Gli autori ringraziano l'intero consorzio ACEnano per le proficue discussioni in tutte le fasi della preparazione del protocollo qui presentato. Gli autori apprezzano anche i finanziamenti del programma Horizon 2020 dell'Unione europea (H2020) nell'ambito della sovvenzione nº 720952 nell'ambito del progetto ACEnano.

1. Configurazione del sistema AF4
<ol><li>Assemblare la cartuccia AF4 e collegare tutti i componenti hardware del sistema AF4 e del rivelatore UV-vis(Table of Materials)seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore.</li>
	<li>Installare tutti i pacchetti software necessari per il controllo, l'acquisizione, l'elaborazione e la valutazione dei dati seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore.</li>
	<li>Assicurarsi che siano state stabilite tutte le connessioni di segnale necessarie tra il sistema AF4 e il rilevatore UV-vis.</li>
	<li>Assicurarsi che le connessioni AF4-UV-vis stabilite siano strette e senza perdite scaricando la configurazione con acqua ultrapura (UPW) per 15 min (portata della punta 1 mL-min-1,portata di messa a fuoco 1 mL-min-1e portata incrociata 1,5 mL-min-1). Per fare ciò, aprire il software di controllo AF4 e inserire le portate nei rispettivi pannelli sul lato superiore destro della pagina di destinazione. Stringere i rispettivi connettori (raccordi), se necessario, e ripetere la procedura fino a quando non sono osservabili perdite. NOTA: La pressione interna del sistema durante tutte le misurazioni deve essere monitorata e deve essere entro 4-12 bar. Nel caso in cui la pressione sia più alta o inferiore, il tubo di contropressione deve essere regolato. Inoltre, l'andamento della pressione del canale dovrebbe essere costante durante l'intero tempo di misurazione. NOTA: Se è disponibile un forno a canale, impostare la sua temperatura a 25 °C per garantire condizioni di misurazione comparabili in tutti gli esperimenti AF4.</li>
</ol>2. Preparazione di soluzioni e sospensioni per la qualificazione del sistema AF4-UV-vis e l'analisi dei campioni
<ol><li>Soluzione per la pulizia<ol>
<li>Aggiungere 8 g di idrossido di sodio solido (NaOH) e 2 g di solfato di dodecil di sodio (SDS) a 1 L di UPW e mescolare la soluzione fino alla dissoluzione totale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluente<ol>
<li>Aggiungere 500 μL di miscela di tensioattivi filtrati a 2 L di UPW filtrato e degassato per ottenere l'eluente (0,025% (v/v), pH intorno al 9,4). NOTA: Una descrizione dettagliata dei composti della miscela di tensioattivi è riportata nella tabella 1 (anche tabella dei materiali).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Standard di dimensioni AuNP arbitrario per la determinazione del recupero di massa<ol>
<li>Vortice uno standard di dimensioni AuNP arbitrario (50 mg-L-1) per 2 minuti e diluirlo 1:4 con UPW per ottenere una concentrazione di massa finale di 12,5 mg-L-1. Vortice per ulteriori 2 minuti dopo la diluizione per omogeneizzare la sospensione ottenuta. ATTENZIONE: Sono necessarie misure precauzionali necessarie e dispositivi di protezione adeguati quando si lavora con sostanze chimiche, in particolare pellet NaOH. NOTA: Si consiglia generalmente di de-gas e filtrare tutte le soluzioni necessarie (ad eccezione della soluzione di pulizia) utilizzando un filtro a membrana da 0,1 μm (PVDF idrofilo o simile) per garantire sfondi di particelle bassi durante gli esperimenti AF4-UV-vis. Questo può essere stabilito da un'unità di filtrazione sottovuoto dedicata o utilizzando filtri per siringhe.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Qualifica del sistema AF4-UV-vis
<ol><li>Utilizzare le impostazioni software descritte nel passaggio 1.4 per sciacquare il sistema con la soluzione di pulizia per 30 min (portata della punta 1 mL-min-1,portata di messa a fuoco 1 mL-min-1e portata incrociata 1,5 mL-min-1).</li>
	<li>Cambiare il rispettivo flacone eluente e sciacquare il sistema con UPW per 20 min (portata della punta 1 mL-min-1,portata di messa a fuoco 1 mL-min-1e portata incrociata 1,5 mL-min-1).</li>
	<li>Sostituire i rispettivi filtri pompa in linea.</li>
	<li>Aprire la cartuccia AF4 e sostituire la membrana AF4. Rimontare la cartuccia AF4 e ricollegarla al sistema AF4-UV-vis.</li>
	<li>Sciacquare il sistema AF4-UV-vis pulito con l'eluente per almeno 30 minuti al fine di equilibrare la membrana e stabilizzare il sistema (portata della punta 1 mL-min-1,portata di messa a fuoco 1 mL-min-1e portata incrociata 1,5 mL-min-1). Verificare nuovamente la presenza di potenziali perdite (vedere il passaggio 1.4).</li>
	<li>Qualificare il sistema AF4-UV-vis determinando il recupero di massa e la variazione del tempo di ritenzione utilizzando uno standard di dimensioni AuNP arbitrario.<ol>
<li>Eseguire un'esecuzione di iniezione diretta senza applicazione di una forza di separazione.<ol>
<li>Creare un nuovo file di misurazione aprendo File | Nuovo | Eseguire nel software di controllo AF4.</li>
			<li>Definire la descrizione del campione e della misurazione, nonché il volume di iniezione e il nome del campione all'interno della scheda Esegui. Le condizioni di misurazione sono visualizzate nella tabella 2.</li>
			<li>Impostare i parametri di misurazione nel metodo FFF della seconda scheda in base alla tabella 2.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante Esegui per avviare la misurazione.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Eseguire un'esecuzione di frazionamento con l'applicazione di una forza di separazione (cross flow).<ol>
<li>Definire il metodo di frazionamento descritto nella sezione precedente utilizzando le condizioni di frazionamento specificate nella tabella 3.</li>
			<li>Fare clic sul pulsante Esegui per avviare la misurazione.</li>
			<li>Eseguire la misurazione in quadruplicazione. NOTA: La prima manche mira a condizionare l'impianto (cioè la membrana AF4) e sarà esclusa dalla valutazione finale dei risultati delle qualifiche del sistema. NOTA: si consiglia di salvare tutti i file eseguiti generati aprendo File | Salvare nel software di controllo AF4.</li>
