この研究は、UCIの学部研究機会プログラムからの補助金（ARとSP）とカリフォルニアアルツハイマー病のイニシアティブと保健助成金の国民の協会がないの国からの補助金によって支えられて。 HD38466、およびアルツハイマー病研究センターは付与しない。 AG16573（JB）

1。皮質組織ブロックの凍結保存 材料の準備 <ol><li>滅菌水で10倍ストック溶液（1:9）で希釈することにより1Xハンクスバッファード塩類溶液（HBSS）を準備する。 4℃でHBSSを保管してください。 </li><li> HBSS（1:9）でDMSOを希釈して10％DMSOを凍結培地を準備します。凍結培地は、凍結保存前の新鮮なものとチルドまで4℃で保存してください。 </li><li>鋼のカミソリの刃は、組織の体系的チョッピングのために使用されます。使用前に、カミソリの刃は2時間、70％エタノールに浸して殺菌される。すぐに組織の処理の前に、滅菌水で3回カミソリの刃を洗う。それが酸化されやすいため、時間の過度の量の滅菌水にカミソリを放置しない。 </li><li> Nalgeneの冷凍コンテナはcryovials（2.5mL）でロードされ、無菌生物学的なキャビネットに入れられます。チルド凍結培地1mlを各バイアルに追加されます。冷凍コンテナは、少なくとも2時間4℃で配置されます。 </li></ol> 、クリーニングチョッピング、および凍結 <ol><li>フリーズする脳組織は、髄膜と血管の洗浄される。アイスパックの上で作業しながら慎重に組織からごみを削除するには、滅菌針のヒントを参考にしてください。洗浄組織は冷HBSSで軽くすすぎ、チョッピングのための新しいシャーレに転送する必要があります。 </li><li>アイスパックの上部に取り組んで、急速に約1mm 3ブロックに組織を分割する場合に滅菌カミソリの刃を使用してください。より均一なブロックサイズで、その結果、チョッピングの手順を適切に制御における時間の結果で洗浄組織の小さな部分での作業。 </li><li>徐々に50 mLコニカルチューブにHBSS 50mlに切り刻まれた組織を追加します。ゆっくりと、残りの組織ブロックを収集するために、HBSSでペトリ皿を洗う。緩くパックされた組織ブロックペレットを作成し、組織ブロックをチューブの底に下降することができます。 </li><li>組織がセトリングしている間、生物学的安全キャビネット内に以前にチルド冷凍コンテナとcryovialsをもたらす。組織を追加するプロセスを早めるために、すべてのcryovialsを暴露する。 </li><li>すべての組織ブロックが定着した後、軽くペレット上記のメディアの非常に薄い層を残して、余​​分なHBSSを吸引除去する。それが組織ブロックは互いに、大幅に減少冷凍効率に付着する原因となります遠心分離することは推奨されません。 </li><li>ゆっくりと広い開口部（滅菌済みのハサミで先端をカット）とピペットチップを使用して緩い組織ブロックペレットの底から200μLを収集する。 oneクライオバイアルに材料を移し、ペレットの底から次の、もう一度収集組織に移ります。それは全体の組織の割り当ての手順は、冷凍コンテナ3〜4分以上をとらないことが重要です。これは組織が凍結する前に時間の短期間だけDMSOにさらされることが保証されます。バイアルに組織を転送した後、少なくとも4時間、80℃冷凍庫で冷凍コンテナを配置します。また、凍結容器を-80℃で一晩放置することができます。残りの冷凍コンテナ用にこのプロセスを繰り返します。 </li><li>冷凍コンテナ（複数可）から長期保存用液体窒素タンクでcryoboxと場所にcryovialsを転送します。 </li></ol> 2。融解と凍結皮質組織ブロックの培養 材料の準備 <ol><li>前に解凍組織サンプルへの一日は、ポリ- L -リジンコートしたペトリ皿/カバースリップを用意しています。一般的には、皮質ニューロンのために我々は500μg/ mLのまたは1mgの/ mLでコーティングされた料理を準備。完全に皿の底をカバーするのに十分なポリ- L -リジン溶液を（ホウ酸緩衝液で作られた）を追加します。ガラス製カバースリップが必要な場合、それらは完全にポリ- L -リジン溶液で浸漬されていることを確認してください。少なくとも12時間インキュベートする。ご使用の前に、徹底的に滅菌水で3回、5分ごとのリベラルな量の料理をすすぐ。 </li><li>暖かいHBSSは、細胞懸濁液に組織を解離するだけでなく、解凍した組織をきれいにするために使用されます。必要なHBSSの量は、融解する組織の量によって異なりますが、通常は1クライオバイアルは、HBSSを50mLに希釈し、HBSSを10mLの解離になります。 </li><li> 10％の鉄添加仔ウシ血清（EBS）と1％のダルベッコ変法イーグル培地抗生物質/抗真菌剤（AA）混合物（DMEM (++))は37℃の水浴中に配置する必要があります。 </li><li>メッキの培地（NB (+++))は使用前に新鮮なされるべきである。この培地は、抗生物質/抗真菌剤に加えてB27とN2のサプリメントを1％添加することによって調製される。 </li></ol> 注：十字（+）を付加したメディア名がメディアの塩基組成に添加剤を含めることを示す。このテキストでは、DMEM（+ +）を意味するDMEM + 10％EBSプラス1％AA、一方、NB (+++)で囲まNB PL私たち一パーセントAAプラスB27プラスN2。 