私は 、in vivo細胞内記録と細胞内染色の技法の初期の開発に関するヘルプは、ブラウンとDavid Maxwell ので最初の訓練のためにアンソニーテイラーに感謝。私はcollocalizationマクロのヘルプはM.シルバーに感謝。多くの学者は、誰と私はR.東亜、M.森谷、P.羅、R. Ambalavanarを含むこの技術の開発に提供する洞察力を協力してきました。この手法は、NIHの助成金DE10132、DE15386とRR017971からかなりのサポートと開発されました。

1。動物の準備<ol><li>ペントバルビタールナトリウム（50mg/kg IP）と加熱パッド上の場所でラットを麻酔。動物のバリカンで後部頭蓋骨を覆う皮膚を剃る。麻酔のレベルの手術レベルはつま先を挟まないだけでなく、眼瞼反射欠如である場合撤退の反射や発声の有無をテストすることによって得られていることを保証するために動物を確認してください。麻酔15分ごとのレベルを確認し、ペントバルビタールナトリウム15mg/kgの注射は45分ごとでanesthetisaの外科的レベルを維持する。 </li><li>無菌操作を使用し、腹部と太ももの内側で形成された皺に鼠径部の切開だけで遠位にし、大腿静脈にカニューレ（1ミリメートル直径、クレイアダムス）、および大腿動脈に挿入する。顎下部の正中切開を行う、舌骨下筋を反映している。気管に小さな切開を行い、換気を可能にするカニューレを（直径2mm）を挿入します。動脈カニューレを介してplace.Monitor全身収縮期血圧および拡張期血圧でそれを確保するcannual trachael周り縫合糸をTYE。撤退と眼瞼反射の監視に加えて、今麻酔のレベルを評価するために血圧を監視する。静脈カニューレを介して必要なときに追加の麻酔を管理します。 </li><li>定位フレームにラットを置いて、小脳を露出させる開頭術を行います。齧歯類の人工呼吸器に気管カニューレを取り付けます。加湿空気と100/minの割合で2 cm 3の体積で動物を換気する。 1センチメートルH 2 Oの正側呼気圧力は肺の虚脱を防ぐために維持されるべきである。 15分ごとに無気肺を防ぐために、肺に超インフレにする。その後、温めたミネラルオイル（30℃）で脳の表面を覆う。直接壁と壁間の骨の間の接合部の下にある大静脈洞を避けるように注意してください。 </li><li>電磁振動に結合ロッドにシアノアクリレート接着剤を適用すると顎の正中離開でロッドを取り付けます。どちら/ Dコンピュータの出力または信号発生器から振動子に下顎を使用してコマンド信号を移動します。 </li><li>開頭術に隣接して皮膚の下に電極を接地siliver - 塩化銀を置きます。 </li></ol> 2。電極の準備<ol><li>水平方向の微小電極プラーを使用して石英やアルミノシリケートガラスから微小電極を作製。 </li><li> 0.25M KClおよび0.5Mトリス塩酸緩衝液（pH7.6）または生理食塩水で2％tetramethlyrhodamine（pHは6）に溶解した5〜10％のbiotinamideに微小電極を埋める。電極のテスターと電極のインピーダンスを確認してください。大径の軸索から記録するには60 - 80MΩのインピーダンスを持つ電極を作る、小さな軸索および介在、80 -150MΩのインピーダンスと電極を作る。 </li><li>エレクトロメータのヘッドステージに微小電極を配置。動物の頭の後ろの位置に固定されている小さな望遠鏡（同封のレチクル付き20X）を介して電極を視覚化する。それは電極を定位を高い精度で配置されることができるため、望遠鏡を使用することが重要です。 </li></ol> 3。電気生理学的記録と細胞内染色<ol><li>軟膜の小さな開口部を作成し、電極が脳に触れるとフィードバック信号が生成されるように容量のフィードバックを過度に補償する。これは、脳の表面の正確な位置を可能にします。 </li><li>繰り返される下顎変位を生成し、ステッピングモータと、脳に電極を進める。 </li><li>直流電位の急激な低下によって神経impalementsを認識し、継続的なシナプス活動によってintrasomatic神経impalementsを識別する。静電容量の過補償と電極を賑わっまたはめったに成功した細胞の浸透を生成しないタップ。ため、電極の高インピーダンスから、神経細胞応答はほとんど浸透する前に観察されない。 </li><li>あなたがニューロンを突き刺すと浸透が安定したと判断された後、ランプとホールドと正弦波顎の動きを使って神経細胞の応答を特徴付ける。マップ5ニューロンの受容野を非導電性プローブを用いて頭の周りの皮膚と内口腔をプローブすることにより木の棒など。研究に関連する場合、そのような筋収縮や侵害刺激のような他の機能的に関連刺激に対するニューロンの応答を調べて6一次求心性侵害受容ニューロンの受容体は、侵害刺激に応答する。ペントバルビタールナトリウムのような一般的なanestheseticsは、一次求心性ニューロンの軸索の伝導をブロックするのではなく、シナプス伝達を抑制することはありません。したがって、一次求心性神経細胞軸索の軸索伝導が維持されます。 </li><li> 15 70nA分の総噴射時間のために（DC、1 - 4NA）電流を注入。電流注入時の電極の侵入を監視し、膜電位が- 30mVのより肯定的になれば中止する。</li></ol> 4。組織の処理<ol><li>リンス血管にペントバルビタールの過剰投与（140mg/kg IV）と浸み込ませることにより動物を安楽死させる（0.9％塩化ナトリウム38℃ヘパリンと1ミリリットルの2％のCを含む500台を0.1Mリン酸緩衝液（pH7.4）中4％パラホルムアルデヒドに続いてキシロカイン。 </li><li>それはどちらの正面、矢状または水平面でビブラトームを用いて50 -100μmの時に脳やセクションを削除します。 Secionsは25℃のPBSで自由に浮遊して収集されます。 </li><li> 1から2パーセント正常ヤギ血清でインキュベートすることによりDABのための脳、1％トリトンX - 100、0.01M PBSでの処理アビジンビオチン複合体（1:50エリートステイン）でインキュベートした。 H 2 O 2とニッケル- DABを使用してセクションを反応する。テキサスレッド、4℃で一晩、PBSのアビジン - ビオチン複合体（1:50）で切片をインキュベート℃、その後4℃で一晩PBSTで4％テキサスレッドアビジンDCSでイン​​キュベート。