			<li>Si consideri il sistema AF4-UV-vis qualificato se si ottiene un recupero di massa di >80% e una variazione del tempo di ritenzione <2% per lo standard di dimensione AuNP arbitrario.</li>
			<li>Quando si utilizza un autocampionatore come sistema di iniezione, riempire il flacone del serbatoio di lavaggio dell'ago dell'autocampionatore con la stessa soluzione che viene pompata attraverso il sistema AF4-UV-vis (ad esempio, soluzione di pulizia, UPW o rispettivo eluente) per garantire condizioni di funzionamento ottimali. Quando si cambia l'eluente, si consiglia generalmente di seguire il ri-equilibrazione del sistema AF4 monitorando il segnale UV-vis-detector fino a quando la sua linea di base rimane stabile a un livello costante.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analisi del campione AF4-UV-vis
<ol><li>Preparare tutti gli standard di dimensione AuNP per la calibrazione delle dimensioni esterne vortice delle rispettive sospensioni AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm, ciascuna 50 mg. L-1) per 2 min e diluirlo 1:4 con UPW per ottenere una concentrazione di massa finale di 12,5 mg-L-1. Vortice per ulteriori 2 minuti dopo la diluizione per omogeneizzare le sospensioni ottenute.</li>
	<li>Preparare il campione AuNP sconosciuto per l'analisi applicando la stessa procedura degli standard di calibrazione descritti al passaggio 4.1.</li>
	<li>Eseguire una misurazione ad iniezione diretta di tutti gli standard di dimensione AuNP utilizzando il metodo AF4 visualizzato nella tabella 2.<ol>
<li>A tal fine, inserire i rispettivi valori riassunti nella tabella 2 nel software del produttore nelle posizioni appropriate per definire i parametri di separazione e campione e premere il pulsante Esegui per avviare l'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frazionare ogni standard di dimensione AuNP singolarmente utilizzando il metodo AF4 visualizzato nella tabella 3 per stabilire la funzione di calibrazione delle dimensioni esterne.<ol>
<li>Inserire i rispettivi valori riassunti nella tabella 3 nel software del fabbricante nelle posizioni appropriate. Il metodo di frazionamento è definito da una fase di messa a fuoco, diversi passaggi di eluizione e un passaggio di risciacquo. Dopo aver impostazione il metodo, premere il pulsante Esegui per avviare l'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eseguire una misurazione ad iniezione diretta dell'ignoto campione AuNP utilizzando il metodo AF4 visualizzato nella tabella 2.</li>
	<li>Eseguire il frazionamento del campione AuNP sconosciuto conducendo il metodo AF4 elencato nella tabella 3.</li>
	<li>Effettuare tutte le misurazioni di cui alle sezioni 3 e 4 in triplice copia, salvo diversa indicazione, per garantire risultati significativi e statisticamente rilevanti.<ol>
<li>Conservare 50 mg-L-1 Sospensioni stock AuNP a 4-8 °C prima dell'uso. Le sospensioni AuNP diluite sono preparate idealmente entro 30 minuti prima dell'applicazione. NOTA: Il vortice è solitamente sufficiente e non è necessaria alcuna ultrasonicazione delle sospensioni.</li>
		<li>Al fine di abilitare una correlazione del tempo di ritenzione del campione AuNP sconosciuto con i tempi di ritenzione ottenuti per gli standard di dimensione AuNP, misurare tutti i campioni utilizzando lo stesso metodo AF4. NOTA: Per garantire condizioni di separazione costanti e valide, includere/ripetere la fase di frazionamento descritta nella sezione di qualificazione del sistema (vedere fase 3.6.2) dopo un numero definito di misurazioni del campione (ad esempio, 10 misurazioni). Inoltre, registra la pressione del sistema e la stabilità della linea di base del rivelatore UV-vis. Dovrebbero rimanere stabili e costanti lungo una corsa COMPLETA AF4-UV-vis. NOTA: Di solito, sostituire la membrana di ultrafiltrazione quando il rivelatore UV-vis (o il rivelatore MALS (Multi Angle Light Scattering), se disponibile) mostra un aumento del livello di rumore o i criteri di qualificazione del sistema definiti come il recupero, la forma del picco del campione o la ripetibilità (o il sistema AF4-UV-vis è stato sottoposto a una procedura di pulizia accurata). Nelle condizioni qui descritte, il sistema AF4-UV-vis qualificato è solitamente stabile per almeno 50 misurazioni utilizzando la stessa membrana; tuttavia, il numero di possibili misurazioni consecutive che soddisfa i criteri di qualità definiti può variare significativamente a seconda del campione, della matrice del campione e della composizione eluente.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Valutazione dei dati
<ol><li>Eseguire il calcolo del recupero di massa utilizzando il software di valutazione dei dati fornito dal produttore del sistema AF4-UV-vis o l'analisi del foglio di calcolo dopo l'esportazione di tutti i dati grezzi necessari (ad esempio, area di picco UV-vis) dal rispettivo software di acquisizione dati seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore.<ol>
<li>Calcolare il recupero di massa AuNP confrontando le aree sotto i rispettivi picchi UV-vis della misurazione del frazionamento (unfrazionamento)e la misurazione dell'iniezione diretta (Adirect injection)utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ02.jpg"> NOTA: Durante una misurazione dell'iniezione diretta, non viene applicata alcuna forza di separazione e quindi le potenziali interazioni di una specie di alita con la parete di accumulo possono essere trascurate. L'area sotto un rispettivo picco UV-vis può essere direttamente correlata alla massa AuNP usando la legge di Beer-Lambert supponendo che nessun'altra specie all'interno del campione assorba alla rispettiva lunghezza d'onda e /o i) eluisce in un altro tempo di ritenzione in condizioni di frazionamento ii) viene rimossa attraverso la membrana AF4.</li>
