この研究は、RDWの国立科学財団のキャリア賞（MCB - 0746066、創発行動を規制する転写活性化因子の特性）によって可能となった私たちは、原稿上で有用な議論やコメントのためのLJシムカス、BSゴールドマン、G.孫、M.歌手、LGウェルチ、KAマーフィー、およびHGテイラーに感謝しています。

消耗品は必要なもの： <ul><li>クレットメートル</li><li>ピペットとヒント</li><li> 2.5ミリリットルマイクロ遠心チューブ</li><li>マイクロ遠心機</li><li> CTTYEメディア： <ul><li> 1.0％Casitone（ディフコ社）、0.5％酵母エキス（ディフコ社）、 </li><li> 10.0 mMトリス塩酸（pH8.0）、1.0mMのKH 2 PO 4、8.0 mMのMgSO 4を </li></ul></li><li> TPMメディア： <ul><li> 10.0 mMトリス塩酸（pH8.0）、1.0mMのKH 2 PO 4、8.0 mMのMgSO 4を </li></ul></li><li>アガロース</li><li> 55 ° Cに設定したウォーターバス</li><li>顕微鏡用スライドガラス</li><li>大きなガラス製カバースリップ</li><li> 2 × 2センチ、0.5 mm厚のシリコーンゴムガスケット（グレースバイオラボ社） </li><li>パラフィルム（またはテープにラベルを付ける） </li><li>鉗子</li><li>小さなバインダークリップ</li><li>マイクロサンプリングピペット（フィッシャー） </li><li> 100μlのガラスディスポチップ（フィッシャー） </li><li>キムワイプ</li></ul>パート1：セルの準備無菌環境を作成することから始めます。 <ul><li>クリーンワークスペース、ドン手袋、および光バーナー。 </li></ul><ol><li> CTTYEブロスを含むフラスコに接種し、精力的な渦巻きで32℃の暗所でインキュベートして細胞の一晩培養を開始します。 </li><li>かつての文化は、2.5 mlマイクロチューブに5 × 10 8細胞/ ml、ピペット1mlの細胞の密度に達した。 </li><li> 16000 XG（または最高速度）で2分間の遠心分離により細胞をペレット化する。 </li><li>デカントして上清を捨てる。 </li><li> 1ミリリットルTPM（塩バランス、栄養培地）で細胞ペレットを洗浄する。 <ul><li>再サスペンドと渦</li></ul></li><li> 16000 XG（または最高速度）で2分間回転させて再細胞をペレット化。 </li><li>デカントして上清を捨てる。 重要なステップ </li><li>完全にピペッティングし、ボルテックスの組み合わせを使用して100μlのTPMのメディアでペレットを再懸濁する。 重要：このステップでは、チューブに残っている細胞のない塊がないことを保証します。これには時間がかかることがあります。 </li><li>追跡アッセイプレートを準備しながら、室温で脇にセルを設定します。 </li></ol>パート2：寒天の準備<ol><li> TPM（アッセイ培地）とCTTYE（栄養ディスク）メディアの両方を50mlを準備します。 </li><li>各（アガロースは寒天より小さい回折である）で0.5 Gアガロースを追加。 </li><li>滅菌にオートクレーブ。 </li><li>追跡アッセイプレートの複合体を構築しながら滅菌した後、55℃インキュベーターでC（または水浴）でメディアを維持する。 </li></ol>パート3：ニュートリティブディスクの構築<ol><li>小さなウェルを形成、火炎滅菌したガラスの顕微鏡スライドの上に滅菌した0.5 mm厚のシリコーンゴムのガスケットを置きます。 </li><li>ピペットでよく、スライド上のガスケットによって作成され、栄養ディスクを含むに55℃CTTYEメディア/アガロースを300μl。 CTTYEメディア/アガロースは、マウンドアップすべき。 </li><li> CTTYEメディア/アガロースの上に火炎滅菌スライドを（なしガスケット付き）に置きます。 重要：このスライドは、形成される気泡を防ぐために、角度で下に設定する必要があります。 </li><li>スライドが配置されると、ミニバインダークリップと一緒に複雑なクランプ - 各側に1つを。 </li><li> 4℃をクリップコンプレックスを置き、CTTYEメディア/アガロースを設定することができます。これは通常、約5分かかります。 </li></ol>パート4：追跡アッセイの準備 - プレート錯体を設定 、コンポーネントを組み立てるスライドの複合体を準備し、栄養ディスクを置き、TPMメディア/アガロースを注ぎ、別と乾板の複合体、プレートの細胞を、そして追跡アッセイプレートの複合体を組み立てる。 