ために処理するために23℃で蛍光ニッスル染色（NeuroTrace）20分で切片を対比</li><li>ニューロンは、ローダミンで注入した場合、蛍光顕微鏡（例545nm）を直接注入ニューロンを可視化する。 </li></ol> 5。逆行性標識法と組み合わせる方法、免疫細胞化学、共焦点イメージング、定量的局在解析他の方法でこの手法を組み合わせるの成功は、優れた細胞内ラベリングに大きく依存します。 <ol><li>方法は簡単に逆行性神経細胞のラベリングと組み合わせることができますここで可視化した。これを行うには7-10、動物を麻酔し、無菌操作を使用して、このような西洋ワサビペルオキシダーゼ（20％西洋ワサビペルオキシダーゼ。シグマVI、シグマ）などの神経トレーサーを注入し、1％小麦胚芽は、咬筋などのペリフェラルターゲット領域に西洋ワサビペルオキシダーゼ（Sigma）をaggultinated。このニューロントレーサーは、末梢軸索に取り込まと運動ニューロンのsomaの複数形に軸索輸送を介して輸送されます。咬筋の場合は、トレーサーの15μlの滅菌10マイクロリットルのマイクロシリンジを用いて筋肉に注入されます。麻酔から回復し、回復のために自分のケージの中で供されるまで、動物を加熱パッド上に配置して監視されます。 24時間後、動物を麻酔し、生理学的に神経細胞を特徴づけ、細胞内でそれらを染色。その後、コバルトと安定剤や強化などのchromagenとタングステン酸ナトリウムとしてテトラメチルベンジジン（TMB）を使用して、HRPの存在のために上記のように動物やプロセスの組織切片を灌流。 1％ナトリウムの場所のセクションを0.1M PBS（pH6.5）で、15で無水エタノールやアセトンに溶解した0.0007％TMBに溶解し、タングステン酸℃で20分間。て0.3％60分間インキュベーション溶液の100mlあたりH 2 O 2の1.0mlを添加することにより組織切片を反応する。 0.05％ジアミノベンジジン液（pH7.4）、0.02％、コバルト、及び0.01％H 2 10分間0.1M PBS（pH7.4）中のO 2で0.1M PBS（pH6.5）での組織や場所をすすぎます。 37℃説明されているようbiotinamideを注入されたニューロンの可視化のための組織を処理し、標識の感覚ニューロンと運動ニューロンの様々な間の関係を視覚化する。 </li><li>ここに示されているテクニックも容易にimmnocytochemistryと組み合わせることができます。6例として、免疫細胞化学的に正確にラベルされたニューロン内のシナプス（ 図3）を見つけるためにシナプトフィジンのための脳の処理。これを行うには、4℃で2日間C、その後23℃1時間のために抗マウスFITC（1:400）でインキュベーション℃でマウス抗シナプトフィジン抗体（1:10,000）の脳切片をインキュベート</li><li>蛍光マーカーで標識または蛍光イメージングのために処理のニューロンは、共焦点イメージングに最適です。図3は、軸索のブートンを通じて共焦点顕微鏡で得られた光学部の一例です。 （ 図3）。ラベル付けニューロン（ 図4）を介して複数の光のセクションを取得することにより標識されたニューロンのアニメーションを生成する。 </li><li>この方法で標識されたニューロンは、定量的局在の解析に使用することができます。これを行うには、NIHイメージ（http://phy.ucsf.edu/ ° IDL / colocalization.htmで発見）と一緒に公開されているソフトウェアのマクロを使用してください。シナプトフィジン免疫細胞との細胞内のラベルを結合して単一の軸索終末内シナプトフィジンをローカライズする。6 </li></ol> 6。代表的な結果： この方法を使用して取得することができる代表的な結果の概要を図1に示します。この単一の脳幹ニューロンが電気生理学的に明確に見られるように、下顎運動中に記録していた、このニューロンの応答（ 図1左、水色下）が運動中に変調だった。このニューロンは電気生理学的特性評価後にbiotinamideを注入し、続いて視覚化のために処理した。再構築されたニューロン（ 図1中央の、緑色は）本当のことができます解剖学的ランドマーク、この場合には三叉神経運動核が指定（赤枠）のテッド。運動と再構成するときに、神経細胞の応答に基づいて、このニューロンは二筋紡錘求心性ニューロンとして同定することができる。 図2は、顎の変位時のニューロンの生理学的応答の代表的な例を示します。ニューロンの応答は瞬時発火頻度として表されます。神経細胞の応答が密接にこの特定のニューロンは下顎の位置に関連した感覚フィードバックを提供することを示す下顎変位を模倣している。 図3は、ノートでは、シナプスの染色とニッスル染色と組み合わせて細胞内で染色された軸索の高倍率の画像です。軸索神経繊維末端内シナプトフィジン（黄色）の共局在を注意してください。 図4は、シングル、生理学的特徴および細胞内に標識されたニューロンのアニメーションです。 <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig1.jpg" alt="図1"/> 図1の方法の概要。左上：下顎の変位。単一のニューロン（黄色）から中央の細胞内記録（緑）。このニューロンの形態は、細胞内記録と注射後に再建されました。赤いアウトラインは三叉神経運動核の位置を示します。左下：顎運動時に、このニューロンの生理学的な応答を。 <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig2.jpg" alt="図2"/> 図2下顎運動中に生体内で記録された単一の筋肉感覚神経の代表的な生理的反応。顎の変位と神経細胞応答の類似性に注意してください。 <img src="/files/ftp_upload/2650/2650fig3.jpg" alt="図3"/> プロービング筋肉中に応答した細胞内染色の感覚ニューロンのシナプスboutons（赤い腫れ）と図3。ターミナル軸索分岐。シナプトフィジンの後続免疫細胞化学的処理は、軸索ブートン（黄色）内のシナプトフィジンの局在を示しています。グリーンは蛍光ニッスル染色です。 図4。生理反応下顎運動時の生体内で記録された筋紡錘一次求心性ニューロンの軸索のアニメーションは、軸索は、細胞内染色し、可視化のために処理した。 <a href="/files/ftp_upload/2650/collateral4.avi">ここで図4の高解像度のビデオをダウンロード</a> <a href="/files/ftp_upload/2650/medres.mov">ここで図4の中解像度のビデオをダウンロード</a>