		<li>Importare i file dat.</li>
		<li>Selezionate la traccia del rilevatore UV-vis nella scheda Panoramica (Overview).</li>
		<li>Definire una regione di interesse (ROI) e una linea di base nella vista segnale e linea di base per tutte le misurazioni.</li>
		<li>Inserire una calibrazione ad iniezione diretta tramite inserto.</li>
		<li>Selezionare tutte le esecuzioni di iniezione diretta nella visualizzazione Impostazioni di calibrazione a iniezione diretta e immettere un coefficiente di estinzione UV. NOTA: È importante utilizzare lo stesso coefficiente di estinzione UV-vis sia per la calibrazione che per la misurazione del frazionamento.</li>
		<li>Stabilire la linea di calibrazione utilizzando l'area sotto la traccia del segnale UV-vis all'interno del ROI e la quantità iniettata calcolata dalla concentrazione immessa e dal volume di iniezione. La calibrazione ottenuta verrà visualizzata nella finestra funzione di calibrazione ad iniezione diretta separata.</li>
		<li>Assegnare la funzione di calibrazione alle rispettive misurazioni del frazionamento. NOTA: Per ogni standard di dimensione di calibrazione e il campione AuNP sconosciuto, è necessario stabilire una funzione di calibrazione separata a causa dell'assorbanza UV-vis dipendente dalle dimensioni di AuNP. Questo inconveniente del rilevatore UV-vis può essere aggirato utilizzando un rilevatore sensibile alla massa come un ICP-MS.</li>
		<li>Eseguire le analisi inserendo un calcolo dei risultati quantitativi e i risultati verranno visualizzati all'interno di una tabella a destra come valori di concentrazione e quantità iniettata.</li>
	</ol></li>
	<li>Calcola la variazione del tempo di conservazione utilizzando il software di valutazione dei dati fornito dal produttore del sistema AF4 o l'analisi del foglio di calcolo dopo l'esportazione di tutti i dati grezzi necessari (cioè i tempi di conservazione degli standard di calibrazione AuNP ai rispettivi massimi di picco UV-vis e i rispettivi tempi di vuoto) dal rispettivo software di acquisizione dati seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore.<ol>
<li>Aprire la finestra Panoramica per visualizzare le rispettive tracce UV per tutte le misurazioni importate.</li>
		<li>Il rilevamento dei picchi verrà eseguito automaticamente; regolare i parametri di rilevamento dei picchi all'interno della casella degli strumenti di elaborazione del segnale per ottimizzare le prestazioni. Estrarre i rispettivi massimi di picco passando attraverso tutti i file di misurazione.</li>
		<li>Calcolare la deviazione standard relativa per tutte le misurazioni utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/61757/61757equ01.jpg"> Il calcolo può anche essere eseguito utilizzando un rispettivo software per fogli di calcolo.</li>
	</ol></li>
	<li>Eseguire la determinazione delle dimensioni utilizzando il software di valutazione dei dati fornito dal produttore o l'analisi del foglio di calcolo dopo l'esportazione di tutti i dati grezzi necessari (tempo di conservazione al picco UV-vis massimo di alita e rispettivo tempo di vuoto) dal rispettivo software di acquisizione dati seguendo le istruzioni fornite nel manuale del produttore. È possibile stabilire una funzione di calibrazione delle dimensioni esterne tracciando i tempi di ritenzione corretti per il tempo vuoto (tempi di ritenzione netti,cfr. tabella 5 ) degli standard di dimensione AuNP (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm) rispetto alle loro dimensioni idrodinamiche ottenute da misurazioni DLS precedentemente eseguite (vedere tabella 4). NOTA: Le misurazioni DLS devono essere effettuate idealmente lo stesso giorno delle rispettive misurazioni del frazionamento per garantire proprietà del campione comparabili.<ol>
<li>Dopo aver importato .dat file, tutte le misurazioni vengono visualizzate nella scheda Panoramica. Selezionate il segnale del rivelatore UV-vis dall'elenco dei rivelatori, visualizzato sotto la finestra di sovrapposizione. Definire un ROI e una linea di base per ogni misurazione, che possono essere regolati nella vista Segnale e Linea di base. Utilizzare la casella degli strumenti di elaborazione del segnale a destra per smussare i segnali rumorosi. Utilizzare la funzione Assegna parametri di elaborazione ad altre esecuzioni per consentire l'allocazione dei parametri ad altre misurazioni, rispettivamente segnali.</li>
		<li>Selezionate la calibrazione delle dimensioni delle particelle dalla scheda Inserisci( Insert).</li>
		<li>Selezionare tutte le esecuzioni di calibrazione facendo clic sulla rispettiva misurazione nella tabella Seleziona riferimenti per calibrazione nella parte superiore destra. Tutte le misurazioni selezionate verranno visualizzate in una tabella sottostante. Immettere il raggio idrodinamico per tutte le misurazioni di calibrazione specificate nella tabella 4. La funzione verrà visualizzata nella calibrazione delle dimensioni delle particelle - Funzione e verrà visualizzata anche l'equazione. NOTA: Il coefficiente di correlazione (R2)della funzione di calibrazione delle dimensioni stabilita deve essere ≥0,990.</li>
		<li>Assegnate la funzione di calibrazione alle misurazioni del campione AuNP sconosciuto selezionando i rispettivi frazionamento all'interno dell'elenco Seleziona esecuzioni per assegnazione.</li>
		<li>Visualizzare i risultati aprendo un calcolo della distribuzione delle dimensioni delle particelle all'interno della scheda inserisci. La calibrazione delle dimensioni delle particelle creata in precedenza verrà elencata come calibrazione per le misurazioni del campione AuNP sconosciute, che viene visualizzata nelle impostazioni della finestra destra. La dimensione calcolata verrà visualizzata nella finestra di distribuzione delle dimensioni etichettata al massimo di picco. Selezionare la casella di controllo Segnali medi per campione per in media tutte le misurazioni di un campione ed elencare il risultato nell'etichetta massima di picco.</li>
