Lo xenotrapianto derivato dal paziente zebrafish è un potente modello preclinico per prevedere il profilo di chemiosensibilità del paziente oncologico in vivo. Il protocollo descrive la generazione del modello a partire da un campione chirurgico del paziente. Xenotrapiando un piccolo frammento di tessuto piuttosto che isolare le cellule in embrioni di zebrafish, è possibile mantenere il microambiente tumorale che è il passo cruciale per la progressione del tumore e la risposta alla chemioterapia.
Il grande vantaggio del modello è dato dal suo potenziale di prevedere la prognosi del paziente in un arco temporale clinicamente rilevante di una sola settimana agendo come strumento per la medicina personalizzata. Iniziare l'elaborazione del campione lavando l'intero tessuto tumorale raccolto dal paziente con cinque millilitri di terreno tumorale fresco. Pipettarlo su e giù 10 volte usando una pipetta Pasteur di plastica.
Aspirare con cura e scartare il mezzo di lavaggio prima di ripetere il lavaggio tre volte. Immergere il campione in uno o due millilitri di terreno tumorale fresco. Tagliare il campione di tumore in pezzi cubici da uno a due millimetri usando una lama di bisturi, quindi metterli in un tubo di plastica sterile da cinque millilitri con mezzo tumorale.
Dopo aver impostato il McIlwain Tissue Chopper a 100 micrometri di spessore, posizionare i pezzi di tumore sul tavolo di plastica circolare del chopper e tritarli. Ruotare il tavolo di 90 gradi e ripetere il taglio. Raccogliere i frammenti tumorali tritati in un tubo di plastica da 15 millilitri contenente il mezzo tumorale.
Centrifugare i frammenti tumorali tritati a 300 G per tre minuti prima di aspirare ed eliminare il surnatante. Incubare i frammenti con la soluzione di traccia cellulare o con un tracker cellulare fluorescente alternativo come CM-DiI o Deep Red per 30 minuti a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Durante l'incubazione, risospendere delicatamente i frammenti ogni 10 minuti.
Alla fine della colorazione, rimuovere qualsiasi colorante libero aggiungendo un mezzo tumorale integrato con almeno l'1% di proteine. Il volume sarà cinque volte il volume di colorazione. Centrifugare i frammenti a 300 G per tre minuti ed eliminare il surnatante.
Aggiungere un millilitro di soluzione salina tamponata fosfato di Dulbecco o DPBS e ripetere questa fase di lavaggio tre volte. Una volta fatto, sospendere i frammenti in cinque millilitri di DPBS in una capsula di Petri da 60 millimetri. Per stabilire gli xenotrapianti derivati dal paziente a base di zebrafish o zPDX, anestetizzare gli embrioni due giorni dopo la fecondazione.
In una capsula di Petri con tre cilindri di agarosio, deporre un embrione di zebrafish su un cilindro che espone un lato. Rimuovere la soluzione in eccesso per mantenere l'embrione in un film sottile. Utilizzando una pinza sterile, trasferire il pezzo di frammenti di tessuto tumorale colorato da una capsula di Petri di 60 millimetri al supporto dell'1% di agarosio dove viene deposto l'embrione.
Quindi raccogliere il tessuto e posizionarlo sul tuorlo dell'embrione prima di spingerlo nello spazio perivitellino usando il microago di vetro tirato a caldo. Aggiungere alcune gocce di streptomicina E3 1% penicillina all'embrione per riportarlo nel liquido. Dopo aver ripetuto l'impianto del tessuto tumorale in tutti gli embrioni, rimuovere i supporti di agarosio dalla piastra di Petri e incubare gli embrioni a 35 gradi Celsius.
Due ore dopo l'impianto, controllare gli embrioni per gli xenotrapianti corretti con colorazione positiva utilizzando uno stereomicroscopio fluorescente. Scartare gli embrioni morti e gli embrioni senza i frammenti tumorali completamente all'interno dello spazio perivitellino. Una volta fatto, distribuire casualmente gli embrioni in sei piastre multi-pozzetto, equamente divise in gruppi secondo il piano sperimentale.
Diluire i farmaci mescolandoli in E3 1% pen-streptococco per preparare il cocktail FOLFOXIRI. Dopo due ore di impianto, rimuovere il supporto da ciascun pozzetto e aggiungere il cocktail di droga. Mettere gli embrioni nell'incubatrice a 35 gradi Celsius per tre giorni con cambi giornalieri del mezzo per rinnovare i farmaci.
Per l'imaging, cattura le immagini sotto un obiettivo 40X del microscopio confocale. Utilizzare la risoluzione di 1024 per 512 pixel con una spaziatura Z di cinque micrometri. L'intera immagine di montaggio di zPDX acquisite per analizzare l'apoptosi rilevata in ciano ha mostrato che la terapia combinata ha aumentato l'apoptosi cellulare rispetto al gruppo di controllo.
Il caso di studio ha riportato che un aumento statisticamente significativo della frazione di cellule apoptotiche negli xenotrapianti impiantati è stato identificato per il gruppo trattato con FOLFOXIRI rispetto al gruppo di controllo. Il protocollo mostra un esempio utilizzando tessuto tumorale pancreatico, ma gli xenotrapianti derivati dal paziente zebrafish possono essere stabiliti da diversi tipi di cancro. Inoltre, poiché il modello ha un basso impatto etico, è facilmente sfruttabile per lo screening in vivo di nuovi farmaci.
Il metodo è tecnicamente impegnativo e richiede un operatore esperto. Precedenti competenze nella manipolazione degli embrioni di zebrafish e nella microiniezione accelereranno l'addestramento della tecnica.
