L'ispessimento osseo subcondrale, o sclerosi, è uno dei tratti distintivi dell'osteoartrite, sia nei modelli animali che negli esseri umani. Attualmente, la gravità dell'ispessimento osseo subcondrale istologico è per lo più determinata da una stima visiva basata su sistemi di classificazione semi-quantitativi. Questo studio mira a sviluppare un protocollo riproducibile e facilmente eseguibile per misurare quantitativamente lo spessore dell'osso subcondrale in un modello murino di OA del ginocchio indotto dalla destabilizzazione del menisco mediale.
Abbiamo creato un modello murino per l'artrosi del ginocchio mediante destabilizzazione chirurgica del menisco mediale che viene eseguita al microscopio chirurgico e la condizione sterile. Il processo istologico delle articolazioni del ginocchio del topo include la fissazione dei tessuti, la decalcificazione, il taglio, l'elaborazione, l'incorporamento, il sezionamento e la colorazione, seguiti dall'imaging microscopico. L'immagine sullo schermo mostra l'artrosi del ginocchio del topo con lesioni della cartilagine articolare, formazione di osteofiti e ispessimento osseo subcondrale Misurazione quantitativa dell'osso subcondrale osteoartritico con il software ImageJ.
Scarica ImageJ da imagej.nih.gov/ij. Aprire ImageJ. Fare clic sulla scheda File e quindi sull'opzione Apri per aprire l'immagine istologica.
Individuare l'indirizzo della directory del file, selezionare il file di immagine e fare clic su Apri. Utilizzate lo strumento linea retta per tracciare un'unità di lunghezza, un micrometro, quindi fate clic su Analizza (Analyze), quindi su Imposta scala (Set Scale). Impostare la distanza nota e le proporzioni pixel su uno e fare clic su Ok.ImageJ può convertire la lunghezza dei pixel nella lunghezza dell'unità, un micrometro.
Impostare il fattore misurato su area. Fare clic su Analizza, quindi su Imposta misurazione e selezionare la casella Area e Limita a soglia nella nuova finestra. Questo passaggio imposta ImageJ per misurare l'area dei parametri all'interno della soglia selezionata.
Definita l'area ossea subcondrale totale di interesse come mostrato in radio che copre la piastra corticale subcondrale e una porzione dell'osso trabecolare sottostante adiacente alla piastra corticale. Tracciate il contorno dell'area totale dell'osso subcondrale utilizzando lo strumento di selezione sotto la finestra principale dell'immagine. Gli strumenti di selezione forniscono al sistema una soglia per limitare la misurazione dopo la selezione della soglia.
Fare clic su Analizza, quindi su Misura. Si aprirà una finestra dei risultati con la misurazione dell'area. Fare clic su Modifica, quindi su Cancella all'esterno per escludere l'area esterna all'area totale dell'osso subcondrale.
Solo l'area ossea subcondrale totale è visibile dopo aver fatto clic sull'opzione Cancella esterno. Fare clic su Immagine, quindi su Regola, quindi su Soglia colore per aprire la finestra del colore della soglia. Fare clic su Originale nella parte inferiore della finestra del colore di soglia per ripristinare lo stato originale dell'immagine.
Utilizzare gli strumenti di selezione per disegnare una piccola scatola nella regione della sostanza ossea. Fare clic su Opzione campione nella parte inferiore della finestra per definire l'area della sostanza ossea. L'area della sostanza ossea selezionata diventerà rossa.
Fare clic su Seleziona nella parte inferiore della finestra del colore della soglia per creare la soglia di misurazione dell'area. Fare clic su Analizza, quindi su Misura nel menu principale di ImageJ. Il risultato della misurazione dell'area della sostanza ossea verrà visualizzato nella finestra dei risultati.
Salvare i dati dell'area ossea subcondrale totale e dell'area della sostanza ossea. La variabilità inter e intraobserver e la riproducibilità sono state determinate dall'analisi del coefficiente di correlazione di Pearson. Il significato della differenza tra i gruppi di studio è stato determinato utilizzando Student t-test o ANOVA unidirezionale, seguito da test post-hoc.
Questa figura mostra i pannelli superiore e inferiore. Il pannello superiore mostra fotomicrografie di immagini istologiche dei gruppi Sham e DMM per la classificazione ossea subcondrale basata sulla stima visiva. I pannelli inferiori mostrano fotomicrografie di immagini istologiche dei gruppi Sham e DMM per la misurazione quantitativa dell'osso subcondrale assistita da ImageJ.
Le caselle delineate con una linea gialla tratteggiata realizzata con Adobe Illustrator definiscono l'area totale dell'osso subcondrale di interesse. L'area della sostanza ossea all'interno delle scatole è evidenziata in arancione. Un notevole ispessimento osseo subcondrale nel condilo femorale mediale e nel plateau tibiale mediale può essere quantificato utilizzando il software ImageJ.
In questa figura, i test di variazione interosservatore indicano un'elevata riproducibilità tra osservatori sia per la prima che per la seconda misurazione dello spessore osseo subcondrale nel plateau tibiale mediale e nelle regioni mediali del condilo femorale di interesse. In questa figura, i test di variazione intraobserver indicano un'elevata riproducibilità tra la prima e la seconda misurazione dello spessore osseo subcondrale nelle regioni di interesse del plateau tibiale mediale e del condilo femorale mediale. La Tabella 1 mostra l'analisi comparativa della riproducibilità tra la gradazione visiva e la misurazione quantitativa assistita da ImageJ dello spessore osseo subcondrale.
Il test del coefficiente di correlazione suggerisce che la misurazione quantitativa era relativamente più riproducibile rispetto al sistema di classificazione visiva. Questa figura mostra l'analisi comparativa della sensibilità del grading visivo e la misurazione quantitativa assistita da ImageJ dello spessore osseo subcondrale nel condilo femorale mediale e nel plateau tibiale mediale. Le immagini istologiche per la valutazione della stima visiva sono state divise in tre gruppi.
Il valore quantitativo dello spessore osseo subcondrale di tutti e tre gli osservatori per le immagini DMM con un punteggio visivo pari a zero era significativamente superiore a quello delle immagini Sham con un punteggio visivo pari a zero, indicando che la misurazione quantitativa è più sensibile della gradazione visiva a un lieve ispessimento osseo subcondrale. Il protocollo di nuova concezione per la misurazione quantitativa dello spessore osseo subcondrale osteoartritico è più sensibile ai lievi cambiamenti dell'osso subcondrale rispetto ai sistemi di classificazione visiva ampiamente utilizzati. E questo protocollo può essere utilizzato per rilevare i primi cambiamenti dell'osso subcondrale osteoartritico e per valutare l'efficacia in vivo dei trattamenti di osteoartrite in concerto con la classificazione della cartilagine dell'osteoartrite.