<ol>
	<li>Cuellar, C. A., Tapia, J. A., Juarez, V., Quevedo, J., Linares, P., Marinez, L., Manjarrez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Propagation+of+sinusoidal+electrical+waves+along+the+spinal+cord+during+a+fictive+motor+task.">Propagation of sinusoidal electrical waves along the spinal cord during a fictive motor task.</a> J. Neurosci. 29, 798-810 (2010).</li><li>Frigon, A., Gossard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+specialized+rhythm-generating+mechanisms+in+the+adult+mammalian+spinal+cord.">Evidence for specialized rhythm-generating mechanisms in the adult mammalian spinal cord.</a> J. Neurosci. 30, 7061-7071 (2010).</li><li>Wang, W., Chan, S. S., Heldman, D. A., Moran, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Motor+cortical+representation+of+hand+translation+and+rotation+during+reaching.">Motor cortical representation of hand translation and rotation during reaching.</a> J. Neurosci. 30, 958-962 (2010).</li><li>Ma, C., He, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+investigating+cortical+control+of+stand+and+squat+in+conscious+behavioral+monkeys.">A method for investigating cortical control of stand and squat in conscious behavioral monkeys.</a> J. Neurosci. Meth. 192, 1-6 (2010).</li><li>Dessem, D., Donga, R., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary-+and+secondary-like+jaw-muscle+spindle+afferents+have+characteristic+topographic+distributions.">Primary- and secondary-like jaw-muscle spindle afferents have characteristic topographic distributions.</a> J. Neurophysiol. 77, 2925-2944 (1997).</li><li>Dessem, D., Moritaini, A., Ambalavanar, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nociceptive+craniofacial+muscle+primary+afferent+neurons+synapse+in+both+the+rostral+and+caudal+brain+stem.">Nociceptive craniofacial muscle primary afferent neurons synapse in both the rostral and caudal brain stem.</a> J. Neurophysiol. 98, 214-223 (2007).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inputs+from+identified+jaw-muscle+spindle+afferents+to+trigeminothalamic+neurons+in+the+rat:+a+double-labeling+study+using+retrograde+HRP+and+intracellular.">Inputs from identified jaw-muscle spindle afferents to trigeminothalamic neurons in the rat: a double-labeling study using retrograde HRP and intracellular.</a> J. Comp. Neurol. 353, 50-66 (1995).</li><li>Dessem, D., Luo, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Jaw-muscle+spindle+afferent+feedback+to+the+cervical+spinal+cord+in+the+rat.">Jaw-muscle spindle afferent feedback to the cervical spinal cord in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 128, 451-459 (1999).</li><li>Luo, P., Wong, R., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projection+of+jaw-muscle+spindle+afferents+to+the+caudal+brainstem+in+rats+demonstrated+using+intracellular+biotinamide.">Projection of jaw-muscle spindle afferents to the caudal brainstem in rats demonstrated using intracellular biotinamide.</a> J. Comp. Neurol. 358, 63-78 (1995).</li><li>Luo, P., Dessem, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+anatomy+of+physiologically+identified+jaw-muscle+spindle+afferent+terminations+onto+retrogradely+labeled+jaw-elevator+motoneurons+in+the+rat.">Ultrastructural anatomy of physiologically identified jaw-muscle spindle afferent terminations onto retrogradely labeled jaw-elevator motoneurons in the rat.</a> J. Comp. Neurol. 406, 384-401 (1999).</li><li>Hassani, O. K., Henny, P., Lee, M. G., Jones, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GABAergic+neurons+intermingled+with+orexin+and+MCH+neurons+in+the+lateral+hypothalamus+discharge+maximally+during+sleep.">GABAergic neurons intermingled with orexin and MCH neurons in the lateral hypothalamus discharge maximally during sleep.</a> Eur. J. Neurosci. 32, 448-457 (2010).</li><li>Inokawa, H., Yamada, H., Matsumoto, N., Muranishi, M., Kimura, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Juxtacellular+labeling+of+tonically+active+neurons+and+phasically+active+neurons+in+the+rat+striatum.">Juxtacellular labeling of tonically active neurons and phasically active neurons in the rat striatum.</a> Neuroscience. 168, 395-404 (2010).</li></ol>