プレート複雑なコンポーネントを組み立てる<ol><li>それぞれ複雑なため、炎がガラスの顕微鏡スライドを滅菌</li><li>スライドの上にオートクレーブガスケットを配置して（面を上にして滅菌）脇に置いておきます。これは、アッセイの底部を形成することになる。 </li><li>炎は、ガラスのカバースリップを滅菌し、第2のガラス顕微鏡スライドラベルテープ（またはパラフィルム）で包み、（側を上に滅菌）取っておくの上に置きます。これは、クラッキングからカバースリップを保つためにサポートのスライドとして使用されます。これは、アッセイの上部を形成することになる。 </li><li>炎はサードガラスの顕微鏡スライドを滅菌して（面を上にして滅菌）脇に置いておきます。これは、アガロースを平らにするために使用されます。 重要：ガスケットは、鉗子でそれを押すことで、ガラスとのシールを形成することを確認し、そうでなければメディア/アガロースが完全に乾くことがあります。 </li></ol> P<html>栄養ディスクをレース重要：手順5〜10は、一度に複雑な1枚のスライドに行う必要があります、それ以外のメディア/アガロースは悪いムービーの画質が得固化し始めることができます。 <ol start="5"><li>栄養ディスク複雑なフォームを削除4 ° C（パート3からステップ5）と、今固化CTTYE /アガロースを公開するスライドを離れてテコで。 </li><li>よく100μlのガラス使い捨てチップとマイクロサンプリングピペットを用いて、上記CTTYEメディア/アガロースから直径1mm&quot;栄養ディスク&#39;を削除してもカバースリップ（上記手順3）でガスケットによって作成されたに入れてください。 </li></ol>プレートに注ぎ 重要なステップ <ol start="7"><li>ピペットでよくカバースリップでガスケットによって作成され、栄養ディスクを含むに55℃TPMメディア/アガロースを300μl。 TPMメディア/アガロースは、マウンドアップすべき。 重要なステップ </li><li> TPMメディア/アガロースの上にないガスケット（ステップ3から）を持つ火炎滅菌スライドを置きます。 重要：このスライドは、形成される気泡を防ぐために、角度で下に設定する必要があります。 </li><li>スライドは、（ステップ5から）配置されると、ミニバインダークリップと一緒に複雑なクランプ - 各側に1つを。 </li><li> 4で切り取られた複雑なを置き° Cとメディア/アガロースを設定することができます。これは通常、約5分かかります。 </li></ol>独立したと乾板重要：乾燥からメディア/アガロースを防ぐために、〜20手順11は、一度に一つのスライドの複雑で実行する必要があります。 重要：最良の結果を得るには、11〜13を工程は4で実施されるべき℃の<ol start="11"><li>メディア/アガロース設定した後、バインダークリップを削除し、テープでラップされたスライドを緩めるために複雑なの終わりを絞る。 </li><li>テープラップされたスライドを削除し、後で使用できるようにベンチの上に置きます。 重要なステップ</li><li>ウェッジとして鉗子を使用して、サポートのスライド（なしガスケット付き）からカバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース複合体を分離し、サポートのスライドを捨てる。 重要：カバースリップ/ガスケット複合体を分離するために詮索好きなモーションを使用しないでください。これにより、カバーガラスの破壊及び/またはメディア/アガロース支持のスライドに付着する可能性があります。 </li><li>テープによって包まれたスライドにカバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース複合体（ガスケットのある面を上に）配置し、4から削除℃まで以上より1分 - すべて目に見える水分が新たに露出したメディア/アガロース表面から蒸発できるように、バーナーへのこの複雑な横に置きます。 重要：これはM.に影響を与える可能性があるとして長すぎるためにメディア/アガロース乾燥をさせてくださいザンザス群れ行動。 </li></ol>プレートの細胞重要なステップ<ol><li>一度、余分な水分は、離れて栄養ディスクからメディア/アガロース約1mm上に濃縮された細胞（パート1から手順8）のピペット0.5μlを蒸発している。 重要：細胞がまっすぐにまっすぐ下にしてからピペットを移動することによって堆積されていることを確認することが極めて重要です。これは群れが円形になることが保証されます。 重要：これは、メディア/アガロースにピペットの先端に触れないように非常に重要です。これは、表面にうつ病を行い、M.の動作を変更しますザンザス群れ。 ヒント：メディア/アガロースに近づいて前にピペットチップを押圧し。これは、セルのドロップがピペットの先端の下部に表示されるとそれが簡単に細胞を付着させるようにすることができます。 </li><li>一度細胞が堆積され、細胞のスポットを乾燥させるためにバーナーへの複雑な次を配置 - は20を超える秒。 </li></ol>アッセイを組み立てる<ol><li>セルのスポットが乾燥した後、カバースリップ/ガスケット/メディア/アガロース/細胞複合体（ステップ13から）上のガスケットとスライド/ガスケットの複合体を（ステップ1から）に合わせ、ゆっくりと軸シールを形成するために一緒に押します。 重要なステップ</li><li>スライドの表面を清掃し、パラフィルムで残留物を除去するためにキムワイプでスリップをカバー。完成したアッセイは、図1のようになります。 </li><li>すぐに結露のフォームを防止するために（ステップ15）ワイプの後に32 ° C（スライドダウン、アップスリップカバー）に維持加熱ステージ上で複雑な完成したスライドを置きます。結露が形成されている場合は、複雑なスライドが画像集録ソフトウェアを起動する前に数秒間加熱ステージの上に座ってみましょう。 </li><li>適切な目標を（、2X 4X、または10倍）を選択します。 </li></ol>パート5：ムービーの準備T&quot;&gt;重要なステップ<ol><li>カメラと顕微鏡の電源をオンにして、（光が強すぎるではないことを確認してください）​​光のレベルを確認してください。コンピュータを起動し、画像取得プログラムを開きます。 </li><li>ライブ画像のウィンドウをクリックして、顕微鏡の焦点を合わせる。画像は、図3に見られるもののように表示されるはずです。均一な寒天の表面に注目してください。 </li><li>画像を取得開始します。 重要なステップ</li><li>メディア/寒天がドリフトにフォーカスを引き起こして解決する傾向があるので、1時間の間、定期的にフォーカスを確認してください。 </li><li>作業領域をきれいに。 </li><li>画像の取り込みが完了すると、転送はストレージ用の画像を取得し、一晩90％エタノールに浸漬することによってスライド複合体を分解する。 </li><li>再利用のためにオートクレーブガスケット。 </li></ol><img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig1.jpg" alt="図1" /> 図1。TMプレートの複雑なの漫画イラスト。 （A）分解図と​​断面図の基本的なTMのプレートコンプレックスを示しています。 （B）より大きいガスケットの使用方法を示します。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig2.jpg" alt="図2" /> 図2顕微鏡のクラスタ。各顕微鏡のノードは、（挿入図）ニコンE400顕微鏡、目標、加熱ステージ、インサイトのカメラ、およびノー​​トブックコンピュータで構成されています。各ノードが相互にネットワーク接続し、マスタコントローラのコンピュータにリンクされています。ノードの二つは、EXFO光源二Uniblitzのシャッターで構成される蛍光の機能を使用して設定されます。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig3.jpg" alt="図3" /> 図3。追跡アッセイ装置の20倍の画像を一度に= 0。スケールバーは1mm。 <img src="/files/ftp_upload/2038/2038fig4.jpg" alt="図4" /> 図4。TMプレートの複合体の適応性。 M.の（A）100Xの画像1.0％寒天でCTTYE上ザンザス滑走運動。 Pの（B）20Xの画像緑膿菌は運動性をけいれん。 （C）20X画像S.マルセッセンスでは、運動性を分封。両方（B）と（C）は1.0％の寒天のLBで検定した。 M.の（D）40 ×画像スメグマチスは、0.5％寒天のLBで運動をスライディング。この画像は、図1Bに見られる別のアッセイの設定を使用して捕獲した。 ビデオ1。追跡アッセイに供群れのタイムラプスビデオ。 M.のビデオ2。タイムラプスビデオ細胞の1％が蛍光標識されているザンザス群れ。交互位相コントラストおよび蛍光画像がキャプチャされ、群れの中で蛍光細胞の位置を明らかにするために重ねていた。このビデオは、1.0％寒天でCTTYEでキャプチャされました。 M.のビデオ3。タイムラプスビデオザンザス滑走運動。このビデオは、1.0％寒天でCTTYEでキャプチャされました。 P.のビデオは、4。タイムラプスビデオ緑膿菌は運動性をけいれん。このビデオは、1.0％寒天のLBでキャプチャされました。 ビデオ5。S.のタイムラプスビデオマルセッセンスでは、運動性を分封。このビデオは、1.0％寒天のLBでキャプチャされました。 ビデオ6。M.のタイムラプスビデオチスは運動性をスライディング。このビデオは、図1Bに見られる別のアッセイの設定を使用して、0.5％寒天のLBでキャプチャされました。

