Il protocollo in questo studio fornisce una strategia di combinazione di due erbe per il trattamento delle cellule PC12 danneggiate dall'ipossia e un riferimento per ottimizzare la migliore modalità di combinazione di erbe. Questa tecnica può fornire un metodo sperimentale in vitro semplice, affidabile ed efficiente per lo screening dell'efficace combinazione di ingredienti dalle erbe, contro le cellule ipossiali. Questa strategia può anche essere applicata per schermare le combinazioni di componenti contro le cellule ipossiali da altre combinazioni di preparazione di erbe e illustrare il loro meccanismo protettivo.
Per iniziare, sub-coltura le cellule PC12 ogni due o tre giorni a 37 gradi Celsius in un incubatore integrato con il 5% di anidride carbonica per ottenere un passaggio da 4 a 8 per tutti gli esperimenti successivi. Trattare dal 70 all'80% le cellule PC12 confluenti con un millilitro di tripsina allo 0,25% e osservare le cellule al microscopio per il distacco delle cellule. Quindi interrompere la digestione della tripsina aggiungendo tre millilitri del mezzo completo.
Far girare le cellule trasferite in una provetta da centrifuga da 15 millilitri a 840 x g per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare con il mezzo completo e trasferire la sospensione cellulare in un tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per contare le cellule, avviare il software di citometria a flusso e selezionare il multiplo di diluizione corrispondente della soluzione cellulare nell'impostazione di conteggio.
Fare clic su Grafico densità dopo aver caricato il campione di cella. Circondare la popolazione cellulare lontano dall'asse x e dall'asse y. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla tabella dati sotto la figura e scegliere X, Y, Conteggio e Abs.
Contare per ottenere i risultati del conteggio delle celle nella tabella dei dati di Abs.Count. Dopo aver regolato la concentrazione cellulare approssimativamente a 1 volte 10 alle 5 celle per millilitro con il mezzo completo, aggiungere 100 microlitri di sospensione cellulare per pozzetto a una piastra a 96 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius e 5% anidride carbonica per 24 ore. Il giorno successivo, alla piastra scartata dal surnatante, aggiungere 120 microlitri di una soluzione MTT da un milligrammo per millilitro in ciascun pozzetto e incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius.
Dopo l'incubazione, una volta scartato il surnatante aggiungere 150 microlitri di DMSO a ciascun pozzetto. Tenere la piastra agitata in un oscillatore a vortice per 10 minuti ad una velocità di 240 volte al minuto. Quindi misurare l'assorbanza a 490 nanometri in un lettore di micropiastre.
Per esaminare la combinazione ottimale di farmaci con un metodo di progettazione omogeneo, coltivare le cellule come dimostrato in precedenza e trattare le cellule PC12 danneggiate con sei diverse concentrazioni proporzionali di iniezione di astragalo e capsula di breviscapus. Per valutare l'effetto protettivo di due combinazioni ottimali, trattare le cellule PC12 danneggiate con i due tipi di combinazione di farmaci. Incubare le cellule per 24 ore e calcolare la vitalità cellulare come dimostrato in precedenza.
Seminare le cellule PC12 in una piastra a 12 pozzetti e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo il trattamento farmacologico, trattare le cellule con 250 microlitri di tripsina per pozzetto e centrifugare le cellule a 840 x g per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi risospendere il pellet cellulare con 500 microlitri del tampone legante.
Aggiungere 5 microlitri di Annexin V-FITC, 10 microlitri di ioduro di propidio in triplice copia per ciascun gruppo e incubare le cellule al buio per 15 minuti a temperatura ambiente per verificare l'apoptosi utilizzando la citometria a flusso. Nel software del citometro a flusso, fare clic su Compensazione automatica nel menu Start, selezionare FITC, PE, PerCP e APC nel canale Select e selezionare Compensation at Height (Compensazione in altezza). Quindi fare clic su OK nella voce statistica:Mediana.
Fare clic su Mappa densità e cerchiare la popolazione cellulare effettiva con il metodo di conteggio delle celle illustrato in precedenza. Con la fluorescenza FITC come parametro dell'asse x e altra fluorescenza come parametro dell'asse y, creare una mappa di densità. Fare clic su Matrice di compensazione nel menu Start e Coefficiente nella matrice di overflow.
Seminare le cellule PC12 ai coprivetrini posti su un pozzetto a 24 pozzetti in triplice copia e incubare a 37 gradi Celsius per 24 ore. Dopo il trattamento farmacologico, sciacquare i coprivetrini due volte con PBS per cinque minuti ciascuno, fissarli con paraformaldeide al 4% per 15 minuti e permeabilizzare con Triton X-100 allo 0,5% per 20 minuti a temperatura ambiente. Dopo aver risciacquato le cellule, bloccarle con il 10% di siero di capra per un'ora a temperatura ambiente.