動物実験は、実験動物の管理と使用に関するガイドに記載されているguidlinesと規則に従って（NIH出版番号86から23まで、1985年改訂）とメリーランド州の動物実験委員会の大学で行われた。

ここに示した方法は、単一ニューロンの機能に重要な洞察を提供し、どのように個々のニューロンの応答は、神経回路に貢献する強力な手法です。9この知識は、感覚運動機能を理解する上での基本です。この手法の最大の強みは、生理学、形態とシナプス形態と分布を含むニューロンに関する多数のパラメータの決定を可能にされているです。そのようなような神経回路のような逆?...

<table border="1"><tbody><tr><th>試薬や機器の名前</th><th>会社</th><th>カタログ番号</th><th>コメント</th></tr><tr><td>電磁バイブレータ</td><td>リン動的システム</td><td> V101 </td><td></td></tr><tr><td>信号発生器</td><td>フィードバックシステム</td><td> PFG605 </td><td>台形の出力信号を作り出すことができる</td></tr><tr><td>電極のガラス</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> AF100 - 68から10 </td><td>フィラメントと</td></tr><tr><td>電極プラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td>モデルP - 2000やP - 80 </td><td></td></tr><tr><td> biotinamide </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> SP - 1120 </td><td> 4℃で保存</td></tr><tr><td>テキサスレッドアビジンDCS </td><td>ベクターラボラトリーズ</td><td> - 2016 </td><td></td></tr><tr><td> tetramethlyrhodamine </td><td>分子プローブ</td><td> D - 3308 </td><td> 3000分子量、リジン修正可能な</td></tr><tr><td>マウス抗シナプトフィジン抗体</td><td>ケミコン</td><td> MAB5258 </td><td></td></tr><tr><td>蛍光ニッスル染色</td><td> Neurotrace、分子プローブ</td><td> N - 21480 </td><td></td></tr><tr><td>電極のテスター</td><td>ウィンストンエレクトロニクス</td><td> BL - 1000 - B </td><td>電極のインピーダンスを測定する</td></tr><tr><td>電位計</td><td>アクソンインスツルメンツ</td><td> Axoprobe 1A、Axoclamp 2B </td><td></td></tr></tbody></table>

physiological, morphological and neurochemical characterization of neurons modulated by movement