<ol>
	<li>Taylor, R. G., Welch, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemotaxis+as+an+emergent+property+of+a+swarm.">Chemotaxis as an emergent property of a swarm.</a> J Bacteriol. 190, 6811-6816 (2008).</li><li>Curtis, P. D., Taylor, R. G., Welch, R. D., Shimkets, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+Organization+of+Myxococcus+xanthus+During+Fruiting+Body+Formation.">Spatial Organization of Myxococcus xanthus During Fruiting Body Formation.</a> J Bacteriol. 189, 9126-9130 (2007).</li><li>Mignot, T., Merlie, J. P., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulated+pole-to-pole+oscillations+of+a+bacterial+gliding+motility+protein.">Regulated pole-to-pole oscillations of a bacterial gliding motility protein.</a> Science. 310, 855-857 (2005).</li><li>Stoodley, P., Hall-Stoodley, L., Lappin-Scott, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detachment+surface+migration,+and+other+dynamic+behavior+in+bacterial+biofilms+revealed+by+digital+time-lapse+imaging.">Detachment surface migration, and other dynamic behavior in bacterial biofilms revealed by digital time-lapse imaging.</a> Methods Enzymol. 337, 306-319 (2001).</li><li>O'Toole, G., Kaplan, H. B., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biofilm+formation+as+microbial+development.">Biofilm formation as microbial development.</a> Annu Rev Microbiol. 54, 49-79 (2000).</li><li>O'Toole, G. A., Kolter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flagellar+and+twitching+motility+are+necessary+for+Pseudomonas+aeruginosa+biofilm+development.">Flagellar and twitching motility are necessary for Pseudomonas aeruginosa biofilm development.</a> Mol Microbiol. 30, 295-304 (1998).</li><li>Dalton, H. M., Poulsen, L. K., Halasz, P., Angles, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Substratum-induced+morphological+changes+in+a+marine+bacterium+and+their+relevance+to+biofilm+structure.">Substratum-induced morphological changes in a marine bacterium and their relevance to biofilm structure.</a> J Bacteriol. 176, 6900-6906 (1994).</li><li>Dworkin, M., Eide, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myxococcus+xanthus+does+not+respond+chemotactically+to+moderate+concentration+gradients.">Myxococcus xanthus does not respond chemotactically to moderate concentration gradients.</a> J Bacteriol. 154, 437-442 (1983).</li><li>Dworkin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tactic+behavior+of+Myxococcus+xanthus.">Tactic behavior of Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 154, 452-459 (1983).</li><li>Wu, S. S., Kaiser, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+expression+of+the+pilA+gene+in+Myxococcus+xanthus.">Regulation of expression of the pilA gene in Myxococcus xanthus.</a> J Bacteriol. 179, 7748-7758 (1997).</li><li>Bustamante, V. H., Mart&#237;nez-Flores, I., Vlamakis, H. C., Zusman, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Frz+signal+transduction+system+of+Myxococcus+xanthus+shows+the+importance+of+the+conserved+C-terminal+region+of+the+cytoplasmic+chemoreceptor+FrzCD+in+sensing+signals.">Analysis of the Frz signal transduction system of Myxococcus xanthus shows the importance of the conserved C-terminal region of the cytoplasmic chemoreceptor FrzCD in sensing signals.</a> Mol Microbiol. 53, 1501-1513 (2004).</li></ol>

