</li><li>シンチレーションカウンターでシンチレーションバイアルを置きます。 [3 H]のカウントでカウンタの構成DPMユニット。 </li></ol> 6。結果を分析する<ol><li>コレステロール流出の速度は通常アクセプターへの細胞から移動したコレステロールの割合として表されます。次の式が使用されます。 </li></ol><img alt="式（1）" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq1.jpg" /><ol start="2"><li>特定の流出は、受容体の存在下または非存在下（ブランク）の流出の差として計算されます。 </li></ol><img alt="式（2）" src="/files/ftp_upload/3810/3810eq2.jpg" /> 7。タイムライン<img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3810/3810timeline.jpg" /> 8。代表的な結果コレステロール流出実験の結果の例を図に示されています。 1。この実験では、THP-1ヒト単球があった別の受容体にマクロファージやコレステロール流出に分化したテストされています。ないアクセプター（ &quot;空白&quot;）と媒体へのコレステロール流出は0.79％であり、この値は、非特定の流出とみなされ、他の値から差し引いた。人間のアポA-I（終濃度30μg/ mlの）へのコレステロール流出は4.75％であった。リファレンス·血漿サンプルは、間実験の変動を監視するには、この実験に含まれていました。参照サンプルは、実験の多数間でのデータの正規化に使用されるが、我々はばらつきが大きい場合、検定を繰り返すことが賢明見つけることができます。患者は薬で治療した前と後の患者の血漿（最終濃度2％）がテストされています。それはこの患者の薬のコレステロール流出をサポートするために、プラズマの能力にマイナスの影響を与えたと結論された。 流出実験の結果の別の例を図に示されています。 2。この実験ではRAW 264.7マクロファージはLXRアゴニストTO-901317で一晩インキュベートした（最終濃度によって活性化または活性化されていない1μmol/ Lの）およびヒト血漿の同じサンプル（2％）へのコレステロール流出を試験した。これは、LXRアゴニストとABCトランスポーターの細胞内発現の活性化が細胞外受容体にコレステロールを解放するためにセルの容量を増加させると結論された。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig1.jpg" /> 図1。様々なアクセプターへのTHP-1細胞からのコレステロール流出。コレステロール流出の割合は、（すなわち、標識されたコレステロールの割合は、細胞から指定されたアクセプターに移動）ブランク値を差し引いた後表示されます。平均値±四重測定のSD、* P &lt;0.05。 <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/3810/3810fig2.jpg" /> 図2。コレステロール流出のRAW 264.7ヒト血漿にLXRアゴニストにより活性化または有効になっていません。割合（すなわち、標識コレステロールの割合からのコレステロール流出は細胞からに移動指定されたアクセプター）ブランク値を差し引いた後表示されます。平均値±四重測定のSD、* P &lt;0.001。

