Questo protocollo facile da eseguire valuta l'efficacia antibatterica di diverse combinazioni di batteriofagi, noti anche come cocktail di fagi, in condizioni variabili in un ambiente ad alto rendimento. I principali vantaggi della tecnica sono la capacità di trasmettere diversi biotici e fattori abiotici, come la temperatura, che possono influenzare l'efficacia dei fagi in una serie di condizioni ambientali. Questo metodo può facilitare la progettazione di cocktail di fagi appropriati per migliorare il biocontrollo e gli esiti terapeutici e determinare l'interazione tra ospiti batterici e batteriofagi.
Per cominciare, impostare il test della micropiastra utilizzando punte filtrate per evitare la contaminazione incrociata. In primo luogo, aggiungere 180 microlitri di mTSB nei pozzetti delle colonne da uno a 12 della micropiastra a 96 pozzetti, quindi preparare diluizioni seriali dieci volte di ciascun fago in colonne da uno a otto delle micropiastre sterili a 96 pozzetti per impostare il test. Aggiungere 20 microlitri di singoli fagi o cocktail di fagi ai pozzetti da uno a otto della fila superiore A della micropiastra.
Per un controllo senza fagi e in bianco, aggiungere 20 microlitri di mTSB al pozzetto superiore delle colonne da nove a 12. Durante il pipettaggio, mescolare il contenuto del pozzo con un'aspirazione delicata e ripetuta almeno cinque volte e cambiando le punte tra le diluizioni. Rimuovere 20 microlitri dall'ultima fila H, quindi creare un serbatoio per il ceppo batterico testato trasferendo da due a tre millilitri della coltura diluita nel serbatoio utilizzando una pipetta da un millilitro.
Utilizzando una pipetta multicanale, aggiungere 20 microlitri della coltura batterica diluita a ciascun pozzetto in colonne da uno a 10 mentre si cambiano le punte tra ogni aggiunta. Coprire e incubare la micropiastra a 37 gradi Celsius. A intervalli di due ore, rimuovere la micropiastra dall'incubatore e leggere la piastra utilizzando un lettore di micropiastre.
In alternativa, incubare la piastra in un lettore di micropiastre e leggerla nel tempo. Per esaminare la densità ottica a 600 nanometri utilizzando un lettore di micropiastre, aprire il programma su un lettore di micropiastre. Selezionare la modalità semplice nella finestra delle opzioni di avvio, quindi selezionare Crea un nuovo protocollo in Task Manager.
Dalla finestra Seleziona tipo di piastra, scegliete Piastra a 96 pozzetti dall'elenco a discesa. Come metodo di rilevamento, selezionare Assorbanza per il tipo di lettura, selezionare l'opzione Endpoint/Cinetica per il tipo di ottica, selezionare Monocromatori e quindi fare clic su OK. Per Read Step, immettere 600 nanometri per le lunghezze d'onda, selezionare Normale per la velocità di lettura e fare clic su OK.To impostare la temperatura per il test, fare clic sulla casella di controllo Incuba e selezionare Incubator On.Immettere la temperatura desiderata nella casella temperatura e quindi fare clic su OK. Fare clic sulla casella di controllo Preriscaldamento prima di continuare con il passaggio successivo per la temperatura di incubazione di 37 gradi Celsius, sebbene l'opzione non sia richiesta per le condizioni di prova a 22 gradi Celsius. Per evitare la condensa sul coperchio della piastra durante l'incubazione, impostare il gradiente di temperatura immettendo un valore nella casella della sfumatura e quindi fare clic su OK. Quindi, fare clic sulla casella di controllo Cinetica per aprire l'impostazione cinetica.
Impostare il tempo di esecuzione per 10 ore per l'incubazione a 37 gradi Celsius o 22 ore per la temperatura ambiente e immettere due ore come intervallo di lettura, quindi fare clic su OK. Fare clic sulla casella di controllo Agita nella finestra della procedura per impostare la condizione di scuotimento, se necessario per ogni lettura cinetica. Selezionare Lineare come modalità Shake e modificare la durata su 30 secondi. Impostare il valore frequenza lineare su 731 cicli al minuto, quindi fare clic su OK.In finestra di dialogo Riepilogo protocollo, fare clic su Layout piastra, selezionare Spazi vuoti, Controlli analisi e Campioni e fare clic su Avanti.
Dopo aver definito le impostazioni per ogni tipo di pozzo, fare clic su Fine. Selezionare un ID pozzo nell'interfaccia a sinistra, assegnarlo alla matrice mostrata nella finestra Layout piastra, quindi fare clic su OK. Fare clic sul pulsante Leggi piastra, salvare il protocollo come file prt e fare clic su Salva. Inserire la piastra e fare clic su OK. Una volta completato l'esperimento, salva l'esperimento come file xpt e fai clic su Salva.
Esportare i dati in Excel facendo clic sul pulsante Sì nella finestra del messaggio per ulteriori analisi. Fare clic sulla selezione Salva Sì/No e sulla casella di controllo Non chiedere più per salvare la preferenza. Seguendo il protocollo, è stato eseguito un confronto dell'efficacia dei fagi con varie combinazioni di fagi, temperature, tempi e molteplicità di infezioni, o MOI.
Sulla base di questa analisi, l'efficacia dei fagi anti-O157 è stata massimizzata dopo 14, 16 o 18 ore di incubazione a 22 gradi Celsius. Per comprendere la cinetica di uccisione dei fagi dei batteri, i valori OD a 600 nanometri sono stati tracciati rispetto al tempo di campionamento, ai MOS e al trattamento dei fagi. Vengono mostrate le curve di crescita batterica rappresentative a 37 gradi Celsius trattati.
T4 ha completamente inibito la crescita batterica ad ogni momento di campionamento anche a basso MOI. Per analizzare la crescita batterica inibita dai fagi, i valori medi di OD di tutti i MOI sono stati tracciati rispetto a ciascun tempo di campionamento e trattamento dei fagi. I grafici rappresentativi a due temperature hanno rivelato che l'efficacia di uccisione dei fagi, ad esempio, per T1 più T4 è stata migliorata a 22 gradi Celsius rispetto a 37 gradi Celsius.
Viene mostrato il confronto dell'efficacia complessiva dei fagi, il che facilita l'identificazione del miglior trattamento di fase. Ad esempio, per il ceppo di Escherichia coli 3081, il trattamento con fagi T4 e T5 più T4 è stato il trattamento più efficace a 37 gradi Celsius. Tuttavia, a 22 gradi Celsius, oltre a T4, il fago T1 più T4, T1 più T4 più rV5 e quattro cocktail di fagi erano efficaci.
Quando si esegue questa procedura, un pipettaggio estremamente accurato, in particolare quando si utilizza una pipetta multicanale e l'uniformità di approccio sono essenziali per ottenere risultati comparabili e interpretabili. Sono necessari esperimenti di follow-up per valutare le ulteriori prestazioni del cocktail più influente nello screening, prevenendo l'emergere di mutanti antifagici in un ampio sistema di coltura del brodo e in altre matrici biologiche.