解凍と培養 <ol><li>液体窒素タンクからcryovialsを削除し、急速に37℃で融解°のみ小さなアイスペレットになるまでの水浴中でCがバイアルの内容の内部に観察される。 </li><li>静かにコニカルチューブに暖かいHBSS 50mlのバイアルの内容を転送する。優しくクライオバイアルにはまり、残りの組織ブロックを取り除くために、広い開口部の先端を使用してください。チューブを3-4回転倒し、組織が徐々に下部に収集することができます。組織は、迅速に解決するはずですが、ブロックが小さすぎる場合、これは推奨されている遠心分離（〜200 × g）を発生し、点灯しないことがあります。 </li><li>過剰なHBSSを吸引除去する。 </li><li>組織ペレットと、0.25％トリプシンとDNAase 50μL、300μLに暖かいHBSSを10mLを追加。 5分間37℃の水浴中でインキュベートし、その後、軌道シェーカーの場所は、° C、さらに5分間に80回転と37に設定。 </li><li>この期間の後、生物学的安全キャビネット内に組織ブロックを持参し、曇った細胞懸濁液が形成されるまで慎重に組織ブロックを撹拌するために10 mLのピペットを使用してください。暖かいDMEM 10mLを加えることによってトリプシンを非活性化（+ +）細胞懸濁液に。 </li><li> 5分間1200 × gで解離細胞を遠心分離します。上清を吸引し、廃棄、暖かいDMEM 10mLに細胞ペレットを再懸濁します（+ +）と血球計数器を用いて細胞数を定量化する。 </li><li>ポリ- L -リジンコートディッシュ上に細胞をプレート。通常は、60 mmディッシュは、1 × 10 6個の細胞でメッキされます。 </li><li>細胞は組織培養インキュベーターで約1時間のための料理/カバーガラスに付着することができます。それは、効果的な添付ファイルが観察されるまでワンプレートで10分ごとに添付ファイルの進捗を監視することをお勧めします。その後、ゆっくりと新鮮なDMEM (++).で培地を交換してください</li><li> 24時間後、DMEMを交換してください（+ +）暖かいNB (+++).と部分的な媒質の変化（50％）は新鮮なNB (+++).で5日ごとに行われている健全な文化は、通常、24時間後に分化し、プロセスの成長の兆しを示しています。これらの条件下で、そしてすべての4-5日の部分培地の変更を行う、培養物まで4-6週間の時間の長時間維持することができます。 </li><li>神経前駆細胞（NPCに）の生成では、同様のプロトコルは遠心分離後、EBSのないDMEMが使用されていることを除いて使用されます。細胞はneuropheresの形成を可能にするためにB27とEGF（20 ng / mL）を補充したDMEM/F12（1:3）でT - 25フラスコに播種されています。 NPCを区別するには、ニューロスフェアは、ラミニン（10 ug / mlと）DMEM/F12（1:3）N2を添加した培地でコーティングされたカバースリップ上に播種されています。 </li></ol> 3。代表的な結果健全な文化は、5日後に解凍した後、大幅な成長と分化を表示され、通常10日間（図1）によって、その成長に安定します。これらの培養物のImmuncocytochemical染色では多数の星状膠細胞（図2A）を明らかにし、ヒトおよびラットの両方の主ニューロン培養のための神経細胞（図2B）。このプロトコルは、また高品質の混合培養（図3B、C）の結果がどの差別化条件の下で自由に浮遊ロスフェア（図3A）、などのNPCの発電に適しています。 <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。凍結ヒト皮質組織の細胞培養。凍結ヒト皮質組織ブロックを解凍し、播種ポリリジンコートしたカバースリップ上で10日間栽培されている。日までに5セルの拡張は明らかであり、一日で10コンフルエントが達成されます。スケールバー：100μmである。 <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig2.jpg" alt="図2" /> 図2。培養細胞の免疫細胞化学染色。（）培養物は、グリアマーカーグリア線維性酸性タンパク質（GFAP、太い矢印）で染色した。 （B）神経細胞は神経マーカーβ-チューブリンIII（TIII、細い矢印）で検出した。 （C）ともに、ヒトおよびラットの文化は文化の中で10日後の豊かなグリア細胞と神経細胞を示す。一次抗体：マウス抗GFAP（1:1000）とウサギ抗- TIII（1:1000）。二次抗体：抗マウスアレクサ594（1:500）と抗ウサギアレクサ488（1:500）。核染色：Hoestchブルー（1:1000）。スケールバー：50μmである。 <img src="/files/ftp_upload/2384/2384fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。ニューロスフェアの世代。（）凍結組織は、上記のように処理し、ニューロスフェアとして伝播させた。 （B）ニューロスフェアは、離れてニューロスフェアから移行する細胞で、その結果、差別化の条件下でガラス製カバースリップ上にプレーティングし、10日間増殖させた。 （C）ニューロンとアストロサイトはどちらも差別化ニューロスフィアの拡大フリンジに存在している。核の対比染色、図2のように使用される一次および二次抗体。

