Questo protocollo fornisce un metodo rapido ed economico per il passaggio senza enzimi di cellule staminali pluripotenti umane coltivate su cellule feeder. Il vantaggio di questo protocollo è che non richiede costosi terreni di coltura e substrati di crescita privi di alimentatore, evita il rischio di completa dissociazione da parte degli enzimi e riduce il rischio che le cellule staminali passino a uno stato innescato. A dimostrare la procedura sarà Hege Brincker Fjerdingstad, responsabile quotidiano della struttura centrale norvegese per le cellule staminali pluripotenti umane.
Per iniziare il seme 0,5 per 10 ha sollevato alla potenza 6 fibroblasti umani, di seguito denominati cellule di alimentazione, in un matraccio di coltura T 75 con 20 millilitri di IMDM contenente il 10% di FBS, di seguito denominato terreno di coltura di alimentazione. Quando le cellule di alimentazione hanno raggiunto il 90% di confluenza, rimuovere il terreno e lavare le cellule tre volte con 10 millilitri di DPBS per evitare l'inibizione della tripsina da parte di fattori nel mezzo. Aggiungere due millilitri di tripsina EDTA al pallone e incubare a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5% per circa cinque minuti, osservando ad occhio nudo il distacco delle cellule di alimentazione.
Una volta iniziato il distacco, continuare a osservare la dissociazione delle cellule al microscopio per assicurarsi che tutti gli aggregati siano dissociati in singole cellule. Successivamente, aggiungere cinque millilitri di terreno fresco e preriscaldato per inattivare la tripsina-EDTA e sospendere delicatamente le cellule di alimentazione mediante pipettaggio. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 millilitri, quindi tappare la provetta e centrifugare a 200 G per 5 minuti.
Rimuovere con cautela il liquido senza disturbare il pellet e risospenderlo in quattro millilitri di terreno fresco per celle di alimentazione. Dopo essersi assicurati che le cellule di alimentazione siano completamente ri-sospese, contarle utilizzando una camera di conteggio delle cellule e calcolare il numero di cellule necessarie per la coltura delle HSC e delle HI PSC su piastre di coltura tissutale da 35 millimetri. Successivamente, per eseguire l'arresto mitotico mediante irradiazione gamma, trasferire il numero appropriato di cellule di alimentazione in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e aggiungere il terreno di coltura di alimentazione a un volume totale di cinque millilitri.
Trasportare immediatamente a temperatura ambiente in una macchina di irradiazione gamma e irradiare per arrestare le cellule mitoticamente. Una volta che le cellule di alimentazione sono state arrestate mitoticamente sotto una cappa di coltura tissutale, sospendere nuovamente le cellule nel mezzo cellulare di alimentazione per ottenere una concentrazione cellulare di 1,5 per 10 elevata alla potenza di 5 per millilitro. Aggiungere 2 millilitri di sospensione di celle di alimentazione in un piatto da 35 millimetri e trasferire il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5%.
Per una distribuzione uniforme delle cellule, muovere il piatto lentamente ma con decisione sul ripiano dell'incubatrice avanti e indietro. Quindi fare una pausa ed eseguire la stessa azione da sinistra a destra prima di chiudere lo sportello dell'incubatrice. Dopo 24 ore, sostituire il terreno cellulare di alimentazione con IMDM contenente il 10% di siero sostitutivo.
Dalla piastra di coltura contenente cellule nutritrici tamponate mitoticamente, sostituire l'IMDM contenente il 10% di terreno sostitutivo del siero con 1,2 millilitri di terreno HESC preriscaldato contenente il fattore di crescita basico dei fibroblasti o BFGF, 30 minuti prima del trasferimento delle colonie. Successivamente, rimuovere il terreno da una piastra di coltura contenente HSC o HI PSC e lavare le colonie con un millilitro di DPBS, per rimuovere le cellule non attaccate e i detriti cellulari. Aggiungere un millilitro di EDTA 0,5 millimolari e incubare per un minuto a 37 gradi Celsius.
Quindi, utilizzando una pipetta da un millilitro, sostituire la soluzione di EDTA con un millilitro di terreno HESC contenente BFGF. Triturare delicatamente con la stessa pipetta per rilasciare le colonie dallo strato di cellule di alimentazione fino a quando lo strato non si allenta e si ripiega su se stesso in un grumo separato. Spingere lo strato di cellule di alimentazione verso il bordo del pozzetto di coltura con un puntale per pipetta.
Utilizzando una nuova pipetta da un millilitro, trasferire le colonie sospese in una nuova piastra di coltura con cellule di alimentazione e terreno HESC contenente BFGF, dividendo in un rapporto di uno a cinque. Trasferisci la capsula in un'incubatrice e spostala delicatamente da un lato all'altro per facilitare la distribuzione uniforme delle colonie. Le colonie HESC raccolte con EDTA erano più omogenee in termini di dimensioni e forma rispetto a quelle raccolte meccanicamente.
La densità cellulare nelle colonie raccolte e riplatnate era simile per la raccolta basata su EDTA e la raccolta meccanica. Le colonie raccolte meccanicamente avevano una maggiore tendenza a sviluppare necrosi nelle loro regioni centrali, mentre le colonie raccolte utilizzando EDTA mostravano un aspetto traslucido con bordi distinti. L'analisi QPCR ha mostrato un'espressione stabile del marcatore di staminalità a livello dell'mRNA per le colonie ottenute dopo 20 passaggi utilizzando il prelievo meccanico o basato su EDTA.
Osservazioni simili sono state fatte con colorazione immunochimica a livelli proteici per le colonie ottenute dopo 20 passaggi utilizzando la raccolta meccanica o basata su EDTA. I corpi embrioidi generati dalle HSC ottenuti dopo 20 passaggi utilizzando entrambi i metodi contenevano una miscela di cellule che esprimevano marcatori comunemente valutati per l'ectoderma, il mesoderma e l'endoderma. Inoltre, l'analisi genetica basata sulla QPCR delle aberrazioni genomiche comuni ha mostrato una modesta deviazione da un modello cromosomico diploide di riferimento.
È importante limitare l'esposizione all'EDTA a un minuto. Un'esposizione prolungata può portare a un'eccessiva dissociazione. È anche importante allontanare bene lo strato di cellule di alimentazione in modo che non sia d'intralcio quando si trasferiscono le cellule staminali embrionali umane o le cellule staminali pluripotenti indotte umane in un nuovo piatto di coltura.
Il passaggio alla coltura e alle condizioni di assenza di mangimi in cui l'EDTA è comunemente usato per i patogeni è semplice e non cambiamo il modo in cui le cellule vengono trattate.
