Il sequenziamento dell'intero genoma, WGS, può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della resistenza antimicrobica attraverso l'interrogazione del genoma e l'identificazione dei meccanismi molecolari alla base del fenotipo di resistenza antimicrobica. Il sequenziamento mondiale del genoma migliora l'esplorazione del DNA, DNA batterico su larga scala, facilitando la caratterizzazione approfondita dei microbi in un'unica corsa includendo varianti patogene strettamente correlate. Il sequenziamento di nuova generazione fornisce una rapida identificazione e caratterizzazione dei microrganismi e del loro profilo di resistenza antimicrobica considerando uno strumento per la diagnosi, il trattamento, la sorveglianza e il monitoraggio della fonte dei patogeni nel contesto clinico.
Le metodologie di sequenziamento di nuova generazione possono svolgere un ruolo determinante nella sorveglianza e nel tracciamento delle fonti dei patogeni non solo nel contesto clinico ma anche in contesti ambientali e, soprattutto, nella sicurezza alimentare. Attualmente, questa non è una tecnica di routine. In effetti, un po 'della procedura renderà più facile capire quanto successo eseguono l'esperimento.
A dimostrare la procedura sarà Julissa Enciso-Ibarra, il tecnico di genomica del nostro gruppo di lavoro. Dopo aver estratto e quantificato il DNA batterico aggiungere 2,5 microlitri di tampone di etichettatura. Due microlitri di input G D N A in un tubo da 0,2 millilitri e miscelare mediante pipettaggio.
Aggiungere un microlitro di buffer di amplificazione e pipetta su e giù per miscelare. Quindi ruotare il tubo a 280 G per un minuto. Posizionare i campioni in un termociclatore a 55 gradi Celsius per cinque minuti, quindi tenere premuto a 10 gradi Celsius.
Aggiungere un microlitro di tampone neutralizzante alle provette del campione e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Girare il tubo e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, aggiungere 1,7 microlitri di ciascun adattatore indice e tre microlitri di master mix PCR indicizzato.
Dopo aver miscelato i componenti, centrifugare a 280 G per un minuto a temperatura ambiente. Posizionare i campioni nel termociclatore ed eseguire una seconda reazione PCR come descritto nel manoscritto. Ora mescolare la soluzione commerciale di perline magnetiche mediante vortice.
Secondo le linee guida del produttore. Trasferire il campione G D N A etichettato o indicizzato in un nuovo tubo da cinque millilitri e aggiungere 0,6 microlitri di perle magnetiche per ogni microlitro del volume finale del campione G D N A. Mescolare delicatamente i componenti mediante pipettaggio e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.
Posizionare le provette su un rack magnetico per due minuti fino a quando il surnatante non si è liberato. Scartare il surnatante con attenzione senza disturbare le perline. Quindi aggiungere 200 microlitri di etanolo all'80% appena preparato senza mescolare.
Incubare per 30 secondi fino a quando l'eluit si cancella e rimuovere con cura il surnatante senza disturbare le perline. Ripetere questa procedura e asciugare all'aria le perline per 10 minuti. Ora aggiungere 15 microlitri di tampone tris da 10 millimolari alle perle mescolate delicatamente mediante pipettaggio e incubare per due minuti a temperatura ambiente.
Posizionare le provette sul rack magnetico per due minuti in modo da consentire al surnatante di liberarsi. Successivamente, trasferire con attenzione 14 microlitri di surnatante dalla provetta del campione a una nuova provetta da 0,2 millilitri e ottenere la libreria ripulita. Scongelare la cartuccia del reagente seguendo le istruzioni del produttore.
Tirare cinque microlitri della libreria normalizzata in un tubo da 1,5 millilitri a basso legame e diluire la libreria in pool a quattro nanomolari con il volume corretto di RSB. Quindi aggiungere cinque microlitri ciascuno della libreria in pool e 0,2 idrossido di sodio normale in un nuovo tubo da 1,5 millilitri a basso legame. Per denaturare la libreria raggruppata in singoli fili, mescolare il tubo a vortice.