利害の衝突は宣言されません。

タイムラプスmicrocinematography（TM）は、原核生物の運動性2-7を研究するための一般的な手法となっています。伝統的に、TMは、基板8から11のようにろ紙の芯、薄い寒天パッド、または寒天のスラブを使用して実行されます。細菌の運動の一般的なイラストのためのイメージシーケンスを生成するために使用するときにこれらのメソッドは効果が十分とコストです。しかし、イメ?...

<table><tbody><tr><td>1.0% Casitone</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.5% yeast extract</td><td>Difco Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro-sampling pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100 &amp;mu;l glass disposable tip</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 x 2 cm, 0.5-mm-thick silicone rubber gasket</td><td>Grace Bio-Lab Inc.</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

recording multicellular behavior in myxococcus xanthus biofilms using time-lapse microcinematography

δ-プロテオバクテリアMyxococcusザンザスの群れは、環境の手がかりへの応答として、複雑な、動的なパターンを作成するために一連の信号を通じて、集団的、協調運動として作用する細胞の数百万が含まれています。これらのパターンは、自己組織化と創発であり、それらは個々の細胞の挙動を観察することによって予測することはできません。タイムラプスmicrocinematography追跡アッセイを用いて、我々は、M.の明確な緊急のパターンを同定したザンザスは、そのソース1に向けて栄養勾配まで群れの指示運動として定義されて、走化性と呼ばれる。 効率的にタイムラプスmicrocinematographyを経由して走化性を特徴付けるために、我々は高度に変更可能なプレート複合体を開発した（図1）と8顕微鏡（図2）、キャプチャタイムラプスビデオの各能力のクラスタを構築した。アッセイは、定量データの一貫性のある複製を可能にするのに十分厳格であり、結果のビデオは、私たちは群れの行動の微妙な変化を観察し、追跡することができます。一度キャプチャ、ビデオはビデオの何千もの処理および格納するのに十分なメモリと分析/ストレージコンピュータに転送されます。このセットアップの柔軟性は、M.のいくつかのメンバーに役立っていますザンザスコミュニティ。

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Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

勉強する<em&gt; Myxococcusザンザス</em&gt;群れ行動、我々は、異なるアッセイ用に変更することができるタイムラプスmicrocinematographyプロトコルを設計した。それは、顕微鏡に適合した標準的な成長条件を採用し、安価な、再利用可能なシリコンガスケットを使用して再現性のある結果が得られます。我々は、多細胞走化性を定量化するためにこのメソッドを使用している。

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザス</emタイムラプスMicrocinematographyを使用して>バイオフィルム

A swarm of the &delta;-proteobacterium Myxococcus xanthus contains millions of cells that act as a collective, coordinating movement through a series of ...

recording-multicellular-behavior-myxococcus-xanthus-biofilms-using

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Recording Multicellular Behavior in Myxococcus xanthus Biofilms using Time-lapse Microcinematography

12.2K ビュー.  University of South Carolina (USC). 勉強する Myxococcusザンザス群れ行動、我々は、異なるアッセイ用に変更することができるタイムラプスmicrocinematographyプロトコルを設計した。それは、顕微鏡に適合した標準的な成長条件を採用し、安価な、再利用可能なシリコンガスケットを使用して再現性のある結果が得られます。我々は、多細胞走化性を定量化するためにこのメソッドを?...

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Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

免疫・感染学

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly constituted by proteins and exopolysaccharides, among other factors 7-10. The microbial community encased within the biofilm often shows the differentiation of distinct subpopulation of specialized cells 11-17. These subpopulations coexist and often show spatial and temporal organization within the biofilm 18-21.
Biofilm formation in the model organism Bacillus subtilis requires the differentiation of distinct subpopulations of specialized cells. Among them, the subpopulation of matrix producers, responsible to produce and secrete the extracellular matrix of the biofilm is essential for biofilm formation 11,19. Hence, differentiation of matrix producers is a hallmark of biofilm formation in B. subtilis.
We have used fluorescent reporters to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers in biofilms of B. subtilis 15,19,22-24. Concretely, we have observed that the subpopulation of matrix producers differentiates in response to the presence of self-produced extracellular signal surfactin 25. Interestingly, surfactin is produced by a subpopulation of specialized cells different from the subpopulation of matrix producers 15.
We have detailed in this report the technical approach necessary to visualize and quantify the subpopulation of matrix producers and surfactin producers within the biofilms of B. subtilis. To do this, fluorescent reporters of genes required for matrix production and surfactin production are inserted into the chromosome of B. subtilis. Reporters are expressed only in a subpopulation of specialized cells. Then, the subpopulations can be monitored using fluorescence microscopy and flow cytometry (See Fig 1).
The fact that different subpopulations of specialized cells coexist within multicellular communities of bacteria gives us a different perspective about the regulation of gene expression in prokaryotes. This protocol addresses this phenomenon experimentally and it can be easily adapted to any other working model, to elucidate the molecular mechanisms underlying phenotypic heterogeneity within a microbial community.

Single-cell Analysis of Bacillus subtilis Biofilms Using Fluorescence Microscopy and Flow Cytometry

Microbial biofilms are generally constituted by distinct subpopulations of specialized cells. Single-cell analysis of these subpopulations requires the use of fluorescent reporters. Here we describe a protocol to visualize and monitor several subpopulationswithin B. subtilis biofilms using fluorescence microscopy and flow cytometry.

