Name: site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli
Uploaded: 2020-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
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Vorremmo ringraziare il Dr. Wesley Wang per aver posto le basi per questo protocollo e il suo prezioso mentoring. Questo lavoro è stato parzialmente supportato da National Institutes of Health (Grants R01GM127575 e R01GM121584) e Welch Foundation (Grant A-1715).

1. Costruzione plasmide
<ol><li>Inizia decidendo quale proteina istonina sarà acetilata e in quale sito di lisina. Mutare il sito nel codone di arresto ambrato (TAG) usando la mutagenesi diretta dal sito. NOTA: Ci sono quattro plasmidi precedentemente progettati utilizzati per l'espressione delle proteine istone. Tutte e quattro le proteine istonate sono state clonate nel vettore pETDuet-1 con un tag di istidina N-terminale. Histone H4 include anche un tag SUMO, l'origine della replicazione colE1 con un numero di copia di circa 40, resistente all'ampicillina e un promotore T7.<ol>
<li>Progettare primer in avanti e inversi che contengono una mutazione TAG nel sito desiderato (sostituendo un codone di lysine esistente con il codone di arresto ambrato) in uno dei quattro plasmidi proteici istoni.</li>
		<li>Utilizzare PCR intero plasmide per amplificare il TAG contenente plasmide. Determinare una temperatura di ricottura appropriata per i primer. In generale, la temperatura di fusione (Tm) dei primer meno 5 °C sarà sufficiente. In caso di difficoltà nell'ottenimento di un prodotto PCR, è possibile utilizzare un gradiente di temperatura intorno a Tm - 5 °C per ottimizzare la temperatura di ricottura per l'amplificazione. NOTA: In questo esperimento è stata utilizzata una PFU polimerasi espressa internamente per 30 cicli con le seguenti condizioni: 94 °C per 30 s (denaturazione), temperatura di ricottura per 30 s e 72 °C per 6 min (o 1 min per kilobase-pairs). Per ulteriori dettagli su questo tipo di metodo PCR, vedere Liu e Naismith7.</li>
		<li>Pulire il prodotto PCR con un kit di pulizia PCR seguendo il protocollo del produttore. Analizzare il prodotto PCR mediante elettroforesi del gel di agarosio e successiva colorazione del bromuro di etidio.</li>
		<li>Legare il plasmide incubando con T4 ligasi durante la notte a 16 °C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prima trasformare il TAG contenente plasmide (AmpR)in Escherichia coli chimicamente competente. Scegli un minimo di 4 colonie dalla trasformazione e purifica il plasmide. Fare le scorte cellulari di ciascuno con glicerolo con metodi standard e conservare a -80 °C. Inviare per il sequenziamento per confermare la mutazione TAG desiderata.</li>
	<li>Una volta confermata la sequenza, co-trasformare il plasmide contenente TAG (AmpR)con pEVOL-AckRS (ChlR) in CobB chimicamente competente (l'unica deacetilasi istonina nota in E. coli.) soppressioni le cellule BL21 utilizzando il metodo dello shock termico. pEVOL è un plasmide con un numero di copia medio a basso numero di copia p15A. NOTA: La serie pEVOL di plasmidi è stata costruita sulla base di studi precedenti che hanno mostrato una maggiore espressione della coppia ortogonale aaRS/tRNATyr è stata efficace nel ridurre il troncamento proteico e nell'aumentare le rese complessive delle proteinemutanti 8. Se le cellule di cancellazione cobb non sono accessibili, procedere con cellule BL21 chimicamente competenti. La cobB è una deacetilasi istonina sirtuina simile a sirtuina e la nicotinammide può essere aggiunta a una concentrazione finale di 5 mM durante l'espressione della proteina istonina per inibire cobB come approccio alternativo9.</li>
	<li>Fare un magazzino cellulare e conservare a -80 °C.</li>
</ol>2. Espressione acetilata della proteina istotone
<ol><li>Preparare 1 L di supporti 2YT autoclavati (o volume di scelta) in un pallone da coltura.</li>
	<li>Inoculare 20 mL di mezzi 2YT contenenti gli antibiotici appropriati con il patrimonio cellulare co-trasformato che ha il plasmide contenente TAG (AmpR) e pEVOL-AckRS (ChlR)e crescere a 37 °C in OD = 0,6 (4-6 h).</li>
	<li>Aggiungere gli antibiotici appropriati all'1 L dei mezzi 2YT autoclavati e inoculare con la coltura iniziale di 20 mL. Crescere a 37 °C fino a OD = 0,6-0,8 (2-3 h).</li>
	<li>Aggiungere agenti induttori e acetillysina (AcK) alle concentrazioni finali di IPTG 1 mM, 0,2% arabinosi e AcK 5 mM.</li>
	<li>Far crescere la cultura a 37 °C per 6-8 ore.</li>
	<li>Celle a pellet a 2.700 x g per 15 min.</li>
	<li>Conservare il pellet di cella a -80 °C durante la notte.</li>
	<li>Da questo passo in poi mantenere il campione sul ghiaccio tutti i tempi. Sciogliere il pellet cellulare in 50 mL di tampone di lisi istonale per 1 L di coltura.</li>
	<li>Sonicare secondo il seguente ciclo: 1 s on, 1 s off, totale in tempo: 3 min al 60% di ampiezza.</li>
	<li>Corpi di inclusione del pellet a 41.600 x g per 45 min.</li>