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	<li>Robbins, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+human+brain+tissue.">Cryopreservation of human brain tissue.</a> Exp Neurol. 107, 208-213 (1990).</li><li>Ware, C. B., Nelson, A. M., Blau, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Controlled-rate+freezing+of+human+ES+cells.">Controlled-rate freezing of human ES cells.</a> Biotechniques. 38, 879-880 (2005).</li><li>Paynter, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+practical+issues+for+cryopreservation+of+nerve+cells.">Principles and practical issues for cryopreservation of nerve cells.</a> Brain Res Bull. 75, 1-14 (2008).</li><li>Thirumala, S., Gimble, J. M., Devireddy, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+stromal+vascular+fraction+of+adipose+tissue+in+a+serum-free+freezing+medium.">Cryopreservation of stromal vascular fraction of adipose tissue in a serum-free freezing medium.</a> J Tissue Eng Regen Med. 4, 224-232 (2010).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

冷凍保存は、将来の使用のために銀行貴重な脳組織のサンプルをする機会を提供しています。ここでは、ニューロンの濃縮培養と凍結脳組織ブロックからの神経前駆細胞の両方を生成するために単純だが効果的なプロトコルを記述する。この経済的な手順は、より高価な速度制御の冷凍庫を利用する従来の凍結保存技術のコストを回避することができます。プロトコルは、実行可能なニューロン培養組織ブロックを凍結する迅速な、まだ効果的な手段を提供することにより、後の融解の発生することができます。全体凍結のプロセスは、わずか20分かかることがあります。一次ニューロン培養に加えて、このメソッドは組織ブロックを使用しても、自由に浮遊ロスフェアとして成長NPCを生成するために解凍することができます。この点で、私たちの凍結培地中の血清の不足は、細胞が未分化状態で維持されることが保証されます。差別化の条件下では、ニューロスフェアは、凍結組織ショーの拡大と、新鮮な組織から生成されたニューロスフェアへの非常に匹敵する分化率から生産。