の単一細胞解析枯草菌</em蛍光顕微鏡とフローサイトメトリーを用いて>バイオフィルム

Biofilm formation is a general attribute to almost all bacteria 1-6. When bacteria form biofilms, cells are encased in extracellular matrix that is mostly ...

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes underlying central cell cycle events. However, imaging of these molecules in slow-growing bacteria represents a challenge due to photobleaching of fluorophores and phototoxicity during image acquisition. Here, we describe a simple protocol to circumvent these limitations in the case of Myxococcus xanthus (which has a generation time of 4 - 6 h). To this end, M. xanthus cells are grown on a thick nutrient-containing agar pad in a temperature-controlled humid environment. Under these conditions, we determine the doubling time of individual cells by following the growth of single cells. Moreover, key cellular processes such as chromosome segregation and cell division can be imaged by fluorescence live-cell imaging of cells containing relevant fluorescently labeled marker proteins such as ParB-YFP, FtsZ-GFP, and mCherry-PomX over multiple cell cycles. Subsequently, the acquired images are processed to generate montages and/or movies.

Fluorescence Live-cell Imaging of the Complete Vegetative Cell Cycle of the Slow-growing Social Bacterium Myxococcus xanthus

Bacterial cells are spatially highly organized. To follow this organization over time in slow growing Myxococcus xanthus cells, a set-up for fluorescence live-cell imaging with high spatiotemporal resolution over several generations was developed. Using this method, spatiotemporal dynamics of important proteins for chromosome segregation and cell division could be determined.

蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

Fluorescence live-cell imaging of bacterial cells is a key method in the analysis of the spatial and temporal dynamics of proteins and chromosomes ...

生化学

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

生物工学

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility provides X. fastidiosa a means for long-distance intra-plant movement and colonization, contributing toward pathogenicity in X. fastidiosa. The twitching motility of X. fastidiosa is operated by type IV pili. Type IV pili of Xylella fastidiosa are regulated by pilG, a chemotaxis regulator in Pil-Chp operon encoding proteins that are involved with signal transduction pathways. To elucidate the roles of pilG in the twitching motility of X. fastidiosa, a pilG-deficient mutant Xf&#916;pilG and its complementary strain Xf&#916;pilG-C containing native pilG were developed. A microfluidic chambers integrated with a time-lapse image recording system was used to observe twitching motility in Xf&#916;pilG, Xf&#916;pilG-C and its wild type strain. Using this recording system, it permits long-term spatial and temporal observations of aggregation, migration of individual cells and populations of bacteria via twitching motility. X. fastidiosa wild type and complementary Xf&#916;pilG-C strain showed typical twitching motility characteristics directly observed in the microfluidic flow chambers, whereas mutant Xf&#916;pliG exhibited the twitching deficient phenotype. This study demonstrates that pilG contributes to the twitching motility of X. fastidiosa. The microfluidic flow chamber is used as a means for observing twitching motility.

Visualization of Twitching Motility and Characterization of the Role of the PilG in Xylella fastidiosa

In this study, a nano-microfluidic flow chamber was employed to visualize and functionally characterize the twitching motility of Xylella fastidiosa, a bacterium that causes Pierce&#39;s disease in grapevine.

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション<em&gt; PilG</em&gt;で<em&gt; Xylella fastidiosa</em

Xylella fastidiosa is a Gram-negative non-flagellated bacterium that causes a number of economically important diseases of plants. The twitching motility ...

Isolation and Time-Lapse Imaging of Primary Mouse Embryonic Palatal Mesenchyme Cells to Analyze Collective Movement Attributes

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and fusion above the tongue. Defects in this process lead to cleft palate, a common birth defect. Recent studies have shown that palatal shelf elevation involves a remodeling process that transforms the orientation of the shelf from a vertical to a horizontal one. The role of the palatal shelf mesenchymal cells in this dynamic remodeling has been difficult to study. Time-lapse-imaging-based quantitative analysis has been recently used to show that primary mouse embryonic palatal mesenchymal (MEPM) cells can self-organize into a collective movement. Quantitative analyses could identify differences in mutant MEPM cells from a mouse model with palate elevation defects. This paper describes methods to isolate and culture MEPM cells from E13.5 embryos-specifically for time-lapse imaging-and to determine various cellular attributes of collective movement, including measures for stream formation, shape alignment, and persistence of direction. It posits that MEPM cells can serve as a proxy model for studying the role of palatal shelf mesenchyme during the dynamic process of elevation. These quantitative methods will allow investigators in the craniofacial field to assess and compare collective movement attributes in control and mutant cells, which will augment the understanding of mesenchymal remodeling during palatal shelf elevation. Furthermore, MEPM cells provide a rare mesenchymal cell model for investigation of collective cell movement in general.