	<li>Scartare i corpi di inclusione supernatanti e resopensi in 30 mL del tampone di lisi istonale. L'inclusione del pellet promette 41.600 x g per 30 min.</li>
	<li>Scartare i corpi di inclusione supernatanti e resuspend in 30 mL di tampone di lavaggio pellet. Corpi di inclusione del pellet a 41.600 x g per 30 min.</li>
	<li>Scartare i corpi supernatanti e sciogliere i corpi di inclusione in 25 mL di tampone di cloridrato di guanidina (GuHCl) da 6 M. Incubare con agitazione a 37 °C per 1 h. NOTA: Se necessario, i corpi di inclusione possono essere incubati con agitazione durante la notte a 4 °C.</li>
	<li>L'inclusione del pellet promette 41.600 x g per 45 min. Incubare il supernatante con 1 mL di resina Ni-NTA equilibrata con tampone GuHCl da 6 M per 2 h.</li>
	<li>Procedere con la purificazione Ni-NTA in condizioni denaturate. Lavare la colonna con 3 volumi di colonne di buffer di lavaggio delle colonne. Proteina istolata acetilata elute con 10 mL di tampone di eluizione. NOTA: Tentare di concentrare la proteina qui è un'opzione, ma gli istoni acetilati sono molto imprevedibili e possono facilmente precipitare. Non è consigliabile concentrarsi oltre i 2 mL in volume totale.</li>
	<li>Dializzare estensivamente la proteina acetilata dell'istono contro il 5% di tampone di acido acetico per rimuovere i sali. Dializzare per 3 ore alla volta a 4 °C, scambiando con tampone fresco un minimo di 6 volte. NOTA: Per una migliore purezza delle proteine, c'è un'opzione per dializzare contro l'acqua pura. Tuttavia, ciò causa precipitazioni significative e riduzione della resa che può essere indesiderabile per le proteine acetilate istono a basso rendimento.</li>
	<li>Aliquota e licofilia proteine, e conservare a tempo indeterminato a -80 °C. Le proteine istono di tipo selvatico producono generalmente 10-50 mg/L, mentre le proteine acetilate dell'istone producono meno di 10 mg/L a seconda del sito specifico di lisina. Ad esempio, H3K79Ac ha una media di 5 mg/L.</li>
</ol>3. Espressione di proteine istono di tipo selvatico
<ol><li>Per assemblare nucleosomi completi, esprimere tutte e 4 le proteine istono. Quando si esprimono e purificano gli istoni di tipo jolly, il protocollo è lo stesso degli istoni acetilati tranne quanto segue:<ol>
<li>Non eseguire la co-trasformazione. Non utilizzare pEVOL-AcKRS per l'espressione istono di tipo jolly. Regolare gli antibiotici di conseguenza.</li>
		<li>Non utilizzare una linea cellulare di cancellazione CobB o aggiungere Nicotinammide, AcK o arabinosi durante l'induzione dell'espressione cellulare.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Preparazione del DNA 601
NOTA: Una sequenza di DNA ottimizzata precedentemente progettata per dirigere il posizionamento nucleosoma è assemblata con ottameri istoni per produrre mononucleosoma ad alta efficienza. Questa sequenza è indicata come DNA 601 o sequenza di Widom. Questa sequenza è diventata la sequenza standard del DNA per gli studi in vitro sui nucleosomi, dai test di rimodellamento della cromatina alle misurazioni a singola molecola10.
<ol><li>Per preparare quantità significative di 601 DNA per l'assemblaggio nucleosoma, trasforma pGEM-3z/601 in Top 10 cellule e coltiva 10 mL di coltura per l'amplificazione e l'estrazione plasmide. Utilizzare un kit di estrazione plasmide e seguire la raccomandazione del produttore.</li>
	<li>Utilizzare una PFU polimerasi espressa internamente (più efficiente) per questo protocollo di amplificazione. Impostare una reazione PCR: per una reazione di 250 μL, utilizzare 207,5 μL autoclavato MQ H2O, 25 μL 10x PFU Buffer, 5 μL Forward Primer: ctggagaatcccggtgccg, 5 μL Reverse Primer: acaggatgtatatatctgacacg, 5 μL dNTP mix, 2.5 μL PFU enzima. In genere eseguiamo 60 reazioni contemporaneamente per ottenere abbastanza DNA da assemblare.</li>
	<li>Utilizzare una temperatura di ricottura di 52 °C per 30 s e un tempo di estensione di 30 s se si utilizza la polimerasi PFU. Altrimenti seguire le condizioni consigliate dai produttori.</li>
	<li>Una volta effettuata la PCR, utilizzare un kit di pulizia PCR preferito per purificare il prodotto PCR.</li>
</ol>5. Assemblaggio dell'ottagono istone
<ol><li>Sciogliere le aliquote delle pellet di proteine istone H2A, H2B, H3 e H4 in modo che vi sia uno stock separato di ciascuna proteina istonica nel Tampone GuHCl con un volume totale di 100 μL.</li>
	<li>Calcolare la concentrazione di ogni proteina istona misurandol'assorbanza A 280.</li>
	<li>Se l'assorbanza è maggiore di 1 per qualsiasi proteina, diluire con il tampone GuHCl per ottenere una concentrazione più accurata.</li>
	<li>Unire le proteine H2A e H2B in un rapporto molare 1:1 e diluire a una concentrazione proteica totale di 4 μg/μL. Ripetere per H3 e H4.</li>
	<li>Dializzare in sequenza a 4 °C rispetto a 2 M TE buffer overnight, 1 M TE buffer per 2 h e 0,5 M TE buffer per 5 h. NOTA: Il secondo e il terzo passo della dialisi causano il precipitare delle conformazioni instabili delle proteine. Si prevede che vedrà forti precipitazioni in questi passaggi.</li>