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	<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+in+health+and+disease.">Cholesterol in health and disease.</a> J. Clin. Invest. 110, 583-590 (2002).</li><li>Brown, M. S., Goldstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholesterol+feedback:+from+Schoenheimer's+bottle+to+Scap's+MELADL.">Cholesterol feedback: from Schoenheimer's bottle to Scap's MELADL.</a> J. Lipid Res. 50, 15-27 (2009).</li><li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consequences+of+cellular+cholesterol+accumulation:+basic+concepts+and+physiological+implications.">Consequences of cellular cholesterol accumulation: basic concepts and physiological implications.</a> J. Clin. Invest. 110, 905-911 (2002).</li><li>Murphy, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Density+Lipoprotein+Reduces+the+Human+Monocyte+Inflammatory+Response.">High-Density Lipoprotein Reduces the Human Monocyte Inflammatory Response.</a> Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2071-2077 (2008).</li><li>Mujawar, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+Immunodeficiency+Virus+Impairs+Reverse+Cholesterol+Transport+from+Macrophages.">Human Immunodeficiency Virus Impairs Reverse Cholesterol Transport from Macrophages.</a> PLoS Biology. 4, 365-36 (2006).</li><li>Patel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Increases+Plasma+High-Density+Lipoprotein+Anti-Inflammatory+Properties+and+Cholesterol+Efflux+Capacity+in+Patients+With+Type+2+Diabetes.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Increases Plasma High-Density Lipoprotein Anti-Inflammatory Properties and Cholesterol Efflux Capacity in Patients With Type 2 Diabetes.</a> J. Am. Coll. Cardiol. 53, 962-971 (2009).</li><li>Shaw, J. 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Biochem. 379, 75-77 (2008).</li><li>D'Souza, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure/Function+Relationships+of+Apolipoprotein+A-I+Mimetic+Peptides:+Implications+for+Antiatherogenic+Activities+of+High-Density+Lipoprotein.">Structure/Function Relationships of Apolipoprotein A-I Mimetic Peptides: Implications for Antiatherogenic Activities of High-Density Lipoprotein.</a> Circ. Res. 107, 217-227 (2010).</li><li>Tchoua, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cholesteryl+ester+transfer+protein+overexpression+and+inhibition+on+reverse+cholesterol+transport.">The effect of cholesteryl ester transfer protein overexpression and inhibition on reverse cholesterol transport.</a> Cardiovasc Res. 77, 732-739 (2008).</li><li>Mukhamedova, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancing+apolipoprotein+A-I-dependent+cholesterol+efflux+elevates+cholesterol+export+from+macrophages+in+vivo.">Enhancing apolipoprotein A-I-dependent cholesterol efflux elevates cholesterol export from macrophages in vivo.</a> J. Lipid Res. 49, 2312-2322 (2008).</li><li>Mukhamedova, N., Fu, Y., Bukrinsky, M., Remaley, A. T., Sviridov, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Role+of+Different+Regions+of+ATP-Binding+Cassette+Transporter+A1+in+Cholesterol+Efflux.">The Role of Different Regions of ATP-Binding Cassette Transporter A1 in Cholesterol Efflux.</a> Biochemistry. 46, 9388-9398 (2007).</li><li>Sviridov, D., Fidge, N., Beaumier-Gallon, G., Fielding, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-I+stimulates+the+transport+of+intracellular+cholesterol+to+cell-surface+cholesterol-rich+domains+(caveolae.">Apolipoprotein A-I stimulates the transport of intracellular cholesterol to cell-surface cholesterol-rich domains (caveolae.</a> Biochem. J. 358, 79-86 (2001).</li><li>Smyth, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mouse+model+of+harlequin+ichthyosis+delineates+a+key+role+for+abca12+in+lipid+homeostasis.">A mouse model of harlequin ichthyosis delineates a key role for abca12 in lipid homeostasis.</a> PLoS Genet. 4, e1000192-e1000192 (2008).</li><li>Fu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+Caveolin-1+Enhances+Cholesterol+Efflux+in+Hepatic+Cells.">Expression of Caveolin-1 Enhances Cholesterol Efflux in Hepatic Cells.</a> J. Biol. Chem. 279, 14140-14146 (2004).</li><li>Calkin, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reconstituted+High-Density+Lipoprotein+Attenuates+Platelet+Function+in+Individuals+With+Type+2+Diabetes+Mellitus+by+Promoting+Cholesterol+Efflux.">Reconstituted High-Density Lipoprotein Attenuates Platelet Function in Individuals With Type 2 Diabetes Mellitus by Promoting Cholesterol Efflux.</a> Circulation. 120, 2095-2104 (2009).</li></ol>

著者らは、この研究に関連する一切の利害を宣言しません。

コレステロール流出を測定するために記載した方法は、細胞外コレステロール受容体への細胞からのコレステロールの動きを測定するために設計されています。この方法論を理解する上で、いくつかの重要な考慮事項があります。 ラベルと平衡記載された方法論で標識されたコレステロールは血清含有血清に追加されます。詳細に調べなかったが、そ?...

<table border="1"><tbody><tr><td> 試薬\セル </td><td> HeLa細胞 </td><td> THP-1 </td><td> RAW </td><td> HUVEC </td><td> BHK-21 </td><td> HFF </td></tr><tr><td> 完全なメディア </td><td colspan="3"> RPMI - 10％FCS - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌</td><td> M199 - 5％FCS - 1％L-グルタミン - 1％ペン連鎖球菌 - 2％HEPES（1M） - 7％内皮細胞増殖サプリメント（ECGS） </td><td colspan="2"> DMEM - 10％FCS - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌</td></tr><tr><td> 無血清培地 </td><td colspan="3"> RPMI - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌</td><td> M199 - 1％L-グルタミン - 1％ペン連鎖球菌 - 2％HEPES（1M） - 7％内皮細胞の成長目のサプリメント（ECGS） </td><td colspan="2"> DMEM - 1％L-グルタミン - 0.2％のペン連鎖球菌</td></tr><tr><td> 通過方法 </td><td> 1×トリプシン</td><td>サスペンション</td><td>落とす</td><td colspan="3"> 1×トリプシン</td></tr><tr><td> 通過率 </td><td>午前3時10分</td><td> 1時03分</td><td></td><td> 1時20分</td><td> 1時03分</td><td> 1時03分</td></tr><tr><td> 細胞活性化（オプション） </td><td></td><td colspan="5"> TO-901317 - LXRアゴニスト - ファイナルの濃4μM </td></tr><tr><td> その他の試薬 </td><td></td><td> ホルボール12 -ミリステート13 -アセテート（PMA） - 細胞分化 - ファイナルの濃0.1μg/ml </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

