Lo sviluppo di un laboratorio mitocondriale mobile consente ai fisiologi di portare il loro lavoro sul campo e, di conseguenza, possono valutare un'affascinante varietà di sfide energetiche che gli animali mostrano. La cattività è stressante per molti animali, quindi con un laboratorio mobile, ora possiamo portare il laboratorio agli animali piuttosto che riportare gli animali al laboratorio. Con la capacità di isolare e misurare la respirazione mitocondriale sul campo, le tecniche che sono state utilizzate principalmente dalla biomedicina possono ora essere utilizzate in un contesto ecologico ed evolutivo.
Inizia parcheggiando il laboratorio mobile su un terreno pianeggiante, quindi accendi il generatore e livella il veicolo. Estendere la slitta prima di installare l'attrezzatura. Procedere all'installazione e alla calibrazione delle camere di respirazione mitocondriale alla temperatura desiderata degli esperimenti e alla pressione barometrica corrente secondo le istruzioni del produttore.
Utilizzare un puntale per pipetta da cinque millilitri per trasferire il tessuto tritato in una provetta da centrifuga da 50 millilitri e omogeneizzare il tessuto con una lama al 50% di potenza per cinque secondi. Per digerire il tessuto, aggiungere cinque milligrammi di proteasi per grammo di muscolo bagnato per sette minuti, mescolando la soluzione ogni 30 secondi. Terminare la reazione aggiungendo un volume uguale del tampone di isolamento contenente BSA.
Quindi, centrifugare l'omogenato a 500 G per 10 minuti, quindi trasferire il surnatante utilizzando una punta di pipetta da cinque millilitri tagliata attraverso la garza a doppio strato in una provetta da centrifuga pulita da 50 millilitri, quindi centrifugare il surnatante filtrato a 3.500 G per 10 minuti per far precipitare un pellet mitocondriale marrone. Dopo aver scartato il surnatante, aggiungere lo stesso volume del tampone di isolamento contenente BSA alla provetta da centrifuga e risospendere il pellet mitocondriale con un raschietto flessibile lavorando delicatamente il pellet mitocondriale dalle pareti della provetta da centrifuga, quindi centrifugare la provetta a 3.500 G per 10 minuti. Risospendere il pellet nel tampone di isolamento senza BSA per ripetere la fase di centrifugazione come descritto in precedenza.
Dopo la seconda centrifugazione, risospendere il pellet mitocondriale nel tampone di risospensione con un raschietto pulito e flessibile e trasferire i mitocondri risospesi in un omogeneizzatore Dounce con una punta della pipetta da un millilitro tagliata. Con l'omogeneizzatore, omogeneizzare con cura la sospensione mitocondriale con quattro o cinque passaggi. Utilizzare un puntale per pipetta da un millilitro appena tagliato per trasferire la sospensione mitocondriale omogeneizzata in una provetta per microcentrifuga da due millilitri etichettata.
Per le misurazioni della respirazione mitocondriale dei substrati di uno complesso, aggiungere 945 microlitri di tampone respiratorio alla camera di respirazione mitocondriale. Assicurarsi che l'agitatore ruoti quando la temperatura del tampone viene mantenuta a 37 gradi Celsius. Sigillare la camera con la parte superiore, quindi iniziare a registrare la raccolta dei dati.
Dopo che la concentrazione di ossigeno si è stabilizzata, aggiungere 20 microlitri di sospensione mitocondriale alla camera e posizionare il coperchio. Nel software, indica che i mitocondri sono stati aggiunti alla camera. Aggiungere 10 microlitri ciascuno di un glutammato molare, 200 millimolari malato e 200 millimolari di piruvato nella camera con le singole siringhe e attendere che il segnale si stabilizzi prima di indicare i substrati aggiunti nel software.
Utilizzare una siringa separata per aggiungere cinque microlitri di adenosina difosfato, o ADP, alla camera. Indica l'ADP aggiunto nel software e osserva il rapido consumo di ossigeno dello stato tre. Dopo che la respirazione dello stato tre e il consumo di ossigeno mitocondriale sono rallentati per quattro minuti per indicare la respirazione dello stato quattro, terminare la registrazione e salvare il file di dati.
Per i due substrati complessi, ripetere la procedura aggiungendo 963 microlitri di tampone respiratorio alla camera. Dopo aver aggiunto 20 microlitri della sospensione mitocondriale, aggiungere in sequenza due microlitri di quattro microgrammi per microlitro di rotenone e 10 microlitri di succinato da 500 millimolari nella camera utilizzando le siringhe separate. Quando il segnale si stabilizza, indicare l'aggiunta del substrato nel software.
Con l'aggiunta di cinque microlitri di ADP, osservare il rapido consumo di ossigeno dello stato tre e indicare l'aggiunta di ADP nel software. Dopo che la respirazione dello stato tre e il consumo di ossigeno mitocondriale sono rallentati per quattro minuti per indicare la respirazione dello stato quattro, terminare la registrazione e salvare il file di dati. I risultati rappresentativi indicano i dati grezzi sulla respirazione mitocondriale.
La pendenza ripida del terzo gradino nei substrati di uno complesso rappresenta l'alto tasso massimo di respirazione. Il successo dell'isolamento dei mitocondri dal muscolo scheletrico dell'arto posteriore è stato osservato dalla brusca virata e dalla stabilizzazione di una nuova pendenza dello stato quattro. Un modello simile potrebbe essere osservato per la respirazione mitocondriale complessa guidata da due unità.
Lo scarso funzionamento dei mitocondri ha portato all'accoppiamento dei mitocondri per la complessa respirazione mitocondriale guidata da uno. Tuttavia, un altro tipico esempio di scarso funzionamento dei mitocondri ha mostrato la respirazione mitocondriale del complesso due disaccoppiato con una linea piatta dopo l'aggiunta di ADP e nessun giro per produrre i dati dello stato quattro. I valori numerici dello stato tre, dello stato quattro e del rapporto di controllo respiratorio, o RCR, sia per il complesso uno che per il complesso due sono stati determinati dai dati di misurazione della respirazione Durante la raccolta, ulteriori tessuti possono essere congelati per poterli utilizzare in futuro per misurare la densità mitocondriale o il danno ossidativo.
Inoltre, dopo la procedura, i mitocondri isolati possono anche essere congelati per misurare le attività del trasporto di elettroni e dei complessi di catene. La capacità di isolare e misurare la respirazione mitocondriale sul campo aprirà la strada per migliorare la nostra comprensione del ruolo dei mitocondri nell'evoluzione della vita complessa.