個々の神経細胞と神経回路におけるそれらの機能の役割は、感覚と運動機能の神経機構を理解する上での基本です。動物が運動中に静的1,2または記録細胞外神経活動のときに感覚運動メカニズムのほとんどの研究は、神経細胞のいずれかの検査に依存しています。3,4これらの研究は、感覚運動機能のための基本的な背景を提供しているが、彼 ​​らはどちらかの機能的な情報を評価しないこれは、運動中に発生した場合、または完全にニューロンの解剖学、生理学、神経化学的表現型を特徴づけるために彼らの能力は限られています。技術は生体の運動の中に個々のニューロンの大規模な特性評価を可能にするここに示されています。この手法は、一次求心性神経細胞を研究するだけでなく、運動ニューロンと感覚運動の介在を特徴づけるためにだけ使用できます。最初に単一ニューロンの応答は、ニューロンの受容野の決定に続いて下顎骨の様々な動きの間に電気生理学的手法を用いて記録されます。神経トレーサーは、細胞内ニューロンに注入され、脳は、ニューロンが光、電子または共焦点顕微鏡（図1）可視化できるように処理されます。神経形態はニューロン（図2,3）の生理的応答と相関させることができるように特徴づけられる神経細胞の詳細な形態は、再構築されます。この通信ではこの手法の実装を成功させるための重要なキーの詳細とヒントが提供されています。貴重な追加情報は、他の技術とこの手法を組み合わせることにより、研究対象のニューロンのために決定することができます。逆行性神経標識は、標識されたニューロンのシナプスなるとニューロンを決定するために使用することができる、従って神経回路の詳細な測定を可能にします。免疫細胞は標識されたニューロン内の神経伝達物質を調べ、設定されたラベル付きニューロンのシナプスニューロンの化学的表現型を判定するために、このメソッドと組み合わせることができます。標識されたニューロンは、超微細構造の特徴とラベルされたニューロンの超小型回路を決定するために電子顕微鏡のために処理することができます。全体的にこのテクニックは、徹底的にこのように感覚運動機能におけるニューロンの役割にかなりの洞察を可能にする生体運動の中に神経細胞を特徴づけるために強力な方法です。

Watch this Scientific Journal Video about Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement at JoVE.com

Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

テクニックは運動中に哺乳類の神経細胞の生体内生理的反応の定量化と神経形態、神経化学的表現型とシナプス超小型回路とニューロンの生理学を相互に関連付ける説明されています。

運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

The role of individual neurons and their function in neuronal circuits is fundamental to understanding the neuronal mechanisms of sensory and motor ...

physiological-morphological-neurochemical-characterization-neurons

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.7K ビュー.  University of Maryland. テクニックは運動中に哺乳類の神経細胞の生体内生理的反応の定量化と神経形態、神経化学的表現型とシナプス超小型回路とニューロンの生理学を相互に関連付ける説明されています。

ビデオ: Physiological, Morphological and Neurochemical Characterization of Neurons Modulated by Movement

Neuromodulation and Mitochondrial Transport: Live Imaging in Hippocampal Neurons over Long Durations