	<li>Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione a 16.800 x g a 4 °C.</li>
	<li>Anche in questo caso, calcolare la concentrazione di dimeri istono (miscela H2A/H2B) e tetrameri (miscela H3/H4) che misuranol'assorbanza A 280.</li>
	<li>Mescolare dimeri e tetrameri in un rapporto molare 1:1 e regolare NaCl a 2 M con l'aggiunta di NaCl solido.</li>
	<li>L'ottagono istono può essere conservato a 4 °C ed è più stabile dei dimeri e dei tetrameri. Non congelare mai l'ottagono istone in quanto ciò può causare lo smontaggio.</li>
	<li>Se si assembla con istoni acetilati, è sufficiente sostituire la proteina di tipo selvatico con la proteina acetilata nella procedura.</li>
</ol>6. Assemblaggio nucleosoma
<ol><li>Usa un buffer TE 100x e un NaCl solido per regolare il BUFFER da 601 DNA a 2M TE. Aggiungere il DNA 601 in tampone TE 2M all'ottamero istono in un rapporto molare da 0,85:1 a 0,90:1. Un rapporto inferiore di DNA può essere aggiunto se il DNA libero è presente nell'analisi dello spostamento del gel.</li>
	<li>Trasferire la miscela DNA-istone in un sacchetto di dialisi e mettere in circa 200 mL di tampone 2M TE (o più se si assemblano più campioni) e mescolare molto delicatamente a 4 °C.</li>
	<li>Impostare una pompa peristaltica da spurgo per gocciolare lentamente in nessun tampone TE sale. Quando il volume è approssimativamente raddoppiato, versare metà del volume. Fallo almeno 4 volte in totale. Con una pompa questo può richiedere 4-8 ore a seconda del volume iniziale. I nucleosomi si formano quando la concentrazione di sale è ridotta a 150 mM (misurata dal misuratore di salinità).</li>
	<li>Dopo che la concentrazione di sale è stata ridotta a 150 mM, dializzare contro un tampone TE da 20 mM durante la notte.</li>
	<li>Rimuovere i precipitati mediante centrifugazione e misurare la concentrazione dei nucleosomi mediante lettura A260 utilizzando un lettore di piastre.</li>
	<li>Aggiungere la proteasi His-TEV (TEV: nucleosoma 1:30, w:w ) e incubare durante la notte a 4 °C per rimuovere tutti i tag di istidina. Rimuovere le impurità dell'etichetta istidina dalla soluzione nucleosoma con la resina Ni-NTA tirare verso il basso.</li>
	<li>Per posizionare il nucleosoma e omogeneizzare il campione, incubare a 60 °C per 1 h. NOTA: Per i siti acetilati particolarmente instabili, questo passaggio potrebbe non essere consigliabile.</li>
	<li>Conservare i nucleosomi a breve termine (alcune settimane) a 4 °C.</li>
	<li>Per la conservazione a lungo termine, dializzare i nucleosomi contro il buffer di stoccaggio e conservare a -80 °C.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Srinivasan, G., James, C. M., Krzycki, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrrolysine+encoded+by+UAG+in+Archaea:+Charging+of+a+UAG-Decoding+specialized+tRNA.">Pyrrolysine encoded by UAG in Archaea: Charging of a UAG-Decoding specialized tRNA.</a> Science. 296 (5572), 1459-1462 (2002).</li><li>Wan, W., Tharp, J. M., Liu, W. 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T., Widom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+DNA+sequence+rules+for+high+affinity+binding+to+histone+octamer+and+sequence-directed+nucleosome+positioning.">New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning.</a> Journal of Molecular Biology. 276 (1), 19-42 (1998).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+tight+nuclear+tethering+and+inactivation+of+cGAS.">The molecular basis of tight nuclear tethering and inactivation of cGAS.</a> Nature. 587 (7835), 673-677 (2020).</li><li>Burdette, D. L., Vance, R. 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N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Innate+immune+DNA+sensing+pathways:+STING,+AIMII+and+the+regulation+of+interferon+production+and+inflammatory+responses.">Innate immune DNA sensing pathways: STING, AIMII and the regulation of interferon production and inflammatory responses.</a> Current Opinion in Immunology. 23 (1), 10-20 (2011).</li><li>Ablasser, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=cGAS+produces+a+2'-5'-linked+cyclic+dinucleotide+second+messenger+that+activates+STING.">cGAS produces a 2'-5'-linked cyclic dinucleotide second messenger that activates STING.</a> Nature. 498 (7454), 380-384 (2013).</li><li>Gao, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclic+[G(2',5')pA(3',5')p]+is+the+metazoan+second+messenger+produced+by+DNA-activated+cyclic+GMP-AMP+synthase.">Cyclic [G(2',5')pA(3',5')p] is the metazoan second messenger produced by DNA-activated cyclic GMP-AMP synthase.</a> Cell. 153 (5), 1094-1107 (2013).</li><li>Zhao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+PLPLRT/SD+motif+of+STING+mediates+the+recruitment+and+activation+of+TBK1.">A conserved PLPLRT/SD motif of STING mediates the recruitment and activation of TBK1.</a> Nature. 569 (7758), 718-722 (2019).</li></ol>