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Invitrogen</td><td>11995-073</td><td>High gluclose 1X</td></tr><tr><td>Bovine calf serum supplemented</td><td>Hyclone</td><td>SH30072.03</td><td>For culture medium </td></tr><tr><td>Neurobasal-A Medium (1X), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>1088-022</td><td></td></tr><tr><td>B27 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17504-044</td><td>Supplement for Neurobasal medium</td></tr><tr><td>N2 Supplement</td><td>Invitrogen</td><td>17502-048</td><td>Supplement for Neurobasal medium</td></tr><tr><td>Trypsin (10X)</td><td>Cellgro</td><td>25-054CI</td><td>Tissue dissociation</td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease 1 from bovine pancreas (DNase)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4527-30KU</td><td>Tissue dissociation</td></tr><tr><td>Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) (10X)</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>14065</td><td>Cleaning tissue, washes, and freezing medium</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine- 500mg</td><td>Invitrogen</td><td>P2636</td><td>Substrate for adhesion of neuronal cells</td></tr><tr><td>antibiotic-antimycotic (100X), liquid</td><td>Invitrogen</td><td>15240-062</td><td>To prevent contamination</td></tr><tr><td>Large orifice pipette Tips (1-200 ul)</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-141</td><td>To prevent shear stress to cells</td></tr><tr><td>Graduated pipette tips (101-1000 ul)</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1111-2721</td><td></td></tr><tr><td>21 G1 precision guide needles</td><td>BD Biosciences</td><td>305165</td><td>To clean tissue</td></tr><tr><td>10 ml pipette </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>1071-0810</td><td>Individually wrapped</td></tr><tr><td>50 ml tubes</td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>926-9-04</td><td></td></tr><tr><td>Single edge razor blade</td><td>Smith &amp;amp; Nephew Inc.</td><td>67-0238</td><td>To chop tissue</td></tr><tr><td>60 x 15 mm polystyrene petri dish </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0160</td><td>For general culture</td></tr><tr><td>100 x 15 mm polystyrene petri dish </td><td>USA Scientific, Inc.</td><td>8609-0010</td><td>For cleaning tissue</td></tr><tr><td>Cryogenic box </td><td>Nalge Nunc international</td><td>5026-1010</td><td></td></tr><tr><td>Freezing container</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5100-0001</td><td>&quot;Mr. Frosty&quot;</td></tr><tr><td>2.0 ml cryogenic vials</td><td>Nalge Nunc international</td><td>5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>D128-500</td><td>For freezing medium</td></tr><tr><td>Ethanol 200 proof</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>For sterilizing razor blade</td></tr></tbody></table>

cryopreservation of cortical tissue blocks for the generation of highly enriched neuronal cultures

本研究では、我々は、高濃縮ニューロン培養を生成するために皮質脳組織ブロックの成功凍結保存と解凍のための標準化されたプロトコルの概要を説明します。このプロトコルで使用される凍結培地は、ハンクのバッファ塩溶液（HBSS）で希釈した10％のジメチルスルホキシド（DMSO）である。皮質組織のブロックは、凍結培地を含むcryovialsに転送され、徐々に速度制御された冷凍コンテナの° C / min -1ので凍結されています。解凍後の処理と一貫して10日以内に文化と神経回路網の大幅な拡大の最初の5日間に急速な神経突起の成長を示した神経細胞に富む文化を生成した凍結組織ブロックの解離。アストロサイトマーカーグリ​​ア線維性酸性タンパク質（GFAP）および神経マー​​カーβ-チューブリンクラスIIIと免疫細胞化学的染色は、文化のニューロンとアストロサイトの高い数字を明らかにした。組織ブロックの解離後の神経前駆細胞培養の世代は急速に分化する条件下でニューロンとアストロサイトの大きな数字を生成したニューロスフェアを、拡大をもたらした。この単純な凍結保存プロトコルは、神経細胞アストロサイト、および神経前駆細胞培養の後の世代のための高い柔軟性を与える皮質脳組織ブロックの迅速、効率的、かつ安価な保存、することができます。

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Cryopreservation of Cortical Tissue Blocks for the Generation of Highly Enriched Neuronal Cultures

ここで、我々は、効率的な凍結保存方法を説明し、高濃縮ニューロン培養を生成するために皮質脳組織ブロックの解凍。この単純なプロトコルでは、神経細胞のアストロサイト、および神経前駆細胞培養の後の世代のための柔軟性を提供します。

高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存

In this study, we outline a standardized protocol for the successful cryopreservation and thawing of cortical brain tissue blocks to generate highly ...