		<li>Inoltre, tracciate la linea di calibrazione sul fractogramma selezionando la casella di controllo Mostra curva di calibrazione. È disponibile una distribuzione cumulativa delle dimensioni selezionando la casella di controllo Mostra distribuzione cumulativa. NOTA: quando si utilizza il software del produttore per la valutazione dei dati, si consiglia di aggiungere tutti i risultati a un report, che può essere generato facendo clic su Report all'interno della scheda Inserisci. Il pulsante Report aggiunge tutti i risultati, le tabelle e i diagrammi a un documento. Nella scheda Report è possibile modificare le impostazioni del report aprendo l'impostazione Report all'interno della sezione Documento.</li>
	</ol></li>
</ol>

Tutti gli autori di questo manoscritto sono dipendenti di Postnova Analytics GmbH, i cui prodotti sono utilizzati in questo protocollo.

La dimensione idrodinamica di un AuNP sconosciuto è stata accuratamente valutata da AF4 accoppiata con un rivelatore UV-vis utilizzando standard di dimensioni AuNP ben definiti che vanno da 20 nm a 100 nm. Il metodo AF4 sviluppato è stato ottimizzato utilizzando un profilo di flusso incrociato costante al fine di stabilire una relazione lineare tra il tempo di ritenzione misurato e le dimensioni AuNP, consentendo così una semplice determinazione delle dimensioni dall'analisi di regressione lineare. Particolare attenzione è stata rivolta anche al raggiungimento di tassi di recupero sufficientemente elevati che non indicano alcuna perdita significativa del campione durante il frazionamento e che il metodo AF4 sviluppato, compresi l'eluente applicato e la membrana, corrispondeva bene a tutti i campioni AuNP frazionati.
Lo sviluppo del metodo è probabilmente il passaggio più critico in AF4 e diversi parametri, tra cui dimensioni del canale, parametri di flusso e proprietà eluenti, membrane, distanziale e persino proprietà del campione devono essere presi in considerazione per migliorare il frazionamento all'interno di una data finestra di tempo di eluizione. Lo scopo di questo paragrafo è quello di guidare il lettore attraverso i passaggi critici ottimizzati per determinare con successo le dimensioni dell'esempio AuNP sconosciuto discusso qui. Per una descrizione più dettagliata di come sviluppare generalmente un metodo AF4, il lettore è indirizzato alla sezione AF4 di 'ISO/TS21362:2018 - Nanotecnologie - Analisi di nano-oggetti utilizzando flusso asimmetrico e frazionamento campo-flusso centrifugo'25. Guardando più da vicino le condizioni di frazionamento applicate fornite nella tabella 3, il primo passo critico è l'introduzione e il rilassamento del campione AuNP nel canale AF4. Questo passaggio è regolato dal flusso di iniezione, dal flusso di messa a fuoco e dal flusso trasversale, la cui interazione costringe il campione a localizzare vicino alla superficie della membrana e a concentrarlo in una banda stretta vicino alla porta di iniezione del canale AF4 definendo fondamentalmente il punto di partenza del frazionamento. Un sufficiente rilassamento del campione è obbligatorio in quanto durante questa fase, i costituenti campione di diverse dimensioni si localizzino in diverse altezze del canale AF4 fornendo così la base per un frazionamento di dimensioni di successo. Il rilassamento incompleto del campione è solitamente visibile da un'area di picco del vuoto aumentata risultante da costituenti campione non contaminati (cioè non rilassati). Questo effetto può essere mitigato aumentando il tempo di iniezione e/o la portata incrociata applicata. Tuttavia, entrambi i parametri necessitano di un'attenta ottimizzazione, specialmente per i campioni soggetti ad agglomerazione e adsorbimento sulla membrana AF4, e possono essere monitorati dai rispettivi tassi di recupero ottenuti per diverseimpostazioni di parametro 36,37. Il tempo di iniezione applicato di 5 minuti insieme a una portata trasversale di 1,0 mL-min-1 ha rivelato tassi di recupero >80% per tutti i campioni AuNP e un'area di picco del vuoto trascurabile che indica condizioni di rilassamento quasi ottimali. Dopo un sufficiente rilassamento del campione AuNP, il flusso di messa a fuoco è stato interrotto ed è stato avviato il trasporto del campione lungo la lunghezza del canale AF4 fino al rispettivo rivelatore UV-vis che rappresenta il secondo passaggio critico. Al fine di garantire una potenza di frazionamento sufficientemente elevata a tempi di analisi ragionevoli, è stata applicata una portata trasversale costante di 1,0 mL-min-1 per 30-50 min (a seconda del rispettivo standard di dimensione AuNP frazionata) seguita da un decadimento lineare del flusso trasversale di 10 minuti ad una portata del rivelatore di 0,5 mL.min-1. L'uso di un profilo di flusso incrociato costante attraverso la separazione di tutti gli standard di dimensione AuNP ha rivelato una relazione lineare tra il tempo di ritenzione e la dimensione AuNP dopo la teoria FFF22, consentendo così la determinazione delle dimensioni del campione AuNP sconosciuto mediante una semplice analisi di regressione lineare. Tuttavia, profili diversi da un flusso incrociato costante sono stati sfruttati anche per il dimensionamento delle nanoparticelle, portando infine a una relazione non lineare tra tempo di ritenzione e dimensione delleparticelle 38,39. Inoltre, la determinazione delle dimensioni in AF4 utilizzando standard di dimensioni ben definiti non è limitata all'AuNP, ma può anche essere applicata a nanoparticelle con altre dimensioni e composizione elementare (ad esempio,argento 38,40 o nanoparticelle di silice41,42). Inoltre, quando si lavora con campioni diluiti, ICP-MS è un rivelatore elementale altamente sensibile, che può essere accoppiato con AF4, aggiungendo alla versatilità di questo approccio analitico per il dimensionamento di una grande varietà di nanoparticelle in sospensione.