Nessuno degli autori può dichiarare interessi finanziari concorrenti.

È essenziale seguire questo protocollo in ogni dettaglio durante un esperimento. I nucleosomi non sono molto stabili e molti tentativi ed errori sono andati a determinare questo protocollo. È fondamentale rimuovere i precipitati ad ogni fase (o quando osservato) perché il particolato può facilmente interferire con i processi di assemblaggio. Tieni sempre i campioni di istone sul ghiaccio. Se i nucleosomi vengono conservati a 4 °C per troppo tempo, possono smontare spontaneamente. Assicurarsi di controllare eventuali...

Abbiamo utilizzato PylRS e tRNAPyl per sintetizzare e assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. PylRS si è dimostrato prezioso come strumento di espansione del codice genetico per produrre proteine con modifiche post traslazionali (PTM) ed è stato geneticamente evoluto per incorporare circa 200 diverse bcAA. PylRS incorpora ad un codone di arresto ambrato, rimuovendo la concorrenza da altri amminoacidi durante la traduzione. Il PylRS è stato scoperto per la prima volta in archea metanogenica, e da allora è stato utilizzato in biologia chimica per incorporare nuovi gruppi chimici reattivi nelle proteine1,2.
MmAcKRS1 è stato evoluto da Methanosarcina mazei PylRS e frequentemente utilizzato nel nostro laboratorio per la sintesi di proteine acetilate3,4,5,6. MmAcKRS1 consegna AcK in un sito di mutazione ambrata nell'mRNA preferito durante la traduzione in Escherichia coli. Questa tecnica è stata precedentemente utilizzata per incorporare siti di lisina H3 di AcK, K9, K14, K18, K23, K27, K36, K56, K64 e K79 istono H3 per studiare l'attività di Sirtuin 1, 2, 6 e 7 sui mononucleosomi acetilati4,5,6. Qui dettagliamo questo metodo per esprimere istoni acetilati e nucleosomi acetilati ricostituiti.