Aggiungere 200 microlitri di anticorpo primario diluito caspasi-3 a ciascun coprivetrino e incubare durante la notte a 4 gradi Celsius. Il giorno seguente, lavare tre volte con tampone TBST per tre minuti ciascuno e incubare con 200 microlitri di anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente al buio. Dopo l'incubazione, incubare i vetrini con 300 microlitri di 0,5 microgrammi per millilitro di DAPI per 10 minuti e lavare le cellule tre volte con TBST per cinque minuti ciascuna.
Cattura le immagini del coprislip al microscopio a fluorescenza e analizza statisticamente l'intensità della fluorescenza con il software di imaging. Lavare il foglietto di copertura delle cellule PC12 trattate con farmaco tre volte con PBS per tre minuti ciascuno e incubare con 400 microlitri di 10 micromolari dicloro-diidro-fluoresceina diacetato a 37 gradi Celsius per 20 minuti. Lavare nuovamente le cellule con DMEM senza siero due volte per tre minuti ciascuna.
Aggiungere l'agente di spegnimento a fluorescenza e acquisire immediatamente le immagini del vetrino al microscopio a fluorescenza per calcolare l'intensità relativa della fluorescenza con il software di imaging. Lavare le cellule PC12 trattate con farmaci in una piastra a 6 pozzetti tre volte con PBS per cinque minuti ciascuna e incubare su ghiaccio per 30 minuti nel tampone di lisi preparato di 100 microlitri per pozzetto. Dopo la lisi, centrifugare le cellule a 16.000 x g per 20 minuti a 4 gradi Celsius per raccogliere il surnatante.
Dopo aver rilevato la concentrazione proteica mediante il test Bradford, eseguire un'elettroforesi SDS-PAGE al 12% con 25 microgrammi di proteine in ciascuna corsia e trasferire il gel alla membrana PVDF. Bloccare le membrane con latte scremato al 5% per 1,5 ore a temperatura ambiente e incubare con cinque millilitri dei corrispondenti anticorpi primari per 24 ore a 4 gradi Celsius. Dopo l'incubazione e il lavaggio della membrana con TBST tre volte per 10 minuti ciascuna, incubare con cinque millilitri di anticorpi secondari coniugati HRP a temperatura ambiente per due ore.
Infine, alla membrana lavata con TBST, aggiungere substrato HRP chemiluminescente per il rilevamento della banda proteica secondo le istruzioni del produttore. Quindi catturare le immagini utilizzando il sistema di imaging a chemiluminescenza per quantificare i valori di grigio delle proteine, con beta-actina come controllo interno. La vitalità cellulare sulle cellule PC12 normali era inferiore al 95% con iniezione di astragalo a concentrazioni superiori a 12 micromolari e superiore a 5 micromolari per la capsula del breviscapo.
L'iniezione di astragalo potrebbe migliorare il tasso di sopravvivenza delle cellule PC12 danneggiate nell'intervallo di concentrazione da 6 a 12 micromolari e della capsula di breviscapus da 2 a 5 micromolari. Mentre la combinazione di farmaci con un rapporto da 6 a 1,8 micromolari ha mostrato la più alta vitalità cellulare. La vitalità cellulare delle due combinazioni sulle cellule PC12 danneggiate è stata significativamente promossa e la combinazione di componenti è stata superiore alla combinazione di preparazione.
Il tasso di apoptosi ha mostrato che le percentuali di cellule apoptotiche precoci, tardive e totali erano significativamente più alte nel gruppo modello rispetto al gruppo normale. Rispetto al gruppo modello, le percentuali di cellule apoptotiche in ogni fase erano significativamente più basse nel gruppo di trattamento. L'intensità di fluorescenza della caspasi-3 era significativamente più bassa in ciascun gruppo di trattamento rispetto al gruppo modello ed era relativamente più bassa nel gruppo di combinazione di componenti.
L'espressione relativa dei geni Akt, Bcl-2 e Bax ha rivelato che la combinazione di componenti è superiore alla combinazione di preparazione nel promuovere la sopravvivenza cellulare, che è correlata al più forte effetto anti-apoptosi. La combinazione di componenti ha mostrato un migliore effetto di danno antiossidante rispetto a quello della combinazione di preparazione e un'espressione significativamente più elevata della proteina Nrf2. Questo metodo può essere utilizzato per esaminare e valutare la combinazione di componenti con altre potenziali attività farmacologiche dalla combinazione di erbe, come antinfiammatorio, antibatterico e altro.
