Questo protocollo fornisce un metodo da banco per valutare l'efficacia e i meccanismi d'azione della terapia trombolitica assistita da istotripsia o litossitripsia, un approccio alternativo non invasivo per il trattamento della trombosi venosa profonda critica. Questa tecnica utilizza l'attività della bolla per avere un effetto bidirezionale attraverso un aumento della fibrinolisi a causa di una maggiore consegna litica e dell'emolisi dei globuli rossi all'interno del coagulo. Questo approccio da banco al trattamento della trombosi venosa profonda facilita la modellazione dei coaguli di sangue, il trattamento con lysotripsy e l'imaging simultaneo durante il trattamento.
La generazione di nuvole di bolle, la pianificazione del trattamento e la guida alle immagini possono essere ulteriormente utilizzate per studiare trattamenti in vitro basati sull'istotripsia di altre malattie, come i tumori renali ed epatici. Per impostare la sorgente di istotripsia, montare la sorgente su un sistema di posizionamento motorizzato. Coprire l'array di imaging con un coperchio della sonda e fissare l'array in modo coassiale nell'apertura della sorgente di istotripsia.
Collegare l'array di imaging a un sistema di scansione ad ultrasuoni e immergere completamente la sorgente di istotripsia e l'array di imaging nel serbatoio. Utilizzare una siringa per rimuovere delicatamente eventuali bolle d'aria e utilizzare l'array di immagini e lo scanner per acquisire immagini di acqua in modalità B degassate a 20 fotogrammi al secondo. Durante l'acquisizione delle immagini, regolare la posizione dell'array di immagini all'interno dell'apertura del trasduttore confocale fino a quando la nuvola di bolle non si trova approssimativamente al centro della finestra dell'immagine e registrare la posizione focale rilevata nella finestra di imaging.
Quindi interrompere l'insonazione e impostare la tensione applicata alla sorgente di istotripsia su zero. Per preparare un coagulo per l'analisi, utilizzare una pinza per tagliare l'estremità sigillata di una pipetta contenente un coagulo e lasciare che il coagulo e il siero scivolino in una capsula di Petri. Utilizzare un bisturi per tagliare il coagulo a una lunghezza di un centimetro e utilizzare una salvietta detergente per asciugare delicatamente la sezione tagliata per rimuovere il liquido in eccesso.
Utilizzare una pinzetta per posizionare con cura la sezione di coagulo su una bilancia e registrare il peso. Quindi, sollevare manualmente il canale di flusso da un serbatoio d'acqua ad osmosi inversa degassato e rimuovere la nave modello dal canale. Utilizzare una pinzetta per posizionare con cura il coagulo nel recipiente modello senza danneggiare il coagulo e collegare il recipiente al canale di flusso.
Abbassare il canale di flusso nel serbatoio in modo tale che l'estremità prossimale dello stadio rispetto al serbatoio sia bassa rispetto al lato distale e utilizzare una pipetta per aggiungere 30 microlitri di plasma riscaldato a 37 gradi Celsius al serbatoio. Monitorare la temperatura del serbatoio dell'acqua fino a raggiungere almeno 36 gradi Celsius e utilizzare una pipetta per aggiungere 80,4 microgrammi di rt-PA nel serbatoio di plasma. Per innescare il canale di flusso, utilizzare una pompa a siringa per aspirare il plasma dal serbatoio nel canale fino a quando il recipiente modello non è stato riempito.
Quindi livellare manualmente il recipiente modello per assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria nel recipiente modello, come si vede all'interno della finestra di imaging. Per pianificare un percorso per la sorgente di istotripsia e l'array di imaging per un'esposizione uniforme all'istotripsia lungo la lunghezza del coagulo, utilizzare lo script di imaging per utilizzare i posizionatori motorizzati per allineare l'array di imaging parallelo alla lunghezza del coagulo e confermare che non sono presenti bolle d'aria nel vaso. Utilizzare i posizionatori motorizzati per allineare l'array di immagini in modo tale che il piano di imaging sia parallelo alla sezione trasversale del coagulo.