cholesterol efflux assay

細胞のコレステロール含有量は、細胞膜の破壊、アポトーシスとネクローシス1のセルの結果に多すぎる、または少なすぎるコレステロール、非常にタイトな限界内に維持する必要があります。細胞は細胞内合成から、血漿リポタンパク質からソースコレステロール、両方のソースは完全にコレステロールの細胞の要件を満たすのに十分であることができます。コレステロール合成と取り込みのプロセスが厳密に制御し、コレステロールの欠点は、2稀であるされています。過剰なコレステロールは、より一般的な問題は3です。肝細胞の例外を除いて、ある程度副腎皮質細胞に、細胞はコレステロールを低下させることができません。細胞は、そのコレステロール含有量を削減するための2つのオプションがあります。も有毒であるコレステリルエステルで細胞をオーバーロードとしてコレステリルエステル、限られた容量を持つオプションにコレステロール値を変換し、コレステロール流出、潜在的に無限の容量を持つオプションに。コレステロール流出は仕様です。このようなATP結合カセットトランスポータータンパク質A1（ABCA1）とG1（ABCG1）とスカベンジャー受容体タイプのB1の細胞内輸送、数によって規制されてIFICプロセス。血漿中のコレステロールの自然な受容体は高密度リポタンパク質（HDL）およびアポリポタンパク質AIです。 コレステロール流出のアッセイは、培養細胞からのコレステロール流出の割合を定量化するために設計されています。それはコレステロール流出および/または細胞から放出されるコレステロールを受け入れるようにプラズマ受容体の能力を維持するために、セルの容量を測定します。アッセイは、次の手順で構成されます。ステップ1：血清含有培地に標識コレステロールを添加し、24〜48時間のために細胞とインキュベートすることにより、細胞のコレステロールをラベリング。この手順は、コレステロールの細胞のローディングと組み合わせることができる。ステップ2：すべての細胞内コレステロールプール間で標識されたコレステロールを平衡化するための無血清培地中の細胞のインキュベーション。この段階は、細胞のchの活性化と組み合わせることができるolesterolトランスポーター。ステップ3：細胞外受容体や細胞から受容体への標識コレステロールの動きの定量と細胞のインキュベーション。コレステロールの前駆体は、新たに合成されたコレステロールを標識するために使用された場合、第四ステップは、コレステロールの精製は、必要な場合があります。 特定の治療（突然変異、ノックダウン、過剰発現または治療）が流出コレステロール、および（ii）プラズマアクセプターの容量がコレステロールを受け付ける方法に、セルの容量をどのように影響するか（I）：アッセイは、以下の情報を提供します病気や治療の影響を受けています。このメソッドは、しばしば心血管研究、代謝および神経変性疾患、感染症と生殖疾患のコンテキストで使用されます。

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コレステロール流出アッセイ |医学 |ビデオ

Cholesterol Efflux Assay

コレステロールアッセイは、培養細胞からのコレステロール流出率と細胞から放出されるコレステロールを受け入れるようにプラズマ受容体の能力を定量化するために設計されています。アッセイは、細胞内プールと細胞外受容体へのコレステロールのリリース間でのコレステロールコレステロール、平衡で細胞を標識で構成されています。

コレステロール流出アッセイ

Cholesterol content of cells must be maintained within the very tight limits, too much or too little cholesterol in a cell results in disruption of ...