We present a protocol for isolation and culture of primary mouse embryonic palatal mesenchymal cells for time-lapse imaging of two-dimensional (2D) growth and wound-repair assays. We also provide the methodology for analysis of the time-lapse imaging data to determine cell-stream formation and directional motility.

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

Development of the palate is a dynamic process, which involves vertical growth of bilateral palatal shelves next to the tongue followed by elevation and ...

発生生物学

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. albicans is its ability to form biofilms, structured communities of cells attached to biotic and abiotic surfaces. C. albicans biofilms can form on host tissues, such as mucosal layers, and on medical devices, such as catheters, pacemakers, dentures, and joint prostheses. Biofilms pose significant clinical challenges because they are highly resistant to physical and chemical perturbations, and can act as reservoirs to seed disseminated infections. Various in vitro assays have been utilized to study C. albicans biofilm formation, such as microtiter plate assays, dry weight measurements, cell viability assays, and confocal scanning laser microscopy. All of these assays are single end-point assays, where biofilm formation is assessed at a specific time point. Here, we describe a protocol to study biofilm formation in real-time using an automated microfluidic device under laminar flow conditions. This method allows for the observation of biofilm formation as the biofilm develops over time, using customizable conditions that mimic those of the host, such as those encountered in vascular catheters. This protocol can be used to assess the biofilm defects of genetic mutants as well as the inhibitory effects of antimicrobial agents on biofilm development in real-time.

Visualization of Biofilm Formation in Candida albicans Using an Automated Microfluidic Device

This protocol describes the use of a customizable automated microfluidic device to visualize biofilm formation in Candida albicans under host physiological conditions.

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

Candida albicans is the most common fungal pathogen of humans, causing about 15% of hospital-acquired sepsis cases. A major virulence attribute of C. ...

Generating Controlled, Dynamic Chemical Landscapes to Study Microbial Behavior

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the microscale&#8213;to create micro-environments for microbial chemotaxis experiments. To create chemical pulses, we developed a system to introduce amino acid sources near-instantaneously by photolysis of caged amino acids within a polydimethylsiloxane (PDMS) microfluidic chamber containing a bacterial suspension. We applied this method to the chemotactic bacterium, Vibrio ordalii, which can actively climb these dynamic chemical gradients while being tracked by video microscopy. Amino acids, rendered biologically inert (&#39;caged&#39;) by chemical modification with a photoremovable protecting group, are uniformly present in the suspension but not available for consumption until their sudden release, which occurs at user-defined points in time and space by means of a near-UV-A focused LED beam. The number of molecules released in the pulse can be determined by a calibration relationship between exposure time and uncaging fraction, where the absorption spectrum after photolysis is characterized by using UV-Vis spectroscopy. A nanoporous polycarbonate (PCTE) membrane can be integrated into the microfluidic device to allow the continuous removal by flow of the uncaged compounds and the spent media. A strong, irreversible bond between the PCTE membrane and the PDMS microfluidic structure is achieved by coating the membrane with a solution of 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES) followed by plasma activation of the surfaces to be bonded. A computer-controlled system can generate user-defined sequences of pulses at different locations and with different intensities, so as to create resource landscapes with prescribed spatial and temporal variability. In each chemical landscape, the dynamics of bacterial movement at the individual scale and their accumulation at the population level can be obtained, thereby allowing the quantification of chemotactic performance and its effects on bacterial aggregations in ecologically relevant environments.

A protocol for the generation of dynamic chemical landscapes by photolysis within microfluidic and millifluidic setups is presented. This methodology is suitable to study diverse biological processes, including the motile behavior, nutrient uptake, or adaptation to chemicals of microorganisms, both at the single cell and population level.

微生物の挙動を研究するための制御された動的化学景観の生成

We demonstrate a method for the generation of controlled, dynamic chemical pulses&#8213;where localized chemoattractant becomes suddenly available at the ...