<table><tbody><tr><td>0.5 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>0.5 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>1 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>1 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>100x TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>2 M TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>2 M NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>20 mM TE Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7.8</td></tr><tr><td>6 M GuHCl</td><td></td><td></td><td>6M guanidinium chloride, 20 mM Tris, 500 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>Acetyllysine</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Column Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM imidazole pH 7.8</td></tr><tr><td>Elution Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&amp;nbsp;Variable-Flow Chemical Transfer Pump</td><td>Fischer Scientific</td><td>15-077-67</td><td></td></tr><tr><td>His-TEV protease</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Histone Lysis Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, 0.5% Triton-X100 (v/v), 1 mM PMSF pH 8.0</td></tr><tr><td>Ni-NTA Resin</td><td></td><td></td><td>6 M urea, 500 mM NaCl, 20 mM Tris, 250 mM imidazole, pH 7.8</td></tr><tr><td>PCR Clean-Up Kit</td><td>Epoch Life Sicences</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Pellet Wash Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>60 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0</td></tr><tr><td>petDUET-His-SUMO-TEV-H4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H2B</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>petDUET-His-TEV-H3</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pEVOL-AckRS</td><td>Addgene</td><td>137976</td><td></td></tr><tr><td>pGEM-3z/601</td><td>Addgene</td><td>26656</td><td></td></tr><tr><td>Storage Buffer</td><td>NA</td><td>NA</td><td>20 mM NaCl, 20 mM Tris, 20 mM NaCl, 1 mM EDTA, 20% glycerol, pH 7.8</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

site specific lysine acetylation of histones for nucleosome reconstitution using genetic code expansion in escherichia coli

Le proteine istono acetilate possono essere facilmente espresse in Escherichia coli che codifica per un mutante, Nε-acetil-lisina (AcK) specifico Methanosarcina mazi pyrrolysine tRNA-sintetasi (MmAcKRS1) e il suo tRNA imparentato (tRNAPyl)per assemblare mononucleosomi ricostituiti con istoni acetilati specifici del sito. MmAcKRS1 e tRNAPyl forniscono AcK in un sito di mutazione ambrata nell'mRNA preferito durante la traduzione in Escherichia coli. Questa tecnica è stata ampiamente utilizzata per incorporare AcK nei siti di llysina H3. La pirrolisil-tRNA sintetasi (PylRS) può anche essere facilmente evoluta per incorporare altri amminoacidi non canonici (bcAA) per la modifica o la funzionalizzazione delle proteine specifiche del sito. Qui dettagliamo un metodo per incorporare AcK usando il sistema MmAcKRS1 nell'istono H3 e integriamo proteine H3 acetilate in mononucleosomi ricostituiti. I mononucleosomi ricostituiti acetilati possono essere utilizzati in saggi biochimici e leganti, determinazione della struttura e altro ancora. Ottenere mononucleosomi modificati è fondamentale per progettare esperimenti relativi alla scoperta di nuove interazioni e alla comprensione dell'epigenetica.

Dimeri, tetrameri e ottameri possono essere valutati eseguendo un gel SDS PAGE del 12% (Figura 1 e Figura 2). Qui potete vedere che alcuni dei tetrameri acetilati hanno una resa inferiore rispetto ad altri (Figura 1). Infatti, più vicino alla regione centrale, minore è la resa osservata. Ciò è molto probabilmente dovuto all'acetilazione che interferisce con l'assemblaggio del tetramero più ci si...

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Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Qui presentiamo un metodo per esprimere proteine istono acetilate usando l'espansione del codice genetico e assemblare nucleosomi ricostituiti in vitro.

Acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando l'espansione del codice genetico in Escherichia coli

Acetylated histone proteins can be easily expressed in Escherichia coli encoding a mutant, N&#949;-acetyl-lysine (AcK)-specific Methanosarcina mazi ...

site-specific-lysine-acetylation-histones-for-nucleosome

Universidad de Cartagena UDEC

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Biochemistry

Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Unit 1

Structure and Organization of DNA

SCIENTISTS IN ACTION

3.9K Views.  Texas A&M University. Qui presentiamo un metodo per esprimere proteine istono acetilate usando l'espansione del codice genetico e assemblare nucleosomi ricostituiti in vitro.