cryopreservation-cortical-tissue-blocks-for-generation-highly

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

13.6K ビュー.  University of California, Irvine. ここで、我々は、効率的な凍結保存方法を説明し、高濃縮ニューロン培養を生成するために皮質脳組織ブロックの解凍。この単純なプロトコルでは、神経細胞のアストロサイト、および神経前駆細胞培養の後の世代のための柔軟性を提供します。

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Strategies for Study of Neuroprotection from Cold-preconditioning

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by development of effective, easy to administer and safe preconditioning treatments. We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. Low-level pro-inflammatory mediator signaling changes over time are essential for cold-preconditioning neuroprotection. This signaling is consistent with the basic tenets of physiological conditioning hormesis, which require that irritative stimuli reach a threshold magnitude with sufficient time for adaptation to the stimuli for protection to become evident.
Accordingly, delineation of the immune signaling involved in cold-preconditioning neuroprotection requires that biological systems and experimental manipulations plus technical capacities are highly reproducible and sensitive. Our approach is to use hippocampal slice cultures as an in vitro model that closely reflects their in vivo counterparts with multi-synaptic neural networks influenced by mature and quiescent macroglia / microglia. This glial state is particularly important for microglia since they are the principal source of cytokines, which are operative in the femtomolar range. Also, slice cultures can be maintained in vitro for several weeks, which is sufficient time to evoke activating stimuli and assess adaptive responses. Finally, environmental conditions can be accurately controlled using slice cultures so that cytokine signaling of cold-preconditioning can be measured, mimicked, and modulated to dissect the critical node aspects. Cytokine signaling system analyses require the use of sensitive and reproducible multiplexed techniques. We use quantitative PCR for TNF-&alpha; to screen for microglial activation followed by quantitative real-time qPCR array screening to assess tissue-wide cytokine changes. The latter is a most sensitive and reproducible means to measure multiple cytokine system signaling changes simultaneously. Significant changes are confirmed with targeted qPCR and then protein detection. We probe for tissue-based cytokine protein changes using multiplexed microsphere flow cytometric assays using Luminex technology. Cell-specific cytokine production is determined with double-label immunohistochemistry. Taken together, this brain tissue preparation and style of use, coupled to the suggested investigative strategies, may be an optimal approach for identifying potential targets for the development of novel therapeutics that could mimic the advantages of cold-preconditioning.

We seek to define the neural immune signaling responsible for cold-preconditioning as means to identify novel targets for therapeutics development to protect brain before injury onset. We present strategies for such work that require biological systems, experimental manipulations plus technical capacities that are highly reproducible and sensitive.

コー​​ルド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

Neurological injury is a frequent cause of morbidity and mortality from general anesthesia and related surgical procedures that could be alleviated by ...

神経科学

Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and synapse formation and function. An advantage of culturing these neurons is that they readily polarize, forming distinctive axons and dendrites, on a two dimensional substrate at very low densities. This property has made them extremely useful for determining many aspects of neuronal development. Furthermore, by providing glial conditioning for these neurons they will continue to develop, forming functional synaptic connections and surviving for several months in culture. In this protocol we outline a technique to dissect, culture and transfect embryonic mouse hippocampal and cortical neurons. Transfection is accomplished by electroporating DNA into the neurons before plating via nucleofection. This protocol has the advantage of expressing fluorescently-tagged fusion proteins early in development (~4-8hrs after plating) to study the dynamics and function of proteins during polarization, axon outgrowth and branching. We have also discovered that this single transfection before plating maintains fluorescently-tagged fusion protein expression at levels appropriate for imaging throughout the lifetime of the neuron (&gt; 2 months in culture). Thus, this methodology is useful for studying protein localization and function throughout CNS development with little or no disruption of neuronal function.

This protocol outlines the steps required to dissect, transfect via electroporation and culture mouse hippocampal and cortical neurons. Short-term cultures may be used for studies of axon outgrowth and guidance, while long-term cultures can be used for studies of synaptogenesis and dendritic spine analysis.

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

Hippocampal and cortical neurons have been used extensively to study central nervous system (CNS) neuronal polarization, axon/dendrite outgrowth, and ...