Nonostante la sua ampia applicazione, la calibrazione delle dimensioni esterne utilizzando standard di dimensioni ben definiti in AF4 ha alcune peculiarità che devono essere prese in considerazione quando la si utilizza per il dimensionamento accurato di campioni sconosciuti. In primo luogo, si basa fortemente sull'applicazione di condizioni comparabili durante il frazionamento dei rispettivi standard di dimensione e del campione effettivo. Nel caso qui presentato, è quindi obbligatorio che sia gli standard di dimensione AuNP che l'ignoto campione AuNP siano frazionati utilizzando lo stesso metodo AF4 così come lo stesso eluente e la stessa membrana rendendo questo approccio abbastanza inflessibile. Inoltre, non avendo rilevatori sensibili alle dimensioni, ad esempio lo scattering della luce (MALS e DLS) a portata di mano, è difficile determinare se un rispettivo metodo AF4 che utilizza standard di dimensione funzioni sufficientemente bene o meno. Ciò vale in particolare per campioni sconosciuti che presentano distribuzioni di dimensioni molto ampie, dove non è chiaro se tutti i costituenti del campione seguano il normale modello di eluizione: frazionamento da particelle più piccole a particelle più grandi, o se costituenti campione più grandi già eluti in modalità sterico-iperstrato, quindi potenzialmente co-eluizione con costituenti campione piùpiccoli 43,44. Inoltre, anche se la teoria FFF sottolinea che AF4 si separa esclusivamente in base alle differenze di dimensione idrodinamica con particelle considerate masse puntili senza alcuna interazione con il loroambiente 22, la realtà racconta una storia diversa con le interazioni particella-particella e particella-membrana (come attrazione elettrostatica / repulsione o attrazione di van-der-Waals) può svolgere un ruolo considerevole e può potenzialmente introdurre una distorsione misurabile nelle determinazioni delle dimensioni attraverso la calibrazione delle dimensioniesterne 45,46. Si raccomanda pertanto di utilizzare standard di dimensione che corrispondano idealmente alla composizione e alle proprietà superficiali (potenziale Zeta) della particella di interesse40,42 o, se questi non sono disponibili, almeno utilizzare standard di dimensione delle particelle ben caratterizzati (ad esempio, particelle di lattice di polistirolo) e valutarne attentamente la comparabilità con la particella di interesse soprattutto in termini di potenziale Zeta superficiale nel rispettivo ambiente, in cui l'analisi deve essereeffettuata 41,47.
La versatilità di AF4 è spesso considerata la sua massima forza, in quanto offre una gamma di applicazioni che va oltre la maggior parte delle altre tecniche di dimensionamento comuni inquesto campo 22,48,49. Allo stesso tempo, a causa della sua complessità presumibilmente associata, può anche essere considerato il suo svantaggio più significativo soprattutto contro tecniche di dimensionamento veloci e apparentemente facili da usare come DLS, Nanoparticle Tracking Analysis o ICP-MS a singola particella. Tuttavia, quando si mette AF4 in prospettiva con queste popolari tecniche di dimensionamento, diventa chiaro che tutte le tecniche hanno i loro pro e contro, ma tutte contribuiscono a una comprensione più completa della natura fisico-chimica delle nanoparticelle e dovrebbero quindi essere considerate complementari piuttosto che competitive.
La procedura operativa standard (SOP) qui presentata, evidenzia l'eccellente applicabilità di AF4-UV-vis con calibrazione delle dimensioni esterne per il dimensionamento di un campione AuNP sconosciuto in sospensione ed è stata infine applicata come linea guida raccomandata per l'analisi AF4 di un campione AuNP sconosciuto all'interno di un confronto interlaboratorio internazionale (ILC) che è stato condotto nell'ambito del progetto Horizon 2020, ACEnano (il risultato di questo ILC sarà oggetto di una futura pubblicazione). Questo protocollo, pertanto, si aggiunge agli incoraggianti e continui sforzi internazionali per convalidare e standardizzare le metodologie AF425,50,51,52 sottolineando il promettente potenziale di AF4 nel campo della caratterizzazione delle nanoparticelle.