Girare per un minuto e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente. Ora aggiungere 10 microlitri della libreria in pool denaturata 990 microlitri di tampone di ibridazione pre-raffreddato e mescolare delicatamente mediante pipettaggio. Posizionare il tubo su ghiaccio fino a quando non viene eseguita la diluizione finale per il caricamento del sequencer.
Versare e preparare una libreria di controllo ad una concentrazione di quattro nanomolari mescolando due microlitri della libreria di controllo e tre microlitri di acqua priva di nucleasi. Quindi aggiungere cinque microlitri ciascuno della libreria di controllo e 0,2 idrossido di sodio normale appena preparato. Denaturare la libreria di controllo in singoli filamenti come illustrato in precedenza.
Mescolare delicatamente 10 microlitri di libreria di controllo denaturata e 990 microlitri di tampone di ibridazione pre-raffreddato mediante pipettaggio e posizionarlo su ghiaccio fino al completamento della diluizione finale per il caricamento del sequencer. In un nuovo tubo a basso legame, da 1,5 millilitri, combinare 594 microlitri della libreria in pool denaturata e sei microlitri della libreria di controllo denaturata. Miscelare correttamente e diluire la miscela finale della libreria a una concentrazione di carico finale di 1,2 molari peco in un volume di 600 microlitri utilizzando il tampone di ibridazione pre-raffreddato.
Prima di caricare la miscela finale della libreria sulla cartuccia del reagente, eseguire un ulteriore pretrattamento termico per ottenere un carico efficiente nella cella di flusso. Incubare la miscela finale della libreria per due minuti a 96 gradi Celsius. Capovolgere il tubo per mescolare e posizionare il tubo sul ghiaccio per cinque minuti.
Caricare 500 microlitri della miscela di libreria finale nel serbatoio di progettazione sulla cartuccia del reagente. Dopo aver avviato il sequenziatore, caricare la cartuccia del reagente, la cella di flusso e impostare l'esecuzione del sequenziamento. Per l'analisi dei dati, connettersi al server di sequenziamento dei dati e scaricare i file FASTQ.
Valuta la qualità iniziale dei dati di sequenza grezzi con software di terze parti. Rimuovere le sequenze di adattatori rimanenti, le basi di bassa qualità e le letture brevi dai dati di sequenziazione non elaborati. Assembla i dati di sequenziamento del controllo qualità a livello di contig o scaffold utilizzando software di terze parti.
Eseguire l'annotazione del genoma inviando il file Phaster contenente il genoma assemblato al server RAST. Caricare il file Phaster sulle piattaforme web del Center for Genome Epidemiology e Claremont typing per identificare le caratteristiche epidemiologiche. ARGS, VAGS e plasmidi.
Caricare il file Phaster sul server Phaster per identificare le sequenze di profagi. L'annotazione del genoma ha rivelato 5.633 caratteristiche codificate di cui 5.524 sono geni di rivestimento proteico e 109 sono sequenze correlate all'RNA. Il ceppo di Escherichia coli previsto appartiene al filo del gruppo B uno e al tipo di sequenza 40.
È stato identificato un determinante della resistenza antimicrobica, il gene M D F A che codifica per una pompa di efflusso multifarmaco ad ampio spettro. Sono stati inoltre identificati i geni che codificano per un'enterotossina termostabile, una proteina di resistenza sierica e il sistema di secrezione di tipo tre insieme alle sue proteine effettrici secrete. Le sequenze codificanti sono raggruppate in raccolte di proteine funzionalmente correlate chiamate sottosistemi, in particolare quelle che svolgono ruoli funzionali nei carboidrati, nelle proteine, negli amminoacidi e nei metabolismi derivati e nel trasporto di membrana.
Le buone pratiche di laboratorio sono fondamentali in tutto il protocollo. Tuttavia, è necessario prestare particolare attenzione quando si elaborano più campioni durante la preparazione della libreria di DNA sezionale per evitare la contaminazione incrociata.
