Per osservare la squisita ultra struttura naturale delle cellule, è necessario fissare le cellule con un rapido congelamento. Il congelamento a sandwich è uno dei metodi migliori per congelare le cellule senza formare cristalli di ghiaccio. Questo protocollo dimostra l'uso del dispositivo di congelamento a sandwich e descrive anche la procedura per realizzare sezioni ultra sottili di campioni sostituiti dal congelamento dopo il congelamento del sandwich.
Iniziare a preparare propano liquido riempiendo il contenitore di azoto liquido del dispositivo di congelamento sandwich o SFD con azoto liquido. Riempire il contenitore di propano liquido con propano liquido introducendo gas propano usando un ugello fine. Accelerare la solidificazione del propano utilizzando una barra metallica raffreddata.
Per preparare i dischi di rame di tipo piatto e a cestello, posizionarli su un vetrino con il lato senza lettera verso l'alto e trattare con scarico a bagliore a 10 pascal, 400 volt, un milliampere per 30 secondi per rendere la superficie del disco idrofila utilizzando un apparecchio di spotter ionico. Trasferire la sospensione cellulare in un tubo centrifugo da due millilitri e centrifugare a 2.900 volte G per 10 secondi a temperatura ambiente. Rimuovere il surnatante e sospendere il pellet per ottenere una sospensione spessa.
Posizionare una piccola quantità o circa 0,02 microlitri della sospensione cellulare su un disco di rame. Coprilo con un altro disco di rame e raccogli i dischi con una pinzetta. Fai un pozzo al centro del propano solido con la sottile barra di metallo.
Impostare le pinzette in una SFD e congelarle rapidamente premendo il pulsante di iniezione dell'apparecchio. Immergere le pinzette usate in acqua a temperatura ambiente per riscaldarle e congelare i seguenti campioni. Utilizzare tessuti animali e umani fissati in glutaraldeide al 2,5%, tampone fosfato molare 0,1 a pH 7,4.
Affettali in sezioni spesse da 0,1 a 0,2 millimetri con una lama di rasoio sotto uno stereomicroscopio. Posizionare una piccola goccia della soluzione di glutaraldeide sul disco di rame tipo cestello, quindi utilizzare una pinzetta per posizionare un pezzo di tessuto nella glutaraldeide sul disco di rame e coprirlo con il disco di rame piatto. Congelare rapidamente i dischi con i tessuti nel propano fondente della SFD come dimostrato in precedenza.
Trasferire i dischi in azoto liquido in un bagno di lavoro. Utilizzando un paio di pinzette raffreddate in azoto liquido, staccare i dischi l'uno dall'altro per esporre il campione. Posizionare i dischi con le cellule in un flaconcino di vetro riempito con un millilitro di acetone contenente il 2% di tetrossido di osmio che è stato posto in azoto liquido e solidificato.
Trasferire i dischi in un congelatore e tenerli a meno 80 gradi Celsius per due o quattro giorni per la sostituzione del congelamento delle cellule. Portare gradualmente i campioni a temperatura ambiente incubandoli per due ore a meno 20 gradi Celsius, due ore a quattro gradi Celsius e 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire i dischi in due tubi di plastica millilitri riempiti con un millilitro di acetone.
Preparare la resina epossidica mescolando i reagenti in un contenitore di plastica monouso utilizzando un agitatore. Sostituire l'acetone successivamente con il 30% di resina in acetone, il 60% di resina e il 90% di resina a temperatura ambiente per un'ora ciascuno, quindi sostituire la resina al 90% con la resina al 100% a 37 gradi Celsius durante la notte. Infine, incorporare i campioni in resina al 100% nello stampo di incorporamento del silicio e polimerizzarli a 60 gradi Celsius per 24 ore.
Estrarre i blocchi polimerizzati dagli stampi di incorporamento del silicio e scrivere il numero del campione sul blocco. Rimuovere i dischi di rame dal blocco con una lama di rasoio e tagliare i campioni incorporati sulla superficie del blocco utilizzando una lama di taglio ad ultrasuoni e lame di rasoio sotto uno stereomicroscopio. Quindi, applicare del nastro adesivo sul mandrino del blocco del campione e sul supporto del campione del microtomo e tagliare il nastro al contorno.
Rimuovere il blocco dall'ultra microtomo, impostarlo in uno stereomicroscopio e tagliarlo ulteriormente a 0,2 millimetri per 0,3 millimetri usando una lama di rasoio. Applicare il neoprene sulle griglie per renderle adesive. Riposizionare il blocco sull'ultra microtomo allineando le parti nastrate.
Coprire l'ultra microtomo con un coperchio di plastica e tagliare sezioni spesse da 50 a 70 nanometri. Recuperate le sezioni utilizzando un ciclo continuo. Montarli su griglie di rame a 300 o 400 maglie trattate con neoprene e asciugarle.
Impostare le griglie con sezioni nella scanalatura del mezzo tubo di silicone. Immergere i campioni in soluzione di acetato di uranile per tre minuti. Raccogliere la soluzione di uranile utilizzata e conservarla in una siringa.
Lavare i campioni in un mezzo tubo con un getto d'acqua, quindi immergere i campioni in citrato di piombo per tre minuti. Per i campioni di lieviti e funghi, posizionare le griglie su una carta da filtro, raccoglierle con una pinzetta e coprirle con un film di naftalene polimerizzato al plasma sulla superficie dell'acqua. Inserire le griglie nel portacampioni di un microscopio elettronico, quindi inserire il supporto del campione nel microscopio elettronico e osservare a 100 kilovolt.
Sezioni ultra sottili di E.coli e S.cerevisiae quando osservate al microscopio elettronico hanno mostrato morfologia naturale e immagini chiare. Sezioni ultra sottili di cellule coltivate rapidamente congelate usando SFD sono state osservate al microscopio elettronico. Le immagini di sezioni ultra sottili di pelle umana erano molto chiare e mostravano una morfologia naturale.
Le particelle del nucleo del virus dell'epatite B sono state rapidamente congelate con SFD e osservate mediante criolettronica. La cosa più importante da ricordare è che è necessario applicare una quantità molto piccola di cellule sui dischi di rame in modo che la formazione di cristalli di ghiaccio sia impedita al momento del congelamento. Fissando in anticipo i tessuti animali con glutaraldeide, si ottiene un buon congelamento a una profondità di circa 200 micrometri simile alla profondità raggiunta dal congelamento ad alta pressione.
Questa tecnica apre la strada a un ricercatore per osservare facilmente la squisita ultra struttura naturale delle cellule a basso costo.