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29.7K ビュー.  Baker IDI Heart and Diabetes Institute. コレステロールアッセイは、培養細胞からのコレステロール流出率と細胞から放出されるコレステロールを受け入れるようにプラズマ受容体の能力を定量化するために設計されています。アッセイは、細胞内プールと細胞外受容体へのコレステロールのリリース間でのコレステロールコレステロール、平衡で細胞を標識で構成されています。

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Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of methods. Here, we describe two important approaches used for this purpose. First, we describe how to enrich tissues and cells with cholesterol using cyclodextrin saturated with cholesterol using cerebral arteries (tissues) and hippocampal neurons (cells) as examples. This approach can be used for any type of tissue, cells, or cell lines. An alternative approach for cholesterol enrichment involves the use of low-density lipoprotein (LDL). The advantage of this approach is that it uses part of the natural cholesterol homeostasis machinery of the cell. However, whereas the cyclodextrin approach can be applied to enrich any cell type of interest with cholesterol, the LDL approach is limited to cells that express LDL receptors (e.g., liver cells, bone marrow-derived cells such as blood leukocytes and tissue macrophages), and the level of enrichment depends on the concentration and the mobility of the LDL receptor. Furthermore, LDL particles include other lipids, so cholesterol delivery is nonspecific. Second, we describe how to enrich Xenopus oocytes with cholesterol using a phospholipid-based dispersion (i.e., liposomes) that includes cholesterol. Xenopus oocytes constitute a popular heterologous expression system used for studying cell and protein function. For both the cyclodextrin-based cholesterol enrichment approach of mammalian tissue (cerebral arteries) and for the phospholipid-based cholesterol enrichment approach of Xenopus oocytes, we demonstrate that cholesterol levels reach a maximum following 5 min of incubation. This level of cholesterol remains constant during extended periods of incubation (e.g., 60 min). Together, these data provide the basis for optimized temporal conditions for cholesterol enrichment of tissues, cells, and Xenopus oocytes for functional studies aimed at interrogating the impact of cholesterol enrichment.

Enrichment of Mammalian Tissues and Xenopus Oocytes with Cholesterol

Two methods of cholesterol enrichment are presented: the application of cyclodextrin saturated with cholesterol to enrich mammalian tissues and cells, and the use of cholesterol-enriched phospholipid-based dispersions (liposomes) to enrich Xenopus oocytes. These methods are instrumental for determining the impact of elevated cholesterol levels in molecular, cellular, and organ function.

哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

Cholesterol enrichment of mammalian tissues and cells, including Xenopus oocytes used for studying cell function, can be accomplished using a variety of ...

生化学

Spot Variation Fluorescence Correlation Spectroscopy for Analysis of Molecular Diffusion at the Plasma Membrane of Living Cells

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ranging from nanometers to micrometers and microseconds to minutes, respectively. Such a broad range of biological processes challenges conventional microscopy approaches. Here, we detail the procedure for implementing spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) measurements using a classical fluorescence microscope that has been customized. The protocol includes a specific performance check of the svFCS setup and the guidelines for molecular diffusion measurements by svFCS on the plasma membrane of living cells under physiological conditions. Additionally, we provide a procedure for disrupting plasma membrane raft nanodomains by cholesterol oxidase treatment and demonstrate how these changes in the lateral organization of the plasma membrane might be revealed by svFCS analysis. In conclusion, this fluorescence-based method can provide unprecedented details on the lateral organization of the plasma membrane with the appropriate spatial and temporal resolution.

This article aims to present a protocol on how to build a spot variation Fluorescence Correlation Spectroscopy (svFCS) microscope to measure molecular diffusion at the plasma membrane of living cells.

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

Dynamic biological processes in living cells, including those associated with plasma membrane organization, occur on various spatial and temporal scales, ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular disease (CVD). The structure and function of HDL rather than HDL-C may more accurately predict atherosclerosis. Several HDL protein and lipid compositional changes that impair HDL function occur in inflammatory states such as atherosclerosis. HDL function is usually determined by cell based assays such as cholesterol efflux assay but these assays have numerous drawbacks lack of standardization. Cell-free assays may give more robust measures of HDL function compared to cell-based assays. HDL oxidation impairs HDL function. HDL has a major role in lipid peroxide transport and high amount of lipid peroxides is related to abnormal HDL function. Lipid-probe interactions should be considered when interpreting the results of non-enzymatic fluorescence assays for measuring the lipid oxidative state. This motivated us to develop a cell-free biochemical enzymatic method to assess HDL lipid peroxide content (HDLox) that contributes to HDL dysfunction. This method is based on the enzyme horseradish peroxidase (HRP) and the fluorochrome Amplex Red that can quantify (without cholesterol oxidase) the lipid peroxide content per mg of HDL-C. Here a protocol is describedfor determination of HDL-lipid peroxidation using the fluorochrome reagent. Assay variability can be reduced by strict standardization of experimental conditions. Higher HDLox values are associated with reduced HDL antioxidant function. The readout of this assay is associated with readouts of validated cell-based assays, surrogate measures of cardiovascular disease, systemic inflammation, immune dysfunction, and associated cardiovascular and metabolic risk phenotypes. This technical approach is a robust method to assess HDL function in human disease where systemic inflammation, oxidative stress and oxidized lipids have a key role (such as atherosclerosis).