Le nanoparticelle d'oro (AuNP) sotto forma di oro colloidale avevano fatto parte della cultura umana molto prima che ci fosse una comprensione di cosa fossero le nanoparticelle e prima che il termine nanoparticella avesse trovato la sua strada nel vocabolario scientifico contemporaneo. Senza una conoscenza distinta del loro aspetto su scala nanometrica, l'AuNP sospeso era già stato utilizzato per scopi medici e di altro tipo nell'antica Cina, Arabia e India nei secoli V-VIa.C. 1, eanche gli antichi romani approfittarono del loro colore rosso rubino per macchiare notoriamente le loro ceramiche nella mostra Lycurgus Cup nel British Museum2. Nel mondo occidentale, nel corso dei secoli dal Medioevo all'era moderna, l'AuNP sospeso era usato prevalentemente come colorante per il vetro e lo smalto (viola di Cassio)3, nonché per trattare una varietà di malattie (oro potabile), in particolare la sifilide4.
Tuttavia, tutti questi studi si erano concentrati principalmente sull'applicazione dell'AuNP sospeso e spettava a Michael Faraday nel 1857 introdurre il primo approccio razionale per indagare la loro formazione, la loro natura e le loro proprietà5. Sebbene Faraday fosse già consapevole che questi AuNP devono avere dimensioni molto minute, non è stato fino allo sviluppo della microscopia elettronica quando informazioni esplicite sulla loro distribuzione delle dimensionierano accessibili 6,7 , consentendo infine lacorrelazionetra le dimensioni e altre proprietà AuNP.
Al giorno d'oggi, grazie alla loro sintesi abbastanza facile e diretta, alle notevoli proprietà ottiche (risonanza plasmonica superficiale), alla buona stabilità chimica e quindi alla tossicità minore, nonché alla loro elevata versatilità in termini di dimensioni disponibili e modifiche superficiali, AuNP ha trovato applicazioni diffuse in campi come la nanoelettronica8,la diagnostica9,la terapia delcancro 10o la somministrazione difarmaci 11. Ovviamente, per queste applicazioni, una conoscenza precisa delle dimensioni e della distribuzione delle dimensioni dell'AuNP applicato è un prerequisito fondamentale per garantire un'efficaciaottimale 12 e vi è una notevole richiesta di strumenti robusti e affidabili per determinare questo parametro fisico-chimico cruciale. Oggi esiste una pletora di tecniche analitiche in grado di dimensionare AuNP in sospensione, tra cui, ad esempio, spettroscopia UV-vis (UV-vis)13, Dynamic Light Scattering (DLS)14 o Spettrometria di massa plasmatica accoppiata induttivamente a particella singola (spICP-MS)15 con frazionamento campo-flusso (FFF) che è un attore chiave inquesto campo 16,17,18,19,20.
Concettualizzato per la prima volta nel 1966 da J. Calvin Giddings21, FFF comprende una famiglia di tecniche di frazionamento basate sull'eluizione, dove la separazione avviene all'interno di un canale sottile simile a un nastro senza una fasestazionaria 22,23. In FFF, la separazione è indotta dall'interazione di un campione con un campo di forza esterno che agisce perpendicolarmente alla direzione di un flusso di canale laminare, in cui il campione viene trasportato a valle di solito verso i rispettivi rivelatori in linea. Tra queste tecniche FFF correlate, il frazionamento asimmetrico campo-flusso di flusso (AF4), dove un secondo flusso (flusso trasversale) agisce come campo di forza, è diventato il sottotipo24 più utilizzato. In AF4, il fondo del canale (parete di accumulo) è dotato di una membrana di ultrafiltrazione semipermeabile in grado di trattenere il campione consentendo allo stesso tempo al flusso trasversale di passare attraverso la membrana e lasciare il canale tramite una presa extra. Con questo mezzo, il flusso trasversale può spingere il campione verso la parete di accumulo contrastando così il suo flusso indotto dalla diffusione (moto browniano). In un conseguente equilibrio di flussi indotti dal campo e dalla diffusione; i costituenti campione più piccoli che presentano coefficienti di diffusione più elevati si allineano più vicino al centro del canale, mentre i costituenti campione più grandi che presentano coefficienti di diffusione più bassi si individuano più vicino alla parete di accumulo. A causa del profilo di flusso parabolico all'interno del canale, i costituenti del campione più piccoli vengono quindi trasportati nelle lamina più veloci del flusso del canale ed eluiscono prima di costituenti campione più grandi. Utilizzando il parametro di ritenzione FFF e le equazioni del coefficiente di diffusione di Stokes-Einstein, il tempo di eluizione e, rispettivamente, il volume di eluizione di un campione in AF4 possono quindi essere tradotti direttamente nella sua dimensione idrodinamica22. Qui il comportamento di eluizione descritto si riferisce alla normale modalità di eluizione ed è solitamente valido per AF4 all'interno di un intervallo di dimensione delle particelle compreso tra circa 1-500 nm (a volte fino a 2000 nm a seconda delle proprietà delle particelle e dei parametri di frazionamento) mentre l'eluizione sterico-iperstrato di solito si verifica al di sopra di questa sogliadi dimensione 25.
