Stentor coeruleus è stato a lungo impiegato come organismo modello per comprendere la rigenerazione unicellulare. Mentre la linea temporale per la rigenerazione morfologica visiva è nota, la linea temporale per la rigenerazione funzionale rimane sconosciuta. Questo test traccia la motilità della popolazione centrale sottoposta a rigenerazione sincronizzata in modo tale da poter quantificare il recupero della funzione di perdita.
Può essere adattato per l'uso con altri tipi di cellule. La mancanza di una tenuta sicura della camera di imaging comporterà la fuoriuscita di pozzi l'uno nell'altro o la formazione di bolle d'aria all'interno dei pozzi. Per i ricercatori che non hanno familiarità con l'uso di distanziatori in silicone, raccomandiamo vivamente che PSW o altro mezzo pulito sia pipettato in ciascuno dei pozzetti per testare le perdite prima dell'uso.
La costruzione delle camere campione è più facile da mostrare che descritta verbalmente. Così come il processo per estrarre i modelli di motilità dai dati video acquisiti. Per iniziare, tagliare un pezzo di foglio distanziatore in silicone di 250 micrometri di spessore leggermente più piccolo sia in altezza che in larghezza rispetto a un vetrino per microscopio.
Usa un pugno intero per creare pozzi circolari lasciando spazio sufficiente tra i pozzi vicini per garantire una buona tenuta. Iniziare la rigenerazione dell'apparato orale incubando le cellule dello stentor coeruleus nel 10% di saccarosio o nel 2% di uria per due minuti. Quindi lavare tre volte con mezzo fresco.
Pipettare delicatamente circa 10 stentor in ciascun pozzetto. Avendo cura di abbinare il volume del campione al volume del pozzo il più vicino possibile. Chiudere i pozzetti abbassando delicatamente un pezzo di vetro di copertura sui pozzetti partendo da un bordo.
Utilizzare un oggetto stretto e leggermente flessibile, come una punta della pipetta da 10 microlitri per premere verso il basso sul vetro di copertura dove contatta il foglio di silicone per garantire una buona tenuta. Posizionare il campione sul palco del microscopio e impostare il microscopio sul più basso ingrandimento disponibile in modo che uno si adatti bene alla cornice. Inizia il time lapse e acquisisci un video di dieci secondi a 30 fotogrammi al secondo di ogni pozzo in ogni punto temporale.
Per calibrare, acquisisci un'immagine chiara di una diapositiva di calibrazione o di un righello chiaro con le stesse impostazioni di ingrandimento dei video. Utilizzando qualsiasi programma di visualizzazione delle immagini, contare il numero di pixel tra i segni di una distanza fisica nota. Scarica i due script, traccia le celle e pulisci le tracce in una posizione facile da ricordare sul computer e trasferisci anche i video dei dati su questo computer.
Organizza i video dei dati in cartelle. Uno per ogni punto temporale. Utilizzare le celle di traccia dello script per eseguire il rilevamento automatico delle celle nei video dei dati aprendo le celle di traccia ed eseguendo lo script Scegli aggiungi al percorso"se richiesto da una finestra popup che in genere si verifica solo quando lo script viene eseguito per la prima volta da una determinata cartella.
Quando richiesto, seleziona uno o più video di dati per avviare il monitoraggio. Passare ai video dei dati e una volta soddisfatti dell'elenco dei file fare clic su apri"Per rifiutare manualmente tracce anomale o false, aprire le tracce pulite nella finestra dell'editor MATLAB facendo doppio clic sul file. Al prompt selezionare l'output della cartella dati in base alle celle di traccia.
Passare a una delle cartelle create e selezionarla. Quando richiesto, immettere uno per mantenere la traccia e zero per rifiutare la traccia. Quindi premere INVIO per passare alla traccia successiva.
Inizia scaricando lo script intitolato spaghetti plots. Aprire ed eseguire lo script. Quando viene visualizzata la finestra del browser dei file con il prompt, selezionare la cartella da aprire.
Passare alla cartella di uno dei punti temporali. Quando viene richiesto, calibrazione, qual è il numero di pixel per millimetro? Digitare il valore di calibrazione e premere invio.
Regolate gli assi del plottaggio in base alle esigenze modificando la riga 55 dello script, che per impostazione predefinita è impostata su RR uguale a quattro. per includere un raggio fino a quattro millimetri. Salva la trama.
I risultati mostrano la motilità collettiva della popolazione di cellule stentor a due, tre, sette e otto ore nel processo di rigenerazione dell'apparato orale. Questi grafici mostrano sia l'aumento previsto del numero di individui mobili sia l'aumento quadruplicato della gamma delle cellule più mobili all'interno della popolazione. Le cellule di nuoto più veloci, se avviate vicino al bordo, sono limitate dal nuoto interamente in linea retta e la loro gamma di movimento appare più piccola.
Le cellule del tratto sono state classificate in tre categorie distinte, non mobili senza tenuta visibile, non mobili con tenuta visibile e mobili. Il risultato ha mostrato un istogramma impilato che riassume i conteggi cellulari relativi in queste categorie in funzione della nostra rigenerazione. In tempi successivi, un numero significativo di cellule sono state trovate in colonie con fermi visibili suggerendo fortemente che avevano esplorato l'ambiente e preferenzialmente attaccato vicino ad altri del loro genere.
È importante selezionare le dimensioni del pozzo del campione che funzionano bene per lo stentor coeruleus che hanno una dimensione di circa un millimetro. Ciò include lo spessore del distanziatore in silicone di 5/16 pollici di diametro e 10 celle per pozzetto. Questi numeri dovrebbero essere regolati quando si adatta questo protocollo ad altri tipi di cellule.
Questo test può essere eseguito in combinazione con RNA-I per studiare e confrontare la rigenerazione di diversi fenotipi di stentor.