Preparing E18 Cortical Rat Neurons for Compartmentalization in a Microfluidic Device

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously dissected and prepared. The E18 cortex is, upon dissection, immediately dissociated into individual neurons. It is possible to store E18 cortex in Hibernate E buffer containing B27 at 4&deg;C for up to a week before the dissociation is performed. However, there will be a drop in cell viability. Typically we obtain our E18 Cortex fresh. It is transported to the lab in ice cold Calcium free Magnesium free dissection buffer (CMFM). Upon arrival, trypsin is added to the cortex to a final concentration of 0.125%. The cortex is then incubated at 37&deg;C for 8 minutes. DMEM containing 10% FBS is added to the cortex to stop the reaction. The cortex is then centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is removed and 2 ml of Neural Basal Media (NBM) containing 2% B27 (vol/vol) and 0.25% Glutamax (vol/vol) is added to the cortex which is then re-suspended by pipetting up and down. Next, the cortex is triturated with previously fire polished glass pipettes, each with a successive smaller opening. After triturating, the cortex is once again centrifuged at 2500 rpm for 2 minutes. The supernatant is then removed and the cortex pellet re-suspended with 2 ml of NBM containing B27 and Glutamax. The cell suspension is then passed through a 40 um nylon cell strainer. Next the cells are counted. The neurons are now ready for loading into the neuron microfluidic device.

In this video we demonstrate the preparation of E18 Cortical Rat Neurons.

マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

In this video, we demonstrate the preparation of E18 cortical rat neurons. E18 cortical rat neurons are obtained from E18 fetal rat cortex previously ...

生物学

Preparation of Dissociated Mouse Cortical Neuron Cultures

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures can be used for a variety of applications including immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging, protein and/or RNA isolation. These cultures also provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a late embryonic or postnatal lethal gene mutation. The procedure is relatively straight forward, requires some experience in tissue culture technique and should not take longer than two to three hours if you are properly prepared. Careful separation of the cortical rind from the thalamo-cortical fiber tract will reduce the number of unwanted non-neuronal cells. To increase yields of neuronal cells triturate the pieces of the cortical tissue gently after the enzyme incubation step. This is imperative as it prevents unnecessary injury to cells and premature neuronal cell death. Since these cultures are maintained in the absence of glia feeder cells, they also offer an added advantage of growing cultures enriched in neurons.

This video shows a procedure for generating neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse cortex. These cultures can be used for immunocytochemistry, biochemistry, electrophysiology, calcium and sodium imaging and provide a platform to study the neuronal development of transgenic animals that carry a postnatal lethal gene mutation.

解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

This video will guide you through the process for generating cortical neuronal cultures from late embryo and early postnatal mouse brain. These cultures ...

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the first born neurons remain closer to the ventricle while the last born neurons migrate past the first born neurons towards the surface of the brain1. In addition to neuronal migration2, a key process for normal cortical function is the regulation of neuronal morphogenesis3. While neuronal morphogenesis can be studied in vitro in primary cultures, there is much to be learned from how these processes are regulated in tissue environments.
We describe techniques to analyze neuronal migration and/or morphogenesis in organotypic slices of the cerebral cortex4,6. A pSilencer modified vector is used which contains both a U6 promoter that drives the double stranded hairpin RNA and a separate expression cassette that encodes GFP protein driven by a CMV promoter7-9. Our approach allows for the rapid assessment of defects in neurite outgrowth upon specific knockdown of candidate genes and has been successfully used in a screen for regulators of neurite outgrowth8. Because only a subset of cells will express the RNAi constructs, the organotypic slices allow for a mosaic analysis of the potential phenotypes. Moreover, because this analysis is done in a near approximation of the in vivo environment, it provides a low cost and rapid alternative to the generation of transgenic or knockout animals for genes of unknown cortical function. Finally, in comparison with in vivo electroporation technology, the success of ex vivo electroporation experiments is not dependant upon proficient surgery skill development and can be performed with a shorter training time and skill.

Methods for Study of Neuronal Morphogenesis: Ex vivo RNAi Electroporation in Embryonic Murine Cerebral Cortex

To conduct a rapid assessment of the function of genes in the development of cerebral cortex, we describe methods involving the ex vivo electroporation of plasmids co-expressing inhibitory RNA (RNAi) and GFP in murine embryonic cortex. This protocol is amenable to the study of various aspects of neurodevelopment such as neurogenesis, neuronal migration and neuronal morphogenesis including dendrite and axon outgrowth.