We describe here a fluorometric cell-free biochemical assay for determination of HDL-lipid peroxidation. This rapid and reproducible assay can be used to determine HDL function in large scale studies and can contribute to our understanding of HDL function in human disease.

高密度リポタンパク質の脂質過酸化反応の高スループット測定用無細胞生化学的蛍光酵素試金

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

免疫・感染学

Lipid Exchange Assay in Living Cells

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the outer leaflet drives the membrane&#39;s propensity to form lipid rafts. The transient nature of lipid rafts makes it difficult to study in living cells. Therefore, methods that add or remove raft-forming lipids at&#160;the outer leaflet of living cells facilitate studying the characteristics of rafts, such as their effects on membrane proteins. Lipid exchange experiments developed in our lab utilize lipid-loaded cyclodextrins to remove and add exogenous phospholipids to change the lipid constitution of the plasma membrane. Substituting the membrane with a raft or non-raft-forming lipid can aid in studying the effects on transmembrane protein activity. Here, we describe a method for lipid exchange on the outer leaflet of the plasma membrane using lipid-loaded cyclodextrin. We demonstrate the preparation of the exchange media and the subsequent treatment of attached mammalian cells. We also showcase how to measure the efficiency of exchange using HP-TLC. This protocol yields a nearly complete replacement of the outer leaflet with exogenous lipids without altering cellular viability, permitting further experimentation on modified intact plasma membranes.

We describe a method for using cyclodextrin to mediate exchange between lipids of the plasma membrane with exogenous lipids. This technique can be paired with experiments studying transmembrane proteins, which behave differently in lipid raft-like environments than they do in non-raft-like environments.

生細胞における脂質交換アッセイ

Lipid rafts are dynamic, ordered domains in the plasma membrane often formed during membrane protein clustering and signaling. The lipid identity of the ...

Differential Effects of Lipid-lowering Drugs in Modulating Morphology of Cholesterol Particles

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to moderate level of increase in high-density lipoprotein (HDL) cholesterol in plasma. However, a possible role of these drugs in altering morphology and distribution of cholesterol particles is poorly understood. Here, we describe the in vitro evaluation of lipid-lowering drug effects in modulating morphological features of cholesterol particles using the plaque array method in combination with imaging flow cytometry. Image analyses of the cholesterol particles indicated that lovastatin, simvastatin, ezetimibe, and atorvastatin induce the formation of both globular and linear strand-shaped particles, whereas niacin, fibrates, fluvastatin, and rosuvastatin induce the formation of only globular-shaped particles. Next, purified very low-density lipoprotein (VLDL) and LDL particles incubated with these drugs showed changes in the morphology and image texture of cholesterol particles subpopulations. Furthermore, screening of 50 serum samples revealed the presence of a higher level of linear shaped HDL cholesterol particles in subjects with dyslipidemia (mean of 18.3%) compared to the age-matched normal (mean of 11.1%) samples. We also observed considerable variations in lipid-lowering drug effects on reducing linear shaped LDL and HDL cholesterol particles formation in serum samples. These findings indicate that lipid-lowering drugs, in addition to their cell-mediated hypolipidemic effects, may directly modulate morphology of cholesterol particles by a non-enzymatic mechanism of action. The outcomes of these results have potential to inform diagnosis of atherosclerosis and predict optimal lipid-lowering therapy.

The objective of this study was to evaluate in vitro lipid-lowering drug effects in modulating the morphology of cholesterol particles. Comparison of lipid-lowering drugs revealed variations in their effect in modulating the morphological features of cholesterol particles.

コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果

Treatment of dyslipidemia patients with lipid-lowering drugs leads to a significant reduction in low-density lipoproteins (LDL) level and a low to ...