Esistono tre modi comuni per ricavare informazioni sulle dimensioni dopo la separazione per FFF. Poiché FFF è uno strumento modulare, può essere combinato a valle con più rivelatori come rilevatori di diffusione della luce sensibili alle dimensioni basati sul principio dello scattering della luce multi-angolo (MALS)26,27,Dynamic Light Scattering (DLS)28,29o anche una combinazione di entrambi per ottenere ulteriori informazioni sullaforma 30,31. Tuttavia, poiché il comportamento di ritenzione di un campione in un canale FFF è generalmente governato da forze fisiche ben definite, le dimensioni possono anche essere calcolate utilizzando un approccio matematico (teoria FFF), in cui un semplice rivelatore di concentrazione (ad esempio, un rivelatore UV-vis) è sufficiente per indicare la presenza di un campione di eluizione32,33.
Come terza opzione, qui segnalamo l'applicazione di una calibrazione delle dimensioniesterne 34,35 utilizzando standard AuNP ben definiti nell'intervallo di dimensioni di 20-100 nm per il dimensionamento di un campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto in sospensione utilizzando AF4 accoppiato con il rilevamento UV-vis. Questa semplice configurazione sperimentale è stata scelta apposta per consentire al maggior numero possibile di laboratori di aderire a un confronto interlaboratorio internazionale (ILC), che è stato successivamente eseguito nell'ambito del progetto Horizon 2020 dell'Unione Europea ACEnano sulla base del protocollo qui presentato.

<table><tbody><tr><td>0.1 &amp;micro;m Membrane Filters (hydrophilic PVDF)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-FIL-TEF-002</td><td>Used for filtration of aqueous solutions</td></tr><tr><td>0.22 &amp;micro;m PVDF Syringe Filter (d = 33 mm)</td><td>Merck Millipore</td><td>Durapore Millex</td><td>Used for filtration of NovaChem100</td></tr><tr><td>Adjustable Volume Pipettes (1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>Research Plus</td><td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td></tr><tr><td>AF4 cartridge</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF - AF4 Analytical Channel</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>AF4 Membrane - Regenerated Cellulose (10 kDa MWCO)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-AF4-MEM-612-10KD</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Analytical Balance (0.1 mg precision)</td><td>Sartorius</td><td>ENTRIS124I-1S</td><td>Used to weigh SDS and NaOH pellets for preparation of cleaning solution</td></tr><tr><td>Autosampler</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN5300</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Channel Oven</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN4020</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Crossflow Module</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>AF2000 MF Control Module</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Disposable Pipette Tips (1000 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf AG</td><td>ep T.I.P.S</td><td>Used to prepare diluted AuNP suspensions</td></tr><tr><td>Flasks (e.g. 2 liter volume)</td><td>neoLab</td><td>1-0199</td><td>Used for eluent storage</td></tr><tr><td>Focus Pump</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1131</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>VIA-002</td><td>Used for sample storage</td></tr><tr><td>Gold Nanoparticle Size Standards (20 nm, 40 nm, 80 nm, 100 nm)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaCal Gold</td><td>50 mg L-1 each, used to establish the size calibration function</td></tr><tr><td>Magnetic Stirrer</td><td>IKA</td><td>VIBRAX-VXR</td><td>Used to accelerate dissolution of SDS and NaOH pellets in UPW</td></tr><tr><td>Personal Computer (PC)</td><td>Dell Technologies</td><td>/</td><td>Unit to control AF4 runs, record and evaluate collected data, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td></tr><tr><td>Personal protection gear (gloves, lab coat, glasses etc.)</td><td>/</td><td>/</td><td>In accordance with respective laboratory&amp;rsquo;s safety rules for working with chemicals including engineered nanomaterials</td></tr><tr><td>Screw Top for Glass Vials (e.g. 1.5 mL volume)</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Z-VIA-09150868</td><td>Used for sample storage</td></tr><tr><td>Sodium Dodecyl Sulfate (SDS), &amp;ge;99 %, Blotting Grade</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; Co KG</td><td>2326.1</td><td>Used for the preparation of the cleaning solution</td></tr><tr><td>Sodium Hydroxide (NaOH) Pellets, &amp;ge;98 %, p.a</td><td>Carl Roth GmbH &amp;amp; Co KG</td><td>6771.1</td><td>Used for the preparation of the cleaning solution</td></tr><tr><td>Software Package for Control and Data Acquisition</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaFFF AF2000 Software</td><td>Software for performing Af4 runs and data aquisition, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova AF2000 manual</td></tr><tr><td>Software Package for Data Evaluation</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaAnalysis Software</td><td>Software for AF4 data evaluation, for necessary hardware and software requirements the reader is referred to the Postnova NovaAnalysis manual</td></tr><tr><td>Software Package for final Data Processing</td><td>OriginLab Corporation</td><td>Origin 2019</td><td>Used for final data processing</td></tr><tr><td>Solvent Degasser</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7520</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Solvent Selector</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7310</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Solvent Organizer</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN7140</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Surfactant Mixture</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>NovaChem100</td><td>Mixture of different surfactants and salts used for eluent preparation</td></tr><tr><td>Tip Pump</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN1130</td><td>Component of the AF2000 MF - MultiFlow FFF setup, which is described as AF4-system in the manuscript</td></tr><tr><td>Unknown AuNP sample</td><td>BBI Solutions</td><td>EM.GC60</td><td>60 nm AuNP sample used for size determination via size calibration function</td></tr><tr><td>UV-vis Detector</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>PN3211</td><td>UV-vis detector For downstream coupling with the AF4 system</td></tr><tr><td>Vacuum Filtration Unit</td><td>Postnova Analytics GmbH</td><td>Eluent Filtration System</td><td>Used to ensure low particle backgrounds and removal of dissolved air in the used eluents to ensure optimum AF4 fractionation conditions</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>IKA</td><td>Vortex Genie 2</td><td>Used for homogenization of diluted AuNP suspensions</td></tr><tr><td>Water Purification System</td><td>Merck Millipore</td><td>Milli-Q Integral 5</td><td>Used to generate ultrapure water (UPW, 18.2 M&amp;Omega;cm resistivity) for preparation of cleaning solution, eluents and dilution of AuNP suspensions</td></tr></tbody></table>

asymmetrical flow field-flow fractionation for sizing of gold nanoparticles in suspension

La dimensione delle particelle è probabilmente il parametro fisico-chimico più importante associato alla nozione di nanoparticella. Una conoscenza precisa delle dimensioni e della distribuzione delle dimensioni delle nanoparticelle è della massima importanza per varie applicazioni. Anche l'intervallo di dimensioni è importante, in quanto definisce il componente più "attivo" di una dose di nanoparticelle.