神経形態形成の研究のための方法：<em&gt;エキソビボ</em胎児マウス大脳皮質&gt; RNAiのエレクトロポレーション

The cerebral cortex directs higher cognitive functions. This six layered structure is generated in an inside-first, outside-last manner, in which the ...

Isolation and Culture of Rat Embryonic Neural Cells: A Quick Protocol

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied successfully to the isolation of mouse and human primary neurons and neural progenitors. Dissociated neurons are maintained in serum-free medium up to several weeks. These cultures can be used for nucleofection, immunocytochemistry, nucleic acids preparation, as well as electrophysiology. Older neuronal cultures can also be transfected with a good efficiency rate by lentiviral transduction and, less efficiently, with calcium phosphate or lipid-based methods such as lipofectamine.

We describe a rapid methodology to isolate and culture hippocampal and cortical neurons from rodent embryos. This protocol allows us to perform experiments in which nearly pure neuronal cultures are required.

ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

We are describing a quick method to dissociate and culture hippocampal or cortical neurons from E15-17 rat embryos. The procedure can be applied ...

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The coordination of two Ca2+ signal sources&#8212;&#8220;Ca2+ influx&#8221; from outside the cell and &#8220;Ca2+ release&#8221; from the intracellular Ca2+ store endoplasmic reticulum (ER)&#8212;is considered to underlie the diverse spatio-temporal patterns of Ca2+ signals that cause multiple biological functions in cells. The purpose of this protocol is to describe a new Ca2+ imaging method that enables monitoring of the very moment of &#8220;Ca2+ influx&#8221; and &#8220;Ca2+ release&#8221;. OER-GCaMP6f is a genetically encoded Ca2+ indicator (GECI) comprising GCaMP6f, which is targeted to the ER outer membrane. OER-GCaMP6f can monitor Ca2+ release at a higher temporal resolution than conventional GCaMP6f. Combined with plasma membrane-targeted GECIs, the spatio-temporal Ca2+ signal pattern can be described at a subcellular resolution. The subcellular-targeted Ca2+ indicators described here are, in principle, available for all cell types, even for the in vivo imaging of Caenorhabditis elegans neurons. In this protocol, we introduce Ca2+ imaging in cells from cell lines, neurons, and glial cells in dissociated primary cultures, and describe the preparation of frozen stock of rat cortical neurons.

Dissection of Local Ca2+ Signals in Cultured Cells by Membrane-targeted Ca2+ Indicators

Here we present a protocol for Ca2+ imaging in neurons and glial cells, which enables the dissection of Ca2+ signals at subcellular resolution. This process is applicable to all cell types that allow the expression of genetically encoded Ca2+ indicators.

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

Calcium ion (Ca2+) is a universal intracellular messenger molecule that drives multiple signaling pathways, leading to diverse biological outputs. The ...

A Cell Culture Model for Studying the Role of Neuron-Glia Interactions in Ischemia

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent neuronal loss. Numerous evidence suggests that the interaction between glial and neuronal cells exert beneficial effects after an ischemic event. Therefore, to explore potential protective mechanisms, it is important to develop models that allow studying neuron-glia interactions in an ischemic environment. Herein we present a simple approach to isolate astrocytes and neurons from the rat embryonic cortex, and that by using specific culture media, allows the establishment of neuron- or astrocyte-enriched cultures or neuron-glia cultures with high yield and reproducibility.
To study the crosstalk between astrocytes and neurons, we propose an approach based on a co-culture system in which neurons cultured in coverslips are maintained in contact with a monolayer of astrocytes plated in multiwell plates. The two cultures are maintained apart by small paraffin spheres. This approach allows the independent manipulation and the application of specific treatments to each cell type, which represents an advantage in many studies.
To simulate what occurs during an ischemic stroke, the cultures are subjected to an oxygen and glucose deprivation protocol. This protocol represents a useful tool to study the role of neuron-glia interactions in ischemic stroke.

Here, we present a simple approach using specific culture media that allows the establishment of neuron- and astrocyte-enriched cultures, or neuron-glia cultures from the embryonic cortex, with high yield and reproducibility.

