Questo protocollo consente ai ricercatori di identificare se l'attività della caspasi si verifica in concomitanza con la morte cellulare, identificando così diverse modalità di morte cellulare. Il vantaggio di questa tecnica è la flessibilità di valutare l'attività delle caspasi in un test basato sulla popolazione o in una singola cellula. A dimostrare la procedura saranno Stefanie Rufli, dottoranda in ricerca, e Jing Tong, dottoranda in visita dal laboratorio di Wendy Wei-Lynn Wong.
Dopo aver differenziato e raccolto i macrofagi derivati dal midollo osseo o BMDM come descritto nel manoscritto, seminarli in una piastra a sei pozzetti alla densità di una volta 10 alle cellule sesta per millilitro. Trattare le cellule con SMAC mimetic per 16 ore. Per preparare il lisato cellulare, trasferire la piastra contenente le cellule trattate sul ghiaccio e raccogliere il terreno di coltura cellulare in un tubo da 1,5 millilitri.
Centrifugare a 300 g per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il mezzo e mettere il tubo sul ghiaccio. Quindi aggiungere un millilitro di PBS freddo alla piastra di coltura cellulare per lavare le cellule.
Dopo aver aspirato tutto il PBS, aggiungere 100 microlitri di tripsina alle cellule. Una volta staccate le cellule dalla piastra, raccoglierle nel tubo da 1,5 millilitri. Dopo aver centrifugato la sospensione cellulare, rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in tampone di lisi DISC da 100 microlitri.
Incubare il campione su ghiaccio per 20 minuti e quindi centrifugare il lisato per pellettare la frazione insolubile. Trasferire 25 microlitri di lisato su una piastra bianca a fondo piatto a 96 pozzetti per il saggio di attività della caspasi-3/7 e 10 microlitri su una piastra trasparente a fondo piatto a 96 pozzetti per l'acido bicinconinico o il saggio BCA. Per la quantificazione delle proteine, preparare un intervallo di concentrazioni di albumina sierica bovina o BSA come proteina standard.
Una volta aggiunto il BSA standard alla piastra a fondo piatto a 96 pozzetti contenente i campioni, mescolare i reagenti BCA uno e due in un rapporto di 50 a uno e aggiungerne 200 microlitri a ciascun campione in standard. Dopo l'incubazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti, misurare l'assorbanza a 562 nanometri su uno strumento fluorometrico e quantificare la concentrazione proteica con la curva standard. Per eseguire un test basato sulla popolazione, avviare lo strumento fluorometrico e riscaldare la macchina a 30 gradi Celsius.
Impostare la lunghezza d'onda di eccitazione ed emissione rispettivamente a 360 e 465 nanometri. Quindi preparare una miscela di reazione master su ghiaccio come descritto nel manoscritto per determinare l'attività delle caspasi. Aggiungere 75 microlitri di miscela a ciascun campione e standard per ottenere un volume totale di reazione di 100 microlitri.
Misurare immediatamente la fluorescenza utilizzando la configurazione dello strumento fluorometrico e registrare le singole letture ogni minuto per 40 minuti per determinare la cinetica di reazione. Dopo la semina, raccogliere le cellule aderenti come dimostrato in precedenza in un tubo di polistirene da cinque millilitri. Quindi centrifugare il campione a 300 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius e rimuovere il surnatante.
Per preparare la miscela di colorazione, prendere un microlitro del substrato fluorogenico e diluirlo con 150 microlitri di PBS. Aggiungere 50 microlitri di miscela colorante per campione, incubarlo al buio a 37 gradi Celsius per 30 minuti e mescolare ogni 15 minuti. In questo test basato sulla popolazione, i dati rappresentativi del saggio cinetico per l'attività della caspasi-3/7 hanno mostrato un aumento della scissione del substrato con un aumento della concentrazione mimetica di SMAC.
Tuttavia, l'aumento a 500 concentrazioni nanomolari era insignificante sulla base di un normale ANOVA unidirezionale con confronti multipli. L'analisi dell'attività della caspasi-3/7 mediante citometria a flusso ha indicato uno spostamento della fluorescenza per le cellule trattate con mimetici SMAC rispetto alle cellule non trattate, che era evidente anche nell'intensità di fluorescenza mediana tracciata e l'aumento a 500 concentrazioni nanomolari era significativo. La procedura deve essere eseguita su ghiaccio.
Tuttavia, nei test basati sulla popolazione, i campioni non possono essere lasciati sul ghiaccio indefinitamente. Dopo la fase di lisi, i campioni devono essere ulteriormente elaborati o congelati immediatamente. L'imaging dell'attività delle caspasi utilizzando la microscopia a cellule vive sarebbe un metodo aggiuntivo per ottenere informazioni cinetiche a livello di singola cellula.
