L'obiettivo della mia ricerca è ottenere le informazioni critiche di conferma dell'amiloide-beta 1-40 quando viene assorbita sulla superficie delle nanoparticelle d'oro e avviene un processo di aggregazione reversibile. La sfida che stiamo affrontando in questo campo di ricerca è quella di ottenere informazioni termiche, chimiche e dinamiche del processo di aggregazione inversa. La grande scoperta di questo progetto è che siamo in grado di identificare il particolare movimento o modalità di vibrazione che contribuisce alla conferma ripiegata o dispiegata dell'amiloide-beta 1-40 quando vengono assorbite sulla superficie delle nanoparticelle d'oro.
Il grande vantaggio dell'utilizzo di SERS, la spettroscopia di diffusione Raman potenziata dalla superficie, è quello di rilevare segnali di diffusione molto piccoli e deboli per identificare la modalità che è fondamentale per causare il ripiegamento e l'apertura. Allo stesso tempo, siamo in grado di individuare la morfologia degli aggregati. I risultati che siamo in grado di produrre da questo progetto sono l'interazione chiave dell'interazione proteina-proteina, che sarà importante per causare l'oligomero e che porterà alla fibrogenesi.
Per iniziare, utilizzando una micropipetta, aggiungere un millilitro di acqua distillata deionizzata a un milligrammo di beta amiloide liofilizzata, o A beta 1-40. Mescolare la soluzione con un miscelatore a vortice per circa 30 secondi. Assicurarsi che non rimangano particelle solide nella soluzione a temperatura ambiente, circa 20 gradi Celsius.
Successivamente, preparare le soluzioni madre peptidiche utilizzando acqua deionizzata e distillata. Determinare la concentrazione di peptidi misurando spettroscopicamente l'assorbimento della tirosina a 275 nanometri. Conservare le soluzioni stock A beta 1-40 a meno 80 gradi Celsius.
Scongelare la soluzione stock di peptidi circa cinque minuti prima della raccolta dei dati. In una provetta da centrifuga da 15 millilitri, mescolare otto microlitri della soluzione peptidica con 800 microlitri di particelle colloidali d'oro. Aggiungere 4,2 millilitri di acqua distillata deionizzata, quindi agitare il campione per 10 secondi.
Fissare la concentrazione di peptidi A beta 1-40 a 1,8 nanomolari e regolare il rapporto tra peptidi e particelle colloidali d'oro all'interno dell'intervallo specifico. Utilizzando l'unità di controllo della temperatura dello spettrofotometro UV visibile, impostare la soluzione a temperatura ambiente, circa 22 gradi Celsius. Monitorare il pH iniziale della soluzione campione utilizzando un pHmetro e regolarlo leggermente al di sotto del pH sette.
Raccogli lo spettro di assorbimento nell'intervallo da 400 a 800 nanometri. Quindi, regolare il pH del campione a circa pH quattro aggiungendo incrementi di 1,0 microlitri di acido cloridrico molare 1,0. Raccogli lo spettro di assorbimento nello stesso intervallo da 400 a 800 nanometri.
Quindi, regolare il pH del campione a circa pH 10 aggiungendo incrementi di circa 1,5 microlitri di idrossido di sodio molare 1,0. Raccogli lo spettro di assorbimento all'interno dello stesso intervallo di lunghezze d'onda da 400 a 800 nanometri. Successivamente, modificare il pH tra pH quattro e pH 10 10 volte aggiungendo acido cloridrico o idrossido di sodio.
Raccogliere continuamente lo spettro di assorbimento a 25 gradi Celsius. Ottenere il set di dati ASCII delle lunghezze d'onda in funzione dell'assorbanza. Utilizzare il programma PeakFit per estrarre le posizioni medie dei picchi di banda.
Utilizzando la funzione di tracciamento, tracciare il set di dati per visualizzare la densità ottica in funzione della lunghezza d'onda. Identifica e contrassegna le lunghezze d'onda di picco iniziali, lambda uno e lambda due, selezionando le loro posizioni approssimative nei dati tracciati. Adattare i dati utilizzando la funzione di adattamento del picco del programma di origine.
Ottenere il grafico che mostra le posizioni di picco centrali per ogni lambda etichettata come XCI, insieme alle aree di banda corrispondenti, indicate come AI. Esporta le posizioni dei picchi estratte e le aree corrispondenti in un foglio di calcolo per l'analisi. Calcola il fattore di ponderazione, AI, per ogni centro di picco confrontando l'area della banda con l'area totale delle intere bande utilizzando la formula visualizzata. Quindi, estrarre la posizione media del picco utilizzando l'equazione visualizzata sullo schermo.
Per generare un grafico di reversibilità, tabulare le posizioni medie dei picchi in funzione del numero di operazione N.Assegnare il numero di operazione N come indicato sullo schermo. Analizzare la posizione di picco in corrispondenza di N utilizzando la formula visualizzata. Trasferisci il set di dati calcolato nel software di origine e traccialo.
Selezionate l'adattamento della curva non lineare dell'analisi, immettete i valori iniziali per A, B, C, D ed E e fate clic su Esegui per completare il processo di adattamento della curva. Per eseguire l'imaging Raman, per ogni campione al numero di operazione N, porre 100 microlitri di soluzione su un disco di mica del diametro di un centimetro. Lasciare asciugare i campioni per una notte prima della misurazione.
Quindi, raccogliere immagini a luce bianca per ogni numero di operazione N.Preparare il campione separato su un nuovo disco di mica poiché il pH viene continuamente alterato tra quattro e 10. Raccogli l'immagine Raman per ogni numero di operazione e utilizzando le specifiche menzionate di un laser con una lunghezza d'onda di 633 nanometri. Cattura le immagini in una griglia di 100 x 100 pixel con un tempo di integrazione specifico, concentrandoti sulla regione spettrale desiderata.
Tracciare lo spettro rappresentativo per ogni numero di operazione N allineato in funzione di N.Costruire una spettroscopia Raman tridimensionale potenziata dalla superficie, o spettro SERS, in funzione di N per A oro a 20 nanometri rivestito di beta 1-40. Utilizza la vista dall'alto dello spettro come mappa di contorno per estrarre le modalità specifiche associate a una particolare condizione di pH. Identifica le caratteristiche spettrali migliorate esclusivamente a soli numeri di operazioni pari o dispari.
La banda SPR delle nanoparticelle d'oro rivestite di A beta 1-40 è passata da 530 nanometri a circa 650 nanometri quando la soluzione è stata resa più acida. Ciò corrispondeva alla formazione di aggregati colloidali d'oro con monomeri A beta 1-40 dispiegati, come osservato dalla TEM. Era evidente anche il cambiamento di colore dipendente dal pH dell'oro rivestito A beta 1-40.
Lo spostamento reversibile dipendente dal pH della banda media ha raggiunto il picco tra una lunghezza d'onda più corta e una più lunga, e la morfologia alternata dispersa e aggregata osservata nella TEM ha confermato la natura quasi reversibile del processo. L'imaging a luce bianca ha mostrato un modello di aggregazione chiaro e reversibile corrispondente alle variazioni di pH, mentre gli spettri SERS hanno mostrato sottili cambiamenti dipendenti dal pH nella regione dell'impronta digitale.