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

Ischemic stroke is a clinical condition characterized by hypoperfusion of brain tissue, leading to oxygen and glucose deprivation, and the consequent ...

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to study the process of neuronal survival upon cytotoxic stress. Most methods are based on biochemical approaches that do not allow single-cell resolution or involve complex and costly methodologies. Presented here is a versatile, inexpensive, and effective experimental paradigm to study neuronal survival. This method takes advantage of sparse fluorescent labeling of the neurons followed by live imaging and automated quantification. To this aim, the neurons are electroporated to express fluorescent markers and co-cultured with non-electroporated neurons to easily regulate cell density and increase survival. 
Sparse labeling by electroporation allows a simple and robust automated quantification. In addition, fluorescent labeling can be combined with the co-expression of a gene of interest to study specific molecular pathways. Here, we present a model of stroke as a neurotoxic model, namely, the oxygen-glucose deprivation (OGD) assay, which was performed in an affordable and robust homemade hypoxic chamber. Finally, two different workflows are described using IN Cell Analyzer 2200 or the open-source ImageJ for image analysis for semi-automatic data processing. This workflow can be easily adapted to different experimental models of toxicity and scaled up for high-throughput screening. In conclusion, the described protocol provides an approachable, affordable, and effective in vitro model of neurotoxicity, which can be suitable for testing the roles of specific genes and pathways in live imaging and for high-throughput drug screening.

Here, we present a simple, potent, and versatile methodology to investigate neuronal survival upon cytotoxic stress in primary cortical neurons with cellular resolution in real time or in fixed material.

Neuronal loss is at the core of many neuropathologies, including stroke, Alzheimer's disease, and Parkinson's disease. Different methods were developed to ...

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and large-scale genomic and drug screening. Due to the self-organizing nature of cells in brain organoids and the growing range of available protocols for their generation, issues with heterogeneity and variability between organoids have been identified. In this protocol paper, we describe a robust and replicable protocol that largely overcomes these issues and generates cortical organoids from neuroectodermal progenitors within 1 month, and that can be maintained for more than 1 year. This highly reproducible protocol can be easily carried out in a standard tissue culture room and results in organoids with a rich diversity of cell types typically found in the developing human cortex. Despite their early developmental make-up, neurons and other human brain cell types will start to exhibit the typical signs of senescence in neuronal cells after prolonged in vitro culture, making them a valuable and useful platform for studying aging-related neuronal processes. This protocol also outlines a method for detecting such senescent cells in cortical brain organoids using senescence-associated beta-galactosidase staining.

Robust and Highly Reproducible Generation of Cortical Brain Organoids for Modelling Brain Neuronal Senescence In Vitro

In this study, we provide a detailed technique for a simple yet robust cortical organoid culture system using standard feeder-free hPSC cultures. This is a rapid, efficient, and reproducible protocol for generating organoids that model aspects of brain senescence in vitro.

インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

Brain organoids are three-dimensional models of the developing human brain and provide a compelling, cutting-edge platform for disease modeling and ...

高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存

要約

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この動画の章

コールド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

神経形態形成の研究のための方法：

ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

膜をターゲットとした Ca^{2 +}インジケーターによる培養細胞のローカル Ca^{2 +}シグナルの解剖

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

高濃縮ニューロン培養の世代のための皮質組織ブロックの凍結保存

要約

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コー​​ルド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

Nucleofectionとマウス胎児海馬および皮質ニューロンの初代培養

マイクロ流体デバイスでコンパートメントのためのE18脳ラットのニューロンの準備

解離マウス皮質ニューロンの培養の準備

神経形態形成の研究のための方法：

ラット胚神経細胞の分離と文化：クイックプロトコル

膜をターゲットとした Ca2 +インジケーターによる培養細胞のローカル Ca2 +シグナルの解剖

虚血におけるニューロングリア相互作用の役割を研究するための細胞培養モデル

A Scalable Method to Study Neuronal Survival in Primary Neuronal Culture with Single-cell and Real-Time Resolution

インビトロでの脳ニューロン老化のモデリングのための皮質脳オルガノイドの堅牢で再現性の高い生成

コールド - プレコンディショニングによる神経保護の研究のための戦略

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