Questo protocollo aiuterà i ricercatori nuovi a lavorare con gli aptameri per essere in grado di usarli nei loro progetti e anche a comprendere i singoli piccoli passi necessari per completare il protocollo. Gli aptameri sono molto versatili e questo protocollo dimostra quanto siano facili e semplici in un test di immunofenotipizzazione. Gli aptameri possono essere utilizzati sia per applicazioni diagnostiche che terapeutiche.
Questo protocollo è il primo passo intrapreso per confermare la loro specificità e sensibilità. Mentre questo particolare test dimostra la colorazione di un recettore della superficie cellulare, gli aptameri possono essere facilmente utilizzati per la citometria a flusso multiparametrica, fornendo un alto livello di conoscenza fenotipica. Gli aspetti importanti del lavoro con gli aptameri sono garantire che siano piegati correttamente prima dell'uso e anche che le condizioni di buffer e forza ionica siano le stesse di quando sono state selezionate.
Dopo aver raccolto e scartato il supporto nel pallone, aggiungere tre millilitri di PBS e distribuirlo sulle cellule. Dopo aver aggiunto un millilitro di 0,25% di tripsina-EDTA a ciascun pallone, incubare per cinque a 10 minuti a 37 gradi Celsius e visualizzare il distacco delle cellule al microscopio. Quindi, aggiungere un millilitro di mezzo completo alle celle e pipettare le celle su e giù per creare una sospensione a cella singola.
Pipettare le cellule in un tubo appropriato e centrifugare a 200 G per cinque minuti. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in un millilitro di terreno fresco e contare le cellule usando la colorazione blu tripano diluendo un certo volume di sospensione cellulare con blu tripano. Distribuire circa 15 microlitri della miscela tra un emocitometro e un vetro di copertura per contare le cellule.
Raccogliere il numero richiesto di celle, assicurandosi di avere centomila celle per campione di prova. Quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per due ore per consentire la stabilizzazione della proteina di interesse sulla membrana cellulare a seguito del distacco enzimatico. Dopo le due ore di incubazione, centrifugare le cellule a 500 G per cinque minuti.
Dopo aver scartato il surnatante, risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone bloccante. Incubare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti con miscelazione intermittente. Durante questa incubazione di 30 minuti, eseguire il ripiegamento dell'aptamero preparando il doppio delle concentrazioni di aptameri descritte nel manoscritto.
Quindi mescolare e incubare gli aptameri con la macchina termociclatrice in base alle condizioni di piegatura richieste, assicurando al contempo di proteggere gli aptameri dalla luce. Dopo l'incubazione di 30 minuti, centrifugare le cellule come dimostrato in precedenza e rimuovere il surnatante. Quindi aggiungere un millilitro di tampone di lavaggio e centrifugare nuovamente le celle.
Dopo aver rimosso il surnatante, risospendere le celle in un volume adeguato del buffer di legame. Quindi, pipettare 50 microlitri delle celle risospese in ciascun pozzetto di una lastra nera ghiacciata da 96 pozzetti. Quindi pipettare 50 microlitri di aptameri su un volume di 50 microlitri di cellule, mescolare e incubare al buio a quattro gradi Celsius per 30 minuti.
Dopo la centrifuga e la rimozione del surnatante, risospendere accuratamente il pellet nel tampone di lavaggio e centrifugare nuovamente a 500 G per cinque minuti. Quindi risospendere in 100 microlitri di tampone di lavaggio per l'analisi citometrica a flusso ripetendo la fase di lavaggio due volte. Innanzitutto, accendi il citometro a flusso e poi il computer.
Quindi, apri il software di analisi della citometria a flusso, accedi al programma e nella scheda del citometro esegui l'avvio del fluido. Per creare un nuovo esperimento, nella scheda dell'esperimento fare clic su nuova cartella e assegnare al esperimento la barra assegna il nome appropriato. Fare clic sulla nuova cartella per evidenziarla.
Quindi, nella scheda dell'esperimento, fai di nuovo clic su nuovo esperimento e assegna al esperimento il nome appropriato. Per aggiungere il primo campione barra, nella scheda dell'esperimento fare clic su nuovo campione e assegnare al campione il nome appropriato. Per aggiungere un campione di provetta, evidenziare il campione e nella scheda dell'esperimento, fare clic su nuovo tubo.
Quindi aggiungere il numero appropriato di tubi e il nome. Per preparare i grafici necessari, in una scheda del foglio di lavoro aprire un nuovo foglio di lavoro. Una volta visualizzata la nuova finestra del foglio di lavoro, preparare un grafico a macchie di punti della dispersione laterale rispetto alla dispersione in avanti per selezionare la popolazione di interesse.
