Coltura primaria a bassa densità facile e riproducibile utilizzando stock congelati di neuroni ippocampali embrionali

Le scorte congelate di neuroni embrionali di ratto sono pronte all'uso e non sono necessarie tecniche avanzate per la coltura delle cellule. Questa tecnica è molto semplice e non è necessario alcun permesso per la sperimentazione animale, l'organizzazione di animali gravidi a tempo o la dissezione di embrioni. I neuroni possono essere coltivati in altri vasi di coltura e applicati per altri tipi di esperimenti.

Ad esempio, piastre array di microelettrodi per esperimenti elettrofisiologici. Inizia rivestendo una micropiastra da 96 pozzetti con 100 microlitri di poli-L-lisina per pozzetto. Quindi, incubare le piastre durante la notte a 37 gradi Celsius.

Alla fine dell'incubazione, rimuovere la soluzione di poli-L-lisina. Lavare le piastre due volte con acqua sterilizzata e una volta con terreno di coltura fresco senza integratori. Mettere i piatti ad asciugare.

Le piastre asciutte possono essere avvolte e conservate per un massimo di un mese a quattro gradi Celsius. Per iniziare la semina cellulare, aggiungere 50 microlitri del terreno di coltura a ciascun pozzetto nelle piastre rivestite. Riempire i pozzetti periferici con 200 microlitri di acqua sterilizzata e incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica.

Rimuovere la fiala di crio neurone dal serbatoio di azoto liquido e posizionarla in un blocco di calore a 37 gradi Celsius per scongelare parzialmente il suo contenuto. Utilizzando una pipetta da un millilitro con una punta ad alesaggio largo, trasferire lentamente il contenuto delle fiale goccia a goccia in un tubo sterile da 50 millilitri. Risciacquare il flaconcino criogenico vuoto con un millilitro di terreno di coltura a temperatura ambiente.

Trasferire la soluzione di risciacquo nel tubo da 50 millilitri contenente la sospensione cellulare. Quindi, aggiungere nove millilitri di coltura a temperatura ambiente a goccia nel tubo da 50 millilitri, componendo il volume a 11 millilitri. Dopo aver contato le cellule utilizzando un emocitometro, trasferire la sospensione cellulare in un serbatoio.

Ora, utilizzando una pipetta multicanale con punte larghe, erogare la sospensione cellulare con un conteggio finale di 1,0 volte 10 alle quattro celle per pozzetto nella piastra rivestita a 96 pozzetti. Incubare i neuroni per una o due ore a 37 gradi Celsius sotto il 5% di anidride carbonica. Quindi, sostituire il terreno di coltura con 100 microlitri di terreno di coltura preriscaldato e incubare nuovamente nelle stesse condizioni.

Dopo quattro giorni in vitro, aggiungere citosina beta-D-arabinofuranoside alla concentrazione finale di 0,2 micromolari per pozzetto per ridurre la crescita delle cellule gliali. Riposizionare la piastra nell'incubatore. Dopo 21 giorni in vitro, trattare le cellule con i farmaci di interesse.

Per mantenere un controllo positivo, trattare le cellule con glutammato micromolare 100 per pozzetto per 10 minuti a 37 gradi Celsius prima della fissazione. Prima di eseguire studi immunocitochimici, fissare le cellule per 20 minuti sostituendo la soluzione di coltura con 100 microlitri di paraformaldeide in ciascun pozzetto. Dopo la fissazione, lavare i pozzetti due volte con 250 microlitri di soluzione salina tamponata con fosfato per pozzetto per cinque minuti ciascuno.

Nel presente studio, i neuroni sono stati sviluppati normalmente senza scambiare il terreno di coltura per tre settimane. L'immunoistochimica ha rivelato spine dendritiche drebrin-positive lungo i dendriti MAP2-positivi. È stata osservata la riduzione dose-dipendente delle densità dei cluster di drebrina contro la stimolazione del glutammato.

Il trapianto della sospensione cellulare prima che diventi troppo caldo è molto importante. L'aggiunta goccia a goccia di terreno di coltura è anche cruciale per evitare improvvisi cambiamenti nell'osmolarità.