Video: Site Specific Lysine Acetylation of Histones for Nucleosome Reconstitution using Genetic Code Expansion in Escherichia coli

Reconstitution of Nucleosomes with Differentially Isotope-labeled Sister Histones

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications (PTMs). They are newly identified species with unknown means of establishment and functional implications. Current analytical methods are inadequate to detect the copy-specific occurrence of PTMs on the nucleosomal sister histones. This protocol presents a biochemical method for the in vitro reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. The generated complex can be also asymmetrically modified, after including a premodified histone pool during refolding of histone subcomplexes. These asymmetric nucleosome preparations can be readily reacted with histone-modifying enzymes to study modification cross-talk mechanisms imposed by the asymmetrically pre-incorporated PTM using nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Particularly, the modification reactions in real-time can be mapped independently on the two sister histones by performing different types of NMR correlation experiments, tailored for the respective isotope type. This methodology provides the means to study crosstalk mechanisms that contribute to the formation and propagation of asymmetric PTM patterns on nucleosomal complexes.

This protocol describes the reconstitution of nucleosomes containing differentially isotope-labeled sister histones. At the same time, asymmetrically post-translationally modified nucleosomes can be generated after using a premodified histone copy. These preparations can be readily used to study modification crosstalk mechanisms, simultaneously on both sister histones, by using high-resolution NMR spectroscopy.

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

Asymmetrically modified nucleosomes contain the two copies of a histone (sister histones) decorated with distinct sets of Post-translational Modifications ...

Ricerca

Biochimica

Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The mass production and distribution of antibodies specific to histone PTMs has greatly facilitated research on these marks. As histone PTM antibodies are key reagents for many chromatin biochemistry applications, rigorous analysis of antibody specificity is necessary for accurate data interpretation and continued progress in the field. This protocol describes an integrated pipeline for the design, fabrication and use of peptide microarrays for profiling the specificity of histone antibodies. The design and analysis aspects of this procedure are facilitated by ArrayNinja, an open-source and interactive software package we recently developed to streamline the customization of microarray print formats. This pipeline has been used to screen a large number of commercially available and widely used histone PTM antibodies, and data generated from these experiments are freely available through an online and expanding Histone Antibody Specificity Database. Beyond histones, the general methodology described herein can be applied broadly to the analysis of PTM-specific antibodies.

This manuscript describes methods for applying peptide microarray technology to specificity profiling of antibodies that recognize histones and their post-translational modifications.

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

Optimizing the Genetic Incorporation of Chemical Probes into GPCRs for Photo-crosslinking Mapping and Bioorthogonal Chemistry in Live Mammalian Cells

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and reactive moieties onto proteins directly in the live cell. Each ncAA is incorporated by a dedicated orthogonal suppressor-tRNA/amino-acyl-tRNA-synthetase (AARS) pair that is imported into the host organism. The incorporation efficiency of different ncAAs can greatly differ, and be unsatisfactory in some cases. Orthogonal pairs can be improved by manipulating either the AARS or the tRNA. However, directed evolution of tRNA or AARS using large libraries and dead/alive selection methods are not feasible in mammalian cells. Here, a facile and robust fluorescence-based assay to evaluate the efficiency of orthogonal pairs in mammalian cells is presented. The assay allows screening tens to hundreds of AARS/tRNA variants with a moderate effort and within a reasonable time. Use of this assay to generate new tRNAs that significantly improve the efficiency of the pyrrolysine orthogonal system is described, along with the application of ncAAs to the study of G-protein coupled receptors (GPCRs), which are challenging objects for ncAA mutagenesis. First, by systematically incorporating a photo-crosslinking ncAA throughout the extracellular surface of a receptor, binding sites of different ligands on the intact receptor are mapped directly in the live cell. Second, by incorporating last-generation ncAAs into a GPCR, ultrafast catalyst-free receptor labeling with a fluorescent dye is demonstrated, which exploits bioorthogonal strain-promoted inverse Diels Alder cycloaddition (SPIEDAC) on the live cell. As ncAAs can be generally applied to any protein independently on its size, the method is of general interest for a number of applications. In addition, ncAA incorporation does not require any special equipment and is easily performed in standard biochemistry labs.

