L'obiettivo principale di questa procedura è quello di implementare un protocollo completo per la coltura e la caratterizzazione dei microfagi su diverse superfici implantari e la caratterizzazione dei sottotipi dei microfagi. Diversi metodi sono impiegati come parte di questa caratterizzazione, tra cui qRT-PCR, EISA e CLSM, per determinare i profili di espressione genica, le proteine secretorie e i marcatori della superficie cellulare. I risultati mostrano l'utilità e l'efficacia del protocollo implementato nella polarizzazione dei microfagi e delle superfici implantari e nell'identificazione accurata in base all'espressione genica, alle proteine secrete e ai marcatori della superficie cellulare.
Inoltre, i marcatori descrivono modelli di espressione coerenti e specifici che possono essere utilizzati per distinguere diversi sottotipi di MDM. Nel complesso, lo studio contribuirà allo sviluppo e alla progettazione di materiali immunomodulatori per migliorare e promuovere processi di rigenerazione tissutale di successo, prevenire l'infiammazione cronica associata all'impianto e migliorare il successo dell'integrazione dell'impianto. Per iniziare, risospendere le cellule mononucleate del sangue periferico umano isolate in 15 millilitri di terreno di attacco monocitario preriscaldato e trasferirle in un pallone di coltura cellulare T-75.
Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di anidride carbonica per 90 minuti per l'adesione. Dopo l'incubazione, scartare il surnatante e lavare le cellule una volta con un terreno RPMI 1640 preriscaldato, integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina e streptomicina inclinando delicatamente il pallone per rimuovere le cellule non aderenti o poco aderenti. Aggiungere 15 millilitri di terreno completo contenente 10 nanogrammi per millilitro di fattore stimolante le colonie di macrofagi alle cellule aderenti.
E incubare per sei giorni per promuovere la differenziazione. Dopo la differenziazione, rimuovere il terreno di coltura dal pallone e lavare le cellule con 10 millilitri di PBS per cinque minuti. Per staccare le cellule di aderenza, aggiungere 10 millilitri di soluzione preriscaldata per il distacco delle cellule e incubare per 30 minuti.
Quindi, picchiettare delicatamente il pallone per rilasciare le cellule e trasferirle in una provetta da 50 millilitri. Per staccare le cellule rimanenti, aggiungere 10 millilitri di PBS nel pallone e scartare le cellule. Trasferire le cellule staccate nella provetta da 50 millilitri.
Centrifugare la sospensione cellulare staccata a 300 g per 10 minuti e scartare il surnatante prima di risospendere le cellule in cinque millilitri di terreno completo preriscaldato. Utilizzando la colorazione con blu di tripano, contare le cellule su un emocitometro per determinare il numero e la vitalità delle cellule. Preparare la sospensione cellulare regolando il numero di cellule a 160.000 cellule per un millilitro di terreno completo.
Successivamente, pulire i dischi di biomateriale ad ultrasuoni in etanolo al 70% per cinque minuti, seguito dalla sterilizzazione in etanolo al 70% per 30 minuti. Dopo aver asciugato i dischi in titanio, metterli in una piastra a 24 pozzetti non trattata e aggiungere un millilitro di sospensione cellulare preparata a ciascun pozzetto. Incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per ottenere macrofagi M0.
Per ottenere macrofagi polarizzati M1, aggiungere interferone gamma e lipopolisaccaride nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Per la polarizzazione M2, aggiungere l'interleuchina-4 e l'interleuchina-13. Incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica per indurre la polarizzazione.
Dopo aver ottenuto macrofagi polarizzati derivati da monociti da cellule mononucleate del sangue periferico umano, raccogliere il surnatante cellulare in una provetta da 1,5 millilitri. Trasferire il disco in titanio su una nuova piastra a 24 pozzetti. Centrifugare il surnatante cellulare a 300 g per cinque minuti e trasferire il surnatante in una nuova provetta.
Misurare le citochine e le chemochine a 450 nanometri secondo le istruzioni specifiche fornite dal produttore. Calcola la concentrazione di citochine o chemochine secrete utilizzando la curva standard. Misurare la quantità totale di proteine utilizzando il kit per il dosaggio delle proteine dell'acido bicinconinnico.
Normalizzare la concentrazione di proteine secrete in milligrammi di proteine totali. Lavare due volte i macrofagi polarizzati in 800 microlitri di PBS. Incubare i dischi in 400 microlitri di tampone di fissazione per 20 minuti a temperatura ambiente.
Dopo aver rimosso il tampone di fissaggio, lavare i dischi tre volte in 400 microlitri di PBS. Ora, incubare i dischi con 400 microlitri di tampone bloccante per 30 minuti per bloccare i siti di legame non specifici. Eliminare il tampone bloccante e incubare i dischi per un'ora con anticorpi primari diluiti in 400 microlitri di tampone di colorazione.
Dopo un'ora, rimuovere gli anticorpi primari e lavare i dischi tre volte con 400 microlitri di tampone di lavaggio. Aggiungere fluoro per gli anticorpi secondari marcati diluiti nel tampone di colorazione e incubare per un'ora a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione, lavare i campioni tre volte nel tampone di lavaggio per tre minuti ciascuno.
Aggiungere 10 millimolari di DRAQ5 in PBS e incubare per 15 minuti al buio. Quindi, rimuovere il surnatante e lavare i dischi una volta con PBS. Aggiungere una goccia di mezzo di montaggio e, dopo cinque minuti, applicare gli occhiali di copertura e lasciare asciugare i campioni per un'ora.
Dopo l'asciugatura, sigillare i bordi con smalto trasparente. Per ottenere una panoramica delle cellule, è possibile visualizzare i campioni su un microscopio confocale a scansione laser con un ingrandimento di 25X. Modificare l'ingrandimento a 63X per determinare la struttura e la localizzazione dei marcatori di superficie.
I macrofagi primari derivati da monociti sono stati polarizzati con successo in macrofagi M1 e M2 su superfici di titanio, con CCR7 più fortemente espresso nei macrofagi M1 e CD209 nei macrofagi M2. L'analisi qRT-PCR ha mostrato il successo della polarizzazione dei macrofagi primari derivati da monociti su entrambe le superfici in titanio e vetrino coprioggetto con un'elevata espressione di CCR7 e TNF-alfa per M1 e CD209 e CCL13 per M2. Alti livelli di citochina infiammatoria TNF-alfa e chemochina CCL13 hanno confermato la polarizzazione M1 e M2 a livello proteico.