医学

High-throughput Nitrobenzoxadiazole-labeled Cholesterol Efflux Assay

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in atherosclerosis development. However, an important factor in early stages of atheroma plaque formation is cholesterol efflux capacity to HDL (the ability of HDL particles to accept cholesterol from macrophages) in order to avoid foam cell formation. This is a key step in avoiding the accumulation of cholesterol in the endothelium and a part of reverse cholesterol transport (RCT) to eliminate cholesterol through the liver. Cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool that can be used as biomarker for atherosclerosis. Traditionally, [3H]-cholesterol has been used in cholesterol efflux assays. In this study, we aim to develop a safer and faster strategy using fluorescent labelled-cholesterol (NBD-cholesterol) in a cellular assay to trace the cholesterol uptake and efflux process in THP-1-derived macrophages. Finally, we optimize and standardize the NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

Measurement of in vitro cholesterol efflux capacity to serum or plasma in macrophage cell models is a promising tool as a biomarker for atherosclerosis. In the present study, we optimize and standardize a fluorescent NBD-cholesterol efflux method and develop a high-throughput analysis using 96-well plates.

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベル コレステロール排出アッセイ

Atherosclerosis leads to cardiovascular disease (CVD). It is still unclear whether cholesterol-HDL (cHDL) concentration plays a causal role in ...

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as from eukaryotes. This increase has been largely driven by the successful push to obtain structural information on membrane proteins. However, the ability to functionally interrogate these proteins has not advanced at the same rate and is often limited to qualitative assays of limited quantitative value, thereby limiting the mechanistic insights that they can provide. An assay to quantitatively investigate the transport activity of reconstituted Cl- channels or transporters is described. The assay is based on the measure of the efflux rate of Cl- from proteoliposomes following the addition of the K+ ionophore valinomycin to shunt the membrane potential. An ion sensitive electrode is used to follow the time-course of ion efflux from proteoliposomes reconstituted with the desired protein. The method is highly suited for mechanistic studies, as it allows for the quantitative determination of key properties of the reconstituted protein, such as its unitary transport rate, the fraction of active protein and the molecular mass of the functional unit. The assay can also be utilized to determine the effect of small molecule compounds that directly inhibit/activate the reconstituted protein, as well as to test the modulatory effects of the membrane composition or lipid-modifying reagents. Where possible, direct comparison between results obtained using this method were found to be in good agreement with those obtained using electrophysiological approaches. The technique is illustrated using CLC-ec1, a CLC-type H+/Cl- exchanger, as a model system. The efflux assay can be utilized to study any Cl- conducting channel/transporter and, with minimal changes, can be adapted to study any ion-transporting protein.

A Proteoliposome-Based Efflux Assay to Determine Single-molecule Properties of Cl- Channels and Transporters

Proteoliposomes are used to study purified channels and transporters reconstituted in a well-defined biochemical environment. An experimental procedure to measure efflux mediated by these proteins is illustrated. The steps to prepare proteoliposomes, perform the recordings, and analyze data to quantitatively determine the functional properties of the reconstituted protein are described.

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する<sup&gt; -</sup&gt;チャネルとトランスポーター

The last 15 years have been characterized by an explosion in the ability to overexpress and purify membrane proteins from prokaryotic organisms as well as ...

生物学

Using Caco-2 Cells to Study Lipid Transport by the Intestine

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely accepted as the in vivo model of dietary fat absorption, the surgical techniques involved are challenging and expensive. Genetic manipulation of the animal model is also costly and time consuming. The alternative in vitro model is arguably more affordable, timesaving, and less challenging. Importantly, the in vitro model allows investigators to examine the enterocytes as an isolated system, reducing the complexity inherent in the whole organism model. This paper describes how human colon carcinoma cells (Caco-2) can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs and vitamins. It explains the proper maintenance of Caco-2 cells and the preparation of their lipid mixture; and it further discusses the valuable option of using the permeable membrane system. Since differentiated Caco-2 cells are polarized, the main advantage of using the permeable membrane system is that it separates the apical from the basolateral compartment. Consequently, the lipid mixture can be added to the apical compartment while the lipoproteins can be collected from the basolateral compartment. In addition, the effectiveness of the lentivirus expression system in upregulating gene expression in Caco-2 cells is discussed. Lastly, this paper describes how to confirm the successful isolation of intestinal lipoproteins by transmission electron microscopy (TEM).