A facile fluorescence assay is presented to evaluate the efficiency of amino-acyl-tRNA-synthetase/tRNA pairs incorporating non-canonical amino-acids (ncAAs) into proteins expressed in mammalian cells. The application of ncAAs to study G-protein coupled receptors (GPCRs) is described, including photo-crosslinking mapping of binding sites and bioorthogonal GPCR labeling on live cells.

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

The genetic incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via amber stop codon suppression is a powerful technique to install artificial probes and ...

Chimica

Detection of Post-translational Modifications on Native Intact Nucleosomes by ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 base pairs of DNA associated with two each of histones H2A, H2B, H3, and H41. The N-terminal tails of histones are rich in lysine and arginine and are modified post-transcriptionally by acetylation, methylation, and other post-translational modifications (PTMs). The PTM configuration of nucleosomes can affect the transcriptional activity of associated DNA, thus providing a mode of gene regulation that is epigenetic in nature 2,3. We developed a method called nucleosome ELISA (NU-ELISA) to quantitatively determine global PTM signatures of nucleosomes extracted from cells. NU-ELISA is more sensitive and quantitative than western blotting, and is useful to interrogate the epiproteomic state of specific cell types. This video journal article shows detailed procedures to perform NU-ELISA analysis.

Nucleosome ELISA (NU-ELISA) is a sensitive and quantitative method to detect global patterns of post-translational modifications in preparations of native, intact nucleosomes. These modifications include methylations, acetylations, and phosphorylations at specific histone amino acid residues, and hence NU-ELISA provides a global proteomic assay of the overall chromatin modification states of specific cell types.

Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

The genome of eukaryotes exists as chromatin which contains both DNA and proteins. The fundamental unit of chromatin is the nucleosome, which contains 146 ...

Biologia

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene expression regulation are commonly disrupted in many diseases, a locus-specific, endogenous, and reversible method to study and control these mechanisms of action has been lacking. To address this issue, we have developed and characterized novel gene-regulating bifunctional molecules. One component of the bifunctional molecule binds to a DNA-protein anchor so that it will be recruited to an allele-specific locus. The other component engages endogenous cellular chromatin-modifying machinery, recruiting these proteins to a gene of interest. These small molecules, called chemical epigenetic modifiers (CEMs), are capable of controlling gene expression and the chromatin environment in a dose-dependent and reversible manner. Here, we detail a CEM approach and its application to decrease gene expression and histone tail acetylation at a Green Fluorescent Protein (GFP) reporter located at the Oct4 locus in mouse embryonic stem cells (mESCs). We characterize the lead CEM (CEM23) using fluorescent microscopy, flow cytometry, and chromatin immunoprecipitation (ChIP), followed by a quantitative polymerase chain reaction (qPCR). While the power of this system is demonstrated at the Oct4 locus, conceptually, the CEM technology is modular and can be applied in other cell types and at other genomic loci.

Regulation of the chromatin environment is an essential process required for proper gene expression. Here, we describe a method for controlling gene expression through the recruitment of chromatin-modifying machinery in a gene-specific and reversible manner.

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Bioingegneria

<meta charset="utf8"></head><body>Ricostituzione nucleosomiale in situ per studi su singole molecole

In Situ Nucleosome Assembly for Single-Molecule Correlative Force and Fluorescence Microscopy

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding their biophysical properties and interactions with chromatin-binding proteins. Nucleosome reconstitution on DNA for these studies typically involves a salt dialysis procedure that provides precise control over the placement and number of nucleosomes formed along a DNA tether. However, this protocol is time-consuming and requires a substantial amount of DNA and histone octamers as inputs. To offer an alternative strategy, an in situ nucleosome reconstitution method for single-molecule force and fluorescence microscopy that utilizes the histone chaperone Nap1 is described. This method enables users to assemble nucleosomes on any DNA template without the need for strong nucleosome positioning sequences, adjust nucleosome density on demand, and use fewer reagents. In situ nucleosome formation occurs within seconds, offering a simpler experimental workflow and a convenient transition into single-molecule measurements. Examples of two downstream assays for probing nucleosome mechanics and visualizing the behavior of individual proteins on chromatin are further described.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Ricostituzione efficiente dei nucleosomi per tecniche a singola molecola

This article presents a detailed experimental procedure for reconstituting nucleosome-containing DNA tethers for single-molecule correlative force and fluorescence microscopy. It further describes several downstream experiments that can be conducted to visualize the binding behavior of chromatin-interacting proteins and analyze changes in the physical properties of nucleosomes.