Usando la finestra di imaging come guida, spostare la sorgente di istotripsia all'estremità prossimale del coagulo, rispetto al serbatoio. Per determinare il percorso di insonazione lungo la lunghezza del coagulo, impostare i waypoint lungo la lunghezza del coagulo con incrementi di cinque millimetri. Prima di finalizzare ogni waypoint, il fuoco testa gli impulsi dalla sorgente di istotripsia con gli stessi parametri di insonazione dimostrati, ma con l'esposizione complessiva ridotta a 10 impulsi totali.
In ogni waypoint, salvare le posizioni del motore utilizzando i comandi designati dal produttore. Per trattare il coagulo lungo la sua lunghezza secondo il percorso definito nella fase di pre-trattamento, impostare la pompa della siringa a 0,65 millilitri al minuto e attendere che il menisco del plasma si muova. Interpolare il percorso di trattamento con passaggi intermedi tra i waypoint stabiliti con una dimensione del passo fissa e utilizzare i posizionatori per spostare la sorgente di istotripsia in ogni posizione del percorso, utilizzando i parametri di insonazione originariamente impostati.
Quindi, creare uno script per impostare l'array di immagini per acquisire un'immagine in modalità B del coagulo e del vaso modello pochi secondi prima dell'applicazione dell'impulso istotripsia in ogni posizione. Quindi applicare l'impulso istotripsia in ogni waypoint, acquisendo le emissioni acustiche nello script per formare immagini di cavitazione passiva dopo l'analisi. Utilizzare la finestra di imaging per l'immagine dell'attività della bolla durante l'applicazione dell'impulso istotripsia in ogni posizione del percorso.
Dopo l'analisi, sollevare manualmente il recipiente modello dal serbatoio dell'acqua per drenare il perfusato per gravità e utilizzare la pompa della siringa per prelevare la soluzione al plasma dal canale di flusso per consentire la raccolta dell'intero perfusato in un piccolo becher. Scollegare il recipiente modello e rimuovere il coagulo. Quindi pulire il coagulo con tessuti di laboratorio e pesare il coagulo per valutare la perdita di massa del coagulo.
Dopo l'applicazione di una tensione sufficiente alla sorgente di istotripsia, una nuvola di bolle viene generata nella regione focale del trasduttore e visualizzata tramite imaging a ultrasuoni. La posizione focale è definita come il centro della nuvola di bolle. Questo perfusato di controllo di un coagulo esposto al solo plasma e questo perfusato di un coagulo trattato con lisotripsia sono stati utilizzati per valutare il contenuto di emoglobina e D-dimero come dimostrato.
La variabilità nella concentrazione di emoglobina può essere quantificata dall'assorbanza ottica. Qui, un coagulo può essere visualizzato all'interno di un vaso modello tramite l'imaging in modalità B prima dell'esposizione all'istotripsia per determinare la posizione del coagulo per la segmentazione dell'immagine di cavitazione passiva. Come conferma questa immagine di cavitazione passiva co-registrata con l'immagine in modalità B del coagulo, l'energia acustica è contenuta principalmente all'interno del coagulo durante l'esposizione istotripsia.
Nei campioni esposti all'istotripsia, l'interruzione è principalmente limitata al centro del coagulo, in linea con le posizioni osservate dell'attività della bolla tracciate tramite l'imaging della cavitazione passiva. Con l'aggiunta di lytic, la perdita di massa si verifica anche nelle regioni più vicine alla periferia del coagulo. In alternativa, i liposomi ecogenici contenenti rt-PA possono essere utilizzati al posto della somministrazione sistemica di rt-PA per consentire la valutazione della somministrazione mirata di farmaci al coagulo.
La lysotripsy fornisce un approccio alternativo non invasivo al trattamento di molte malattie. Questo protocollo in vitro consente di valutare l'efficacia del trattamento e il suo potenziale successo nell'applicazione in vivo.