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured neurons for extended durations1-3. This is now possible through the use of vital dyes and fluorescent proteins with which cytoskeletal components, organelles, and other structures in living cells can be labeled and then visualized via dynamic fluorescence microscopy. For example, in embryonic chicken sympathetic neurons, mitochondrial movement was characterized using the vital dye rhodamine 1234. In another study, mitochondria were visualized in rat forebrain neurons by transfection of mitochondrially targeted eYFP5. However, imaging of primary neurons over minutes, hours, or even days presents a number of issues. Foremost among these are: 1) maintenance of culture conditions such as temperature, humidity, and pH during long imaging sessions; 2) a strong, stable fluorescent signal to assure both the quality of acquired images and accurate measurement of signal intensity during image analysis; and 3) limiting exposure times during image acquisition to minimize photobleaching and avoid phototoxicity.
Here, we describe a protocol that permits the observation, visualization, and analysis of mitochondrial movement in cultured hippocampal neurons with high temporal resolution and under optimal life support conditions. We have constructed an affordable stage-top incubator that provides good temperature regulation and atmospheric gas flow, and also limits the degree of media evaporation, assuring stable pH and osmolarity. This incubator is connected, via inlet and outlet hoses, to a standard tissue culture incubator, which provides constant humidity levels and an atmosphere of 5-10% CO2/air. This design offers a cost-effective alternative to significantly more expensive microscope incubators that don't necessarily assure the viability of cells over many hours or even days. To visualize mitochondria, we infect cells with a lentivirus encoding a red fluorescent protein that is targeted to the mitochondrion. This assures a strong and persistent signal, which, in conjunction with the use of a stable xenon light source, allows us to limit exposure times during image acquisition and all but precludes photobleaching and phototoxicity. Two injection ports on the top of the stage-top incubator allow the acute administration of neurotransmitters and other reagents intended to modulate mitochondrial movement. In sum, lentivirus-mediated expression of an organelle-targeted red fluorescent protein and the combination of our stage-top incubator, a conventional inverted fluorescence microscope, CCD camera, and xenon light source allow us to acquire time-lapse images of mitochondrial transport in living neurons over longer durations than those possible in studies deploying conventional vital dyes and off-the-shelf life support systems.

We describe a protocol that allows imaging of mitochondria in living neurons via fluorescence microscopy over long durations. Imaging over extended periods is accomplished through lentivirus-mediated expression of a mitochondrially targeted fluorescent protein and use of an inexpensive stage-top incubator that was designed and built in our laboratory.

ニューロモデュレーションとミトコンドリア輸送：長時間にわたって海馬ニューロンのライブイメージング

To understand the relationship between mitochondrial transport and neuronal function, it is critical to observe mitochondrial behavior in live cultured ...

神経科学

Analysis of Dendritic Spine Morphology in Cultured CNS Neurons

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These structures are rich in actin and have been shown to be highly dynamic. In response to classical Hebbian plasticity 
as well as neuromodulatory signals, dendritic spines can change shape and number, which is thought to be critical for the refinement of neural 
circuits and the processing and storage of information within the brain. Within dendritic spines, a complex network of proteins link extracellular 
signals with the actin cyctoskeleton allowing for control of dendritic spine morphology and number. Neuropathological studies have demonstrated that 
a number of disease states, ranging from schizophrenia to autism spectrum disorders, display abnormal dendritic spine morphology or numbers. 
Moreover, recent genetic studies have identified mutations in numerous genes that encode synaptic proteins, leading to suggestions that these 
proteins may contribute to aberrant spine plasticity that, in part, underlie the pathophysiology of these disorders. In order to study the potential 
role of these proteins in controlling dendritic spine morphologies/number, the use of cultured cortical neurons offers several advantages. Firstly, 
this system allows for high-resolution imaging of dendritic spines in fixed cells as well as time-lapse imaging of live cells. Secondly, this in 
vitro system allows for easy manipulation of protein function by expression of mutant proteins, knockdown by shRNA constructs, or pharmacological 
treatments. These techniques allow researchers to begin to dissect the role of disease-associated proteins and to predict how mutations of these 
proteins may function in vivo.

Numerous recent studies have identified mutations in synaptic proteins associated with brain pathologies. Primary cultured cortical neurons offer great flexibility in examining the effects of these disease-associated proteins on dendritic spine morphology and motility.

培養中枢神経系ニューロンの樹状突起スパイン形態の解析

Dendritic spines are the sites of the majority of excitatory connections within the brain, and form the post-synaptic 
compartment of synapses. These ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

体外における筋モータープールのために運動ニューロンの識別<em&gt;アメフラシカリフォルニ</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow for an in-depth characterization to identify pathways involved in these events. Cerebellar granule neurons (CGNs) that are derived from the developing cerebellum are an ideal model system that allows for morphological analyses. Here, we describe a method of how to genetically manipulate CGNs and how to study axono- and dendritogenesis of individual neurons. With this method the effects of RNA interference, overexpression or small molecules can be compared to control neurons. In addition, the rodent cerebellar cortex is an easily accessible in vivo system owing to its predominant postnatal development. We also present an in vivo electroporation technique to genetically manipulate the developing cerebella and describe subsequent cerebellar analyses to assess neuronal morphology and migration.

Genetic Manipulation of Cerebellar Granule Neurons In Vitro and In Vivo to Study Neuronal Morphology and Migration

Neuronal morphogenesis and migration are crucial events underlying proper brain development. Here, we describe methods to genetically manipulate cultured cerebellar granule neurons and the developing cerebellum for the assessment of morphology and migratory characteristics of neurons.

小脳顆粒ニューロンの遺伝子操作<em&gt;体外</em&gt;と<em&gt;インビボ</em&gt;ニューロンの形態と移行を研究するために、

Developmental events in the brain including neuronal morphogenesis and migration are highly orchestrated processes. In vitro and in vivo analyses allow ...

