Questo metodo fornisce nuove informazioni su come produrre in serie conidi infettivi di funghi entomopatogeni per controllare importanti insetti nocivi negli agroecosistemi commerciali, data l'attuale situazione in cui la maggior parte degli insetticidi viene gradualmente eliminata a causa delle preoccupazioni del loro effetto tossico sull'ambiente e sulla salute umana. La tecnica descrive il metodo utilizzato per garantire la resa ottimale dei conidi EPF durante la produzione di massa. Il metodo è utile per la gestione integrata dei parassiti e il controllo biologico fornendo informazioni sull'efficacia dei conidi prodotti in serie per la gestione su larga scala dei dannosi insetti nocivi resistenti agli insetticidi negli agroecosistemi.
Questa procedura è stata sviluppata e dimostrata dal Dr.Letodi Luki Mathulwe, dal Dr.Nomakholwa Faith Stokwe e dalla Professoressa Antoinette Paula Malan. Riscaldare un litro di acqua distillata e spegnere il fuoco prima di raggiungere il punto di ebollizione. Ora, aggiungi 30 grammi di glucosio, quattro grammi di fosfato di potassio bibasico, 20 grammi di estratto di lievito, 15 millilitri di liquore ripido di mais e porta il contenuto a ebollizione delicata per due o tre minuti.
Versare un totale di 100 millilitri del mezzo in nove diversi palloni da 250 millilitri. Posizionare un tappo di cotone idrofilo su ogni pallone e coprire il batuffolo di cotone con un foglio di alluminio come tappo. Autoclave del mezzo nei palloni per 55 minuti a 121 gradi Celsius.
Successivamente, lasciare raffreddare il mezzo nei palloni e aggiungere 10 milligrammi per millilitro di streptomicina al mezzo in ogni pallone. Raccogliere da due a tre anelli batterici di conidi fungini da piastre di coltura fungina di due o tre settimane per entrambi gli isolati di EPF. Trasferire i conidi fungini in ogni 100 millilitri di liquido nei palloni da 250 millilitri in condizioni sterili e sigillare i palloni.
Incubare i palloni di coltura liquida a circa 25 gradi Celsius su uno shaker orbitale a 140 RPM per tre giorni e cessare l'incubazione una volta che le colture mostrano segni di elevata torbidità con la crescita di blastospore fungine. Per rilevare qualsiasi possibile contaminazione batterica dalle colture, prelevare un campione di 100 microlitri da ciascun pallone di coltura liquida dopo 24 ore di incubazione e piastra su tre piastre SDA per isolato. Incubare le piastre per 48 ore a una temperatura controllata di più o meno 25 gradi Celsius.
Utilizzare un piccolo tubo di scarico di cloruro di polivinile per creare un collo per il sacchetto di fermentazione all'estremità aperta del sacchetto dell'autoclave e utilizzare il nastro adesivo per fissare il tubo. Chiudere il tubo con un tappo di cotone idrofilo sterile per consentire un sufficiente scambio di gas durante la fermentazione. Utilizzare riso bianco parboiled a grana lunga come substrato solido per le blastospore di Metarhizium pinghaense e Metarhizium robertsii.
Per ogni sacchetto di fermentazione, aggiungere un chilogrammo di riso e 300 millilitri di acqua distillata sterile. Mescolare delicatamente il contenuto dei sacchetti di fermentazione. Metterli in sacchetti esterni in autoclave in posizione verticale e autoclave a 121 gradi Celsius per 55 minuti.
Dopo l'autoclave, lasciare raffreddare i substrati per circa 45 minuti in condizioni sterili. Rimuovere la chiusura di ciascuno dei palloni di coltura liquida di Metarhizium pinghaense e Metarhizium robertsii sotto un flusso laminare e fiammare il bordo di ciascun matraccio per 10 secondi. Versare 100 millilitri di colture liquide nei sacchetti di fermentazione rimuovendo i tappi di cotone idrofilo dal collo.