Preparare un grafico a punti macchia dell'altezza di dispersione diretta rispetto all'area di dispersione diretta per selezionare la popolazione di singole celle. Quindi, preparare un istogramma del numero di eventi rispetto al fluoroforo di interesse. Assicurarsi che il cruscotto di acquisizione per il controllo dell'acquisizione del campione, dell'ispettore e del citometro per regolare i parametri di tensione e il foglio di lavoro con tutti i grafici siano aperti prima di iniziare la citometria a flusso.
Innanzitutto, eseguire le cellule non trattate. Assicurati che la freccia che punta al tubo sia verde. Se questa freccia non è verde, fare clic sulla freccia per renderla verde.
Utilizzando la pipetta, trasferire ogni campione dalla piastra nera a 96 pozzetti a un tubo di citometria a flusso. Nel dashboard di acquisizione, scegliere un numero appropriato di eventi da registrare, impostare la portata su bassa e fare clic su Acquisisci dati. Regolare la tensione per i parametri FSC e SCC, assicurandosi che la popolazione di celle sia centralizzata all'interno del dot plot e che nessuna cella tocchi entrambi gli assi del grafico per evitare di perdere le celle di interesse.
Definire la prima porta identificando e selezionando la popolazione di interesse in un grafico di densità diffusa in avanti e lateralmente escludendo i detriti, che costituiscono la popolazione con il segnale di dispersione diretta più basso. Definire il secondo gate escludendo le popolazioni di cellule doppiette, poiché le cellule doppiette influenzano considerevolmente i risultati e le conclusioni. Aumentare la velocità di acquisizione a media o alta per analizzare i campioni più velocemente, ma non superare più di 200-300 eventi al secondo.
Quindi fare clic su registra dati. Dopo aver regolato la tensione e il gating e registrato i dati, estrarre il campione e fare clic su Next Tube. Inserire il campione successivo e ripetere i dati di registrazione per tutti i campioni di controllo e di prova.
Una volta raccolti tutti i dati, lavare il citometro a flusso facendo funzionare tre tubi di candeggina al 50%, FACSRinse e acqua ultrapura, ciascuno per cinque minuti ad alta portata. Quindi, dal menu a discesa del citometro, fare clic su fluidics shutdown. Esporta il risultato come file fsc su un'unità USB da trasferire.
Analizzarli utilizzando il software di analisi premendo il nuovo pulsante per creare un nuovo documento e una finestra per gestire l'analisi e trascinare i file di esempio nella nuova finestra. Fare doppio clic per aprire il campione non macchiato. Per controllare la popolazione a cella singola, scegliere la popolazione P1 e fare doppio clic sulla popolazione P1 per creare un grafico FSCH rispetto a FSCA.
Fare doppio clic sulle singole celle gated per creare un istogramma di eventi rispetto al fluorocromo utilizzato. Nella finestra originale selezionare P1 e celle singole e trascinarle su tutti i campioni in modo che tutti i campioni contengano ora lo stesso gating. Quindi, fai clic sul pulsante dell'editor di layout per aprire la finestra dei layout e trascina due esempi uno sull'altro per creare un istogramma sovrapposto.
Nelle cellule MDA-MB-231 positive all'EpCAM, la sovrapposizione degli istogrammi che rappresentano le cellule trattate con TEPP e TENN mostra che le cellule trattate con TEPP sono spostate verso destra, rispetto alle cellule trattate con TENN dimostrando che il legame dell'aptamero TEPP avviene alla proteina di interesse. Nel controllo negativo, le cellule HEK 293T sovrapposte agli istogrammi di TEPP e TENN non riflettono alcuno spostamento indicando che nelle cellule che esprimono EpCAM TEPP è l'aptamero EpCAM attaccato al suo recettore. Inoltre, non è stato osservato alcun legame nelle cellule EpCAM negative, il che conferma la selettività e la specificità dell'aptamero sviluppato.
Assicurarsi che gli aptameri siano protetti dalla luce, che gli aptameri e le cellule siano miscelati sulla piastra e che le tensioni corrette siano impostate sul citometro a flusso. Questo dipende fortemente dalle future applicazioni per gli aptameri. Ad esempio, ci concentriamo sulla somministrazione di farmaci.
Quindi il prossimo passo per noi sarebbe valutare se gli aptameri sono internalizzati usando la microscopia fluorescente. Questo protocollo ha dimostrato quanto sia facile per gli aptameri sostituire gli anticorpi monoclonali e policlonali nei saggi di immunofenotipizzazione.