Three-dimensional Imaging and Analysis of Mitochondria within Human Intraepidermal Nerve Fibers

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to isolate nerve-specific mitochondria and evaluate disease-induced alterations of mitochondria in the distal tip of sensory nerves. The protocol combines fluorescence immunohistochemistry, confocal microscopy and 3D image analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. Detailed parameters are defined throughout the procedures in order to provide a concrete example of how to use these techniques to isolate nerve-specific mitochondria. Antibodies were used to label nerve and mitochondrial signals within tissue sections of skin punch biopsies, which was followed by indirect immunofluorescence to visualize nerves and mitochondria with a green and red fluorescent signal respectively. Z-series images were acquired with confocal microscopy and 3D analysis software was used to process and analyze the signals. It is not necessary to follow the exact parameters described within, but it is important to be consistent with the ones chosen throughout the staining, acquisition and analysis steps. The strength of this protocol is that it is applicable to a wide variety of circumstances where one fluorescent signal is used to isolate other signals that would otherwise be impossible to study alone.

This protocol uses three-dimensional (3D) imaging and analysis techniques to visualize and quantify nerve-specific mitochondria. The techniques are applicable to other situations where one fluorescent signal is used to isolate a subset of data from another fluorescent signal.

三次元画像と人間の表皮内神経線維内のミトコンドリアの解析

The goal of this protocol is to study mitochondria within intraepidermal nerve fibers. Therefore, 3D imaging and analysis techniques were developed to ...

Quantification of Endosome and Lysosome Motilities in Cultured Neurons Using Fluorescent Probes

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, survival, and glial communications. To date, numerous studies have reported that defects in these systems cause various neuronal diseases. Thus, understanding the mechanisms underlying vesicle dynamics may provide influential clues that could aid in the treatment of several neuronal disorders. Here, we describe a method for quantifying vesicle motilities, such as motility distance and rate of movement, using a software plug-in for the ImageJ platform. To obtain images for quantification, we labeled neuronal endosome-lysosome structures with EGFP-tagged vesicle marker proteins and observed the movement of vesicles using a time-lapse microscopy. This method is highly useful and simplify measuring vesicle motility in neurites, such as axons and dendrites, as well as in the soma of both neurons and glial cells. Furthermore, this method can be applied to other cell lines, such as fibroblasts and endothelial cells. This approach could provide a valuable advancement of our understanding of membrane trafficking.

The investigation of membrane trafficking is crucial for understanding neuronal functions. Here, we introduce a method for quantifying vesicle motility in neurons. This is a convenient method that can be adapted to the quantification of membrane trafficking in the nervous system.

蛍光プローブを用いた培養ニューロンにおけるエンドソームおよびリソソームの動力学の定量

In the brain, membrane trafficking systems play important roles in regulating neuronal functions, such as neuronal morphology, synaptic plasticity, ...

Analyzing Mitochondrial Transport and Morphology in Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neurons in Hereditary Spastic Paraplegia

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human neurons, which may contribute to neurodegeneration in various disease states. Although it is challenging to examine mitochondrial dynamics in live human nerves, such paradigms are critical for studying the role of mitochondria in neurodegeneration. Described here is a protocol for analyzing mitochondrial transport and mitochondrial morphology in forebrain neuron axons derived from human induced pluripotent stem cells (iPSCs). The iPSCs are differentiated into telencephalic glutamatergic neurons using well-established methods. Mitochondria of the neurons are stained with MitoTracker CMXRos, and mitochondrial movement within the axons are captured using a live-cell imaging microscope equipped with an incubator for cell culture. Time-lapse images are analyzed using software with &#34;MultiKymograph&#34;, &#34;Bioformat importer&#34;, and &#34;Macros&#34; plugins. Kymographs of mitochondrial transport are generated, and average mitochondrial velocity in the anterograde and retrograde directions is read from the kymograph. Regarding mitochondrial morphology analysis, mitochondrial length, area, and aspect ratio are obtained using the ImageJ. In summary, this protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology to facilitate studies of neurodegenerative diseases.

Impaired mitochondrial transport and morphology are involved in various neurodegenerative diseases. The presented protocol uses induced pluripotent stem cell-derived forebrain neurons to assess mitochondrial transport and morphology in hereditary spastic paraplegia. This protocol allows characterization of mitochondrial trafficking along axons and analysis of their morphology, which will facilitate the study of neurodegenerative disease.

遺伝性痙性対麻痺におけるヒト人工多能性幹細胞由来ニューロンにおけるミトコンドリア輸送と形態学の解析

Neurons have intense demands for high energy in order to support their functions. Impaired mitochondrial transport along axons has been observed in human ...