Caco-2 cells can serve as an in vitro model to study the enterocyte transport of lipids, and lipid-soluble drugs/vitamins. The permeable membrane system separates the apical from the basolateral compartment, while the lentivirus expression system offers an effective gene overexpression method. The isolation of lipoproteins is confirmed by TEM.

腸によって脂質輸送を研究するためのCaco-2細胞を用いました

Studies of dietary fat absorption are generally conducted by using an animal model equipped with a lymph cannula. Although this animal model is widely ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL コレステロールの取り込みアッセイ セルにライブセル イメージングを使用して正常性の監視

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, isolating intestinal lipoproteins is very difficult in vivo because they are first secreted from the small intestine into the mesenteric lymphatics. Chylomicron-containing lymph then empties into the subclavian vein from the thoracic duct to deliver components of the meal to the heart, lungs, and, ultimately, whole-body circulation. Isolating na&#239;ve chylomicrons is impossible from blood since chylomicron triglyceride undergoes hydrolysis immediately upon interaction with lipoprotein lipase and other lipoprotein receptors in circulation. Therefore, the original 2-day lymph fistula procedure, described by Bollman et al. in rats, has historically been used to isolate fresh mesenteric lymph before its entry into the thoracic vein. That protocol has been improved upon and professionalized by the laboratory of Patrick Tso for the last 45 years, allowing for the analysis of these critical lipoproteins and secretions from the gut. The Tso lymph fistula procedure has now been updated and is presented here visually for the first time. This revised procedure is a single-day surgical technique for installing a duodenal feeding tube, cannulating the mesenteric lymph duct, and collecting lymph after a meal in conscious mice. The major benefits of these new techniques include the ability to reproducibly collect lymph from mice (which harnesses the power of genetic mouse models); the reduced anesthesia time for mice during the implantation of the duodenal infusion tube and the lymph cannula; the ability to continuously sample lymph throughout the feeding and post-prandial period; the ability to quantitatively measure hormones and cytokines before their dilution and enzymatic hydrolysis in blood; and the ability to collect large quantities of lymph for isolating intestinal lipoproteins. This technique is a powerful tool for directly and quantitatively measuring dietary nutrient absorption, intestinal lipoprotein synthesis, and chylomicron secretion.

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

The present protocol describes a detailed surgical protocol for isolating flowing intestinal lymph in response to intraduodenal nutrient infusions in mice. This allows for the physiological determination of total intestinal lipid absorption and chylomicron synthesis and secretion in response to various experimental nutrients.

食事脂質吸収とカイロミクロン分泌の in vivo 動態を定量化するためのマウスにおける流れる腸間膜リンパの分離

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, ...

コレステロール流出アッセイ

要約

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この動画の章

哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

高密度リポタンパク質の脂質過酸化反応の高スループット測定用無細胞生化学的蛍光酵素試金

生細胞における脂質交換アッセイ

コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベルコレステロール排出アッセイ

プロテオリポソームベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する

腸によって脂質輸送を研究するためのCaco-2細胞を用いました

LDL コレステロールの取り込みアッセイセルにライブセルイメージングを使用して正常性の監視

食事脂質吸収とカイロミクロン分泌の in vivo 動態を定量化するためのマウスにおける流れる腸間膜リンパの分離

コレステロール流出アッセイ

要約

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哺乳類組織の富化とコレステロールを伴うゼノプス卵母細胞

生細胞原形質膜における分子拡散解析のためのスポット変異蛍光相関分光法

高密度リポタンパク質の脂質過酸化反応の高スループット測定用無細胞生化学的蛍光酵素試金

生細胞における脂質交換アッセイ

コレステロール粒子の形態を調節することで脂質低下薬の効果

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベル コレステロール排出アッセイ

プロテオリポソー​​ムベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する

腸によって脂質輸送を研究するためのCaco-2細胞を用いました

LDL コレステロールの取り込みアッセイ セルにライブセル イメージングを使用して正常性の監視

食事脂質吸収とカイロミクロン分泌の in vivo 動態を定量化するためのマウスにおける流れる腸間膜リンパの分離

高スループット Nitrobenzoxadiazole ラベルコレステロール排出アッセイ

プロテオリポソームベースの流出アッセイのClの単一分子特性を決定する

LDL コレステロールの取り込みアッセイセルにライブセルイメージングを使用して正常性の監視