Riposizionare i tappi di cotone e coprire la parte superiore del collo della borsa con carta chirurgica fissata con un elastico. Ruotare la parte superiore della borsa e mescolare il contenuto della borsa agitando e manipolando il substrato mediante massaggio. Incubare i sacchetti a circa 25 gradi Celsius appiattindo il substrato nei sacchetti per evitare la formazione di letti spessi.
Due o tre giorni dopo l'inoculazione e l'incubazione, quando si era verificata la crescita miceliale visibile e il legame del substrato da parte del fungo, rompere il substrato nei sacchi di fermentazione massaggiando il contenuto dei sacchetti. Dopo la fermentazione, trasferire le colture sporulate in sacchetti di carta marrone da 26 a 30 chilogrammi e asciugare le colture fungine per 10-12 giorni prima del loro utilizzo nelle prove. Per migliorare la resistenza alla trazione dei sacchetti di carta, tagliare orizzontalmente 1/3 della parte superiore del sacchetto e foderare il fondo del sacchetto.
Sbriciolare delicatamente il substrato in ogni sacchetto di fermentazione. Taglia l'angolo di ogni sacchetto e trasferisci lentamente l'intera cultura nei sacchetti di carta attraverso lo spazio lasciato dall'angolo tagliato. Etichetta ogni sacchetto di carta, piega due volte l'estremità superiore di ogni sacchetto e chiudi con graffette per creare una struttura triangolare della tenda.
Posizionare i sacchetti su stendibiancheria per consentire una corretta e uniforme asciugatura a una temperatura controllata di circa 25 gradi Celsius e bassa umidità dal 30 al 40% Raccogliere i conidi fungini dalle colture utilizzando tre setacci nidificati montati su una padella di raccolta. Caricare lentamente il campione di coltura a secco sulla maglia ETS numero 35 e setacciare. Posizionare un coperchio sul setaccio per impedire il rilascio di conidi fungini nell'aria.
Aggiungere da 10 a 12 biglie di vetro ai setacci per favorire il passaggio dei conidi fungini attraverso gli schermi a rete ed evitare la ritenzione dei conidi nel setaccio, che può comportare un ridotto recupero delle spore. Nastro adesivo e sigillare i giunti del setaccio utilizzando nastro adesivo. Posizionare i setacci su uno shaker vibrante dotato di un cuscinetto appiccicoso per fissare la padella di raccolta e i setacci per 20-25 minuti con un movimento da 560 a 640 vibrazioni al minuto.
Rimuovere i setacci di prova dalla padella di raccolta, raccogliere i conidi e conservare i conidi raccolti in sacchetti ermetici e impermeabili con chiusura a cerniera per la conservazione a lungo termine. Una media di circa 1,83 grammi di Metarhizium robertsii conidia secca è stata raccolta dal substrato d'orzo in fiocchi, mentre zero Metarhizium pinghaense è stato raccolto dal substrato. Nessun conidi fungino secco è stato raccolto dal substrato di avena in scaglie per entrambe le specie di Metarhizium.
Una differenza significativa è stata osservata tra le due specie di Metarhizium nei conidi medi stimati per grammo raccolto dai chicchi di riso. Metarhizium robertsii aveva un numero medio di conidi per grammo leggermente superiore a Metarhizium pinghaense. Nessuna differenza significativa è stata osservata tra le due specie di Metarhizium nel numero stimato di conidi presenti sul substrato di riso esaurito.
Tuttavia, Metarhizium pinghaense aveva conidi leggermente più alti sul substrato di riso rispetto a Metarhizium robertsii Nessuna differenza significativa è stimata nelle due specie di Metarhizium nella loro resa complessiva di conidi ottenuta dalle colture di substrato di riso. Tuttavia, Metarhizium pinghaense ha prodotto una resa di conidi leggermente superiore rispetto a Metarhizium robertsii, che ha prodotto una resa conidiale inferiore. La parte impegnativa di questa tecnica è la contaminazione del substrato attraverso l'inoculazione con un inoculo di blastospore contaminato.
Pertanto, garantire sempre la sterilità durante il lavoro. Questa dimostrazione aiuta gli studenti a riprodurre in modo efficiente la tecnica senza errori maldestri che possono comportare la fine dell'intero processo.