3D Particle Tracking for Noninvasive In Vivo Analysis of Synaptic Microtubule Dynamics in Dendrites and Neuromuscular Junctions of Drosophila

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. Furthermore, despite progress in understanding postsynaptic MTs, much less is known about the contributions of presynaptic MTs to neuronal morphogenesis. In particular, studies of in vivo MT dynamics in Drosophila sensory dendrites yielded significant insights into polymer-level behavior. However, the technical and analytical challenges associated with live imaging of the fly neuromuscular junction (NMJ) have limited comparable studies of presynaptic MT dynamics. Moreover, while there are many highly effective software strategies for automated analysis of MT dynamics in vitro and ex vivo, in vivo data often necessitate significant operator input or entirely manual analysis due to inherently inferior signal-to-noise ratio in images and complex cellular morphology. &#160;To address this, this study optimized a new software platform for automated and unbiased in vivo particle detection. Multiparametric analysis of live time-lapse confocal images of EB1-GFP labeled MTs was performed in both dendrites and the NMJ of Drosophila larvae and found striking differences in MT behaviors. MT dynamics were furthermore analyzed following knockdown of the MT-associated protein (MAP) dTACC, a key regulator of Drosophila synapse development, and identified statistically significant changes in MT dynamics compared to wild type. These results demonstrate that this novel strategy for the automated multiparametric analysis of both pre- and postsynaptic MT dynamics at the polymer-level significantly reduces human-in-the-loop criteria. The study furthermore shows the utility of this method in detecting distinct MT behaviors upon dTACC-knockdown, indicating a possible future application for functional screens of factors that regulate MT dynamics in vivo. Future applications of this method may also focus on elucidating cell type and/or compartment-specific MT behaviors, and multicolor correlative imaging of EB1-GFP with other cellular and subcellular markers of interest.&#160;

This study presents a noninvasive intravital neuronal imaging strategy combined with a new software strategy to achieve automated, unbiased tracking and analysis of in vivo microtubule (MT) plus-end dynamics in the sensory dendrites and the neuromuscular junctions of Drosophila.

Microtubules (MTs) play critical roles in neuronal development, but many questions remain about the molecular mechanisms of their regulation and function. ...

An Introduction to Neurophysiology

Neurophysiology is broadly defined as the study of nervous system function. In this field, scientists investigate the central and peripheral nervous systems at the level of whole organs, cellular networks, single cells, or even subcellular compartments. A unifying feature of this wide-ranging discipline is an interest in the mechanisms that lead to the generation and propagation of electrical impulses within and between neurons. This subject is important not only for our understanding of the fascinating processes driving human thought, but also for our ability to diagnose and treat disorders related to nervous system malfunction. This video will provide an introduction to the field of neurophysiology, beginning with a brief history of neurophysiological research that showcases landmark studies like Galvani&#8217;s observations of twitching frog legs and Eccles&#8217;s discovery of the chemical synapse. Next, key questions asked by neurophysiologists are introduced, followed by an overview of some prominent experimental tools used to answer those questions. The methods presented range from techniques used to investigate single cells, like patch clamping, to those that can measure activity across large regions of the brain, like electroencephalography (EEG). Finally, applications of neurophysiological research are discussed, including the development of brain-machine interfaces that allow for device control using thought.

Introduction to Neurophysiology: Methods &amp; Applications

神経生理学入門

 Neurophysiology is broadly defined as the study of nervous system function. In this field, scientists investigate the central and peripheral nervous ...

Education

JoVE Science Education

高等生物学

An Introduction to Cellular and Molecular Neuroscience

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, signaling molecules, and cellular morphology, researchers in this field uncover crucial insights into normal brain development and function, as well as the root causes of many pathological conditions.
This video introduction to the fascinating world of cellular and molecular neuroscience begins with a timeline of landmark studies, from the discovery of DNA in 1953 to more recent breakthroughs like the cloning of ion channels. Next, key questions in the field are introduced, such as how genes influence neuron activity and how the nervous system is modified by experience. This is followed by brief descriptions of some prominent methods used to analyze genetic material in neurons, manipulate expression of genes, and visualize neurons and their parts. Finally, several applications of molecular and cellular neuroscience are presented to demonstrate how cellular and molecular approaches can be used to profile neuron populations and explore their functions.

Cellular and Molecular Neuroscience Research

細胞および分子神経科学への入門

Cellular and molecular neuroscience is one of the newest and fastest growing subdisciplines in neuroscience. By investigating the influences of genes, ...

運動によって変調された神経細胞の生理的、形態学的および神経化学的キャラクタリゼーション

要約

さらに動画を探す

この動画の章