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Nucleosomes constitute the primary unit of eukaryotic chromatin and have been the focus of numerous informative single-molecule investigations regarding ...

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. Among them, reversible lysine acetylation is one of the most widely distributed in all domains of life. Although numerous mass spectrometry-based acetylome studies have been performed, further characterization of these putative acetylation targets has been limited. One possible reason is that it is difficult to generate purely acetylated proteins at desired positions by most classic biochemical approaches. To overcome this challenge, the genetic code expansion technique has been applied to use the pair of an engineered pyrrolysyl-tRNA synthetase variant, and its cognate tRNA from Methanosarcinaceae species, to direct the cotranslational incorporation of acetyllysine at the specific site in the protein of interest. After first application in the study of histone acetylation, this approach has facilitated acetylation studies on a variety of proteins. In this work, we demonstrated a facile protocol to produce site-specifically acetylated proteins by using the model bacterium Escherichia coli as the host. Malate dehydrogenase was used as a demonstration example in this work.

A Facile Protocol to Generate Site-Specifically Acetylated Proteins in Escherichia Coli

Genetic code expansion serves as a powerful tool to study a wide range of biological processes, including protein acetylation. Here we demonstrate a facile protocol to exploit this technique for generating homogeneously acetylated proteins at specific sites in Escherichia coli cells.

Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli

Post-translational modifications that occur at specific positions of proteins have been shown to play important roles in a variety of cellular processes. ...

Immunologia e infezioni

Application of MassSQUIRM for Quantitative Measurements of Lysine Demethylase Activity

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small molecule studies and drug development 4. Many epigenetic regulators have only recently been discovered and are still in the process of being classified. Among these enzymes are lysine demethylases which remove methyl groups from lysines on histones and other proteins. Due to the novel nature of this class of enzymes, few assays have been developed to study their activity. This has been a road block to both the classification and high throughput study of histone demethylases. Currently, very few demethylase assays exist. Those that do exist tend to be qualitative in nature and cannot simultaneously discern between the different lysine methylation states (un-, mono-, di- and tri-). Mass spectrometry is commonly used to determine demethylase activity but current mass spectrometric assays do not address whether differentially methylated peptides ionize differently. Differential ionization of methylated peptides makes comparing methylation states difficult and certainly not quantitative (Figure 1A). Thus available assays are not optimized for the comprehensive analysis of demethylase activity.
Here we describe a method called MassSQUIRM (mass spectrometric quantitation using isotopic reductive methylation) that is based on reductive methylation of amine groups with deuterated formaldehyde to force all lysines to be di-methylated, thus making them essentially the same chemical species and therefore ionize the same (Figure 1B). The only chemical difference following the reductive methylation is hydrogen and deuterium, which does not affect MALDI ionization efficiencies. The MassSQUIRM assay is specific for demethylase reaction products with un-, mono- or di-methylated lysines. The assay is also applicable to lysine methyltransferases giving the same reaction products. Here, we use a combination of reductive methylation chemistry and MALDI mass spectrometry to measure the activity of LSD1, a lysine demethylase capable of removing di- and mono-methyl groups, on a synthetic peptide substrate 5. This assay is simple and easily amenable to any lab with access to a MALDI mass spectrometer in lab or through a proteomics facility. The assay has ~8-fold dynamic range and is readily scalable to plate format 5.

We present a method for using MALDI mass spectrometry and reductive methylation chemistry to quantify changes in lysine methylation.

Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina

Recently, epigenetic regulators have been discovered as key players in many different diseases 1-3. As a result, these enzymes are prime targets for small ...

Acetilazione lisina specifica del sito degli istoni per la ricostituzione nucleosoma usando l'espansione del codice genetico in Escherichia coli

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

Analisi della specificità degli anticorpi istonici con microarray di peptide

Ottimizzando la costituzione genetica di chimico sonde in GPCR per foto-reticolazione Mapping e chimica di Bioorthogonal in cellule di mammiferi dal vivo

Rilevazione di modificazioni post-traduzionali in nativo nucleosomi intatto da ELISA

Reprimere la trascrizione genica reindirizzando macchinario cellulare con modificatori epigenetici chimici

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Assemblaggio di nucleosomi in situ per la microscopia a forza correlativa e fluorescenza a singola molecola

Un protocollo Facile generare proteine site-specifically acetilati in Escherichia Coli

Applicazione di MassSQUIRM per le misure quantitative delle attività demetilasi lisina