Quantitative Analysis of Random Migration of Cells Using Time-lapse Video Microscopy

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During directional migration, cells move rapidly in response to an extracellular chemotactic signal, or in response to intrinsic cues 3 provided by the basic motility machinery. Random migration occurs when a cell possesses low intrinsic directionality, allowing the cells to explore their local environment.
Cell migration is a complex process, in the initial response cell undergoes polarization and extends protrusions in the direction of migration 2. Traditional methods to measure migration such as the Boyden chamber migration assay is an easy method to measure chemotaxis in vitro, which allows measuring migration as an end point result. However, this approach neither allows measurement of individual migration parameters, nor does it allow to visualization of morphological changes that cell undergoes during migration.
Here, we present a method that allows us to monitor migrating cells in real time using video - time lapse microscopy. Since cell migration and invasion are hallmarks of cancer, this method will be applicable in studying cancer cell migration and invasion in vitro. Random migration of platelets has been considered as one of the parameters of platelet function 4, hence this method could also be helpful in studying platelet functions. This assay has the advantage of being rapid, reliable, reproducible, and does not require optimization of cell numbers. In order to maintain physiologically suitable conditions for cells, the microscope is equipped with CO2 supply and temperature thermostat. Cell movement is monitored by taking pictures using a camera fitted to the microscope at regular intervals. Cell migration can be calculated by measuring average speed and average displacement, which is calculated by Slidebook software.

This method allows monitoring of cells in real time and quantitative measurements of different cell migration parameters such as speed, displacement, and velocity. Unlike the traditional methods, this real time approach is not based on endpoint quantitative migration measurements; instead it allows monitoring and calculating different parameters continuously.

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

Cell migration is a dynamic process, which is important for embryonic development, tissue repair, immune system function, and tumor invasion 1, 2. During ...

生物学

A Bead Movement Based Computational Framework for 3-Dimensional Analysis of Biofilm Material Heterogeneity

Differences in the material properties of bacterial biofilms have been observed in biofilms of different bacterial species, within the same species under different growth conditions and after treatment with matrix modifying molecules. To better quantitate the material properties of 3D biofilms, an experimental and computational workflow was developed and applied to examine differences between Enterococcus faecalis, Salmonella enterica serotype Typhimurium and Escherichia coli biofilms as well as the role of the amyloid curli in confirming rigidity to Enterobacteriaceae biofilms. The spatio-temporal dynamics of 1 &#181;m carboxylate beads in biofilms were tracked in 20 &#181;m 3D biofilms over 20 minutes. The 4D image stacks were processed using the Mosaic plugin in ImageJ to produce 3D trajectory data of bead movement. This trajectory data was analyzed with a newly developed Bead Evaluator toolbox, where movement data, including trajectory lifespans, bead velocities, cell densities along trajectories, and bounding box information were computed and stored in csv-files. This paper presents the workflow from experimental setup and image recording to bead trajectory computation and analysis. The structure of curli-containing biofilms resulted in more stable bead interactions and less bead movement than in curli-mutant and Enterococcal biofilms. Bead movement did not appear strongly dependent on cell density when measuring the bead velocity and trajectory bounding box volume, supporting the hypothesis that other material properties of the biofilms control the bead dynamics. This technique is widely applicable to quantitating differences in biofilms of different matrix compositions as well as biofilms before and after matrix-modifying treatments.

We describe a method for analyzing and quantifying the movement pattern of 1 &#181;m carboxylate beads through heterogeneous bacterial biofilms. Comparison of the movement patterns can be used to quantitate differences in material properties of biofilms.

Differences in the material properties of bacterial biofilms have been observed in biofilms of different bacterial species, within the same species under ...

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザスバイオフィルム

要約

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この動画の章

の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化

微生物の挙動を研究するための制御された動的化学景観の生成

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

A Bead Movement Based Computational Framework for 3-Dimensional Analysis of Biofilm Material Heterogeneity

で多細胞の動作を記録する Myxococcusザンザスバイオフィルム

要約

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の生細胞イメージング枯草菌と肺炎球菌自動タイムラプス顕微鏡を使用して

の単一細胞解析枯草菌バイオフィルム

蛍光住セル完全の栄養細胞周期の遅い成長社会細菌Myxococcus ザンサス

粒子追跡マイクロレオロジーによりバイオフィルムの機械的特性のその場でのマッピング

の役割の攣縮運動の可視化とキャラクタリゼーション

集団運動属性を解析するためのマウス胚性口蓋前葉細胞の単離とタイムラプスイメージング

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオ フィルム形成の可視化

微生物の挙動を研究するための制御された動的化学景観の生成

タイムラプスビデオ顕微鏡を用いた細胞のランダムな移行の定量分析

A Bead Movement Based Computational Framework for 3-Dimensional Analysis of Biofilm Material Heterogeneity

自動マイクロ流体デバイスを使用してカンジダ菌バイオフィルム形成の可視化