Il frazionamento asimmetrico campo-flusso di flusso (AF4) è una potente tecnica per il dimensionamento delle particelle in sospensione nell'intervallo di dimensioni di circa 1-1000 nm. Esistono diversi modi per ricavare informazioni sulle dimensioni da un esperimento AF4. Oltre ad associare AF4 online a rivelatori sensibili alle dimensioni basati sui principi dello scattering della luce multi-angolo o dello scattering dinamico della luce, c'è anche la possibilità di correlare le dimensioni di un campione con il suo tempo di ritenzione utilizzando un approccio teorico ben consolidato (teoria FFF) o confrontandolo con i tempi di ritenzione di standard di dimensione delle particelle ben definiti (calibrazione delle dimensioni esterne).
Qui descriviamo lo sviluppo e la convalida interna di una procedura operativa standard (SOP) per il dimensionamento di un campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto da AF4 accoppiato con il rilevamento UV-vis utilizzando la calibrazione delle dimensioni esterne con standard di nanoparticelle d'oro nell'intervallo di dimensioni di 20-100 nm. Questa procedura fornisce una descrizione dettagliata del flusso di lavoro sviluppato, tra cui la preparazione del campione, la configurazione e la qualificazione dello strumento AF4, lo sviluppo del metodo AF4 e il frazionamento del campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto, nonché la correlazione dei risultati ottenuti con la calibrazione delle dimensioni esterne stabilita. Il SOP qui descritto è stato infine convalidato con successo nel quadro di uno studio di confronto interlaboratorio che evidenzia l'eccellente robustezza e affidabilità di AF4 per il dimensionamento di campioni di nanoparticolati in sospensione.

In primo luogo, gli standard di dimensione AuNP sono stati frazionati da AF4 e rilevati da UV-vis che misurano l'assorbanza dell'AuNP ad una lunghezza d'onda di 532 nm (risonanza plasmonica superficiale dell'AuNP). Una sovrapposizione dei fractogrammi ottenuti è presentata nella figura 1. I tempi di ritenzione di ciascun AuNP al rispettivo massimo UV-vis ottenuto dalle misurazioni del triplice copia sono elencati nella tabella 5. La deviazione standard relativa di tutti i tempi di ritenzione era inferiore all'1,1% con una varianza di misura decrescente con dimensioni crescenti. Nel complesso, è stata raggiunta un'eccellente ripetibilità. Fu applicata una forza di separazione costante, che portò ad una relazione lineare tra tempo di eluizione e dimensione idrodinamica. La linea di calibrazione delle dimensioni esterne è stata stabilita tracciando il raggio idrodinamico specificato rispetto al tempo vuoto corretto per il tempo di eluizione (tempo di ritenzione netto). Un'analisi di regressione lineare ha portato a una funzione di calibrazione lineare con un'intercetta a = -3,373 nm ± 1,716 nm e una pendenza b = 1,209 nm-min-1 ± 0,055 nm-min-1. Il comportamento lineare dell'eluizione è stato confermato con un coefficiente di correlazione al quadrato R2 di 0,9958. La rispettiva funzione di calibrazione viene visualizzata visivamente nella figura 2.
La seconda parte si è occupata dell'analisi del campione aunp sconosciuto. Tre aliquote del campione sono state preparate secondo la procedura descritta nella sezione relativa al protocollo (sezione 4.2). Ognuna delle tre aliquote è stata studiata in triplice copia utilizzando lo stesso metodo di frazionamento AF4 che è stato applicato anche per gli standard di dimensione AuNP. Tutti i nove fractogrammi AF4-UV-vis ottenuti del campione AuNP sconosciuto sono presentati nella figura 3 e le rispettive valutazioni sono riassunte nella tabella 6. La deviazione standard relativa dei rispettivi tempi di ritenzione è stata significativamente bassa e variava tra lo 0,1% e lo 0,5%. Utilizzando la funzione di calibrazione delle dimensioni delle particelle ottenuta dal frazionamento degli standard di dimensione AuNP e correlandolo con i tempi di ritenzione ottenuti del campione AuNP sconosciuto al picco UV-vis massimo, è stato possibile calcolare un raggio idrodinamico medio complessivo di 29,4 nm ± 0,2 nm. Inoltre, è stato ottenuto un ragionevole recupero di massa dell'83,1% ± l'1,2% che non indica un agglomerato o una dissoluzione significativi del campione AuNP o un notevole assorbimento di particelle sulla superficie della membrana. La figura 4 mostra la distribuzione delle dimensioni delle particelle ottenuta con tutte e nove le tracce di segnale UV-vis mediate evidenziando l'eccellente robustezza del metodo AF4 applicato.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig01.jpg"> Figura 1: Fractogrammi AF4-UV-vis ottenuti dall'analisi triplicata dei quattro singoli standard di calibrazione delle dimensioni AuNP con intensità del segnale normalizzate e portata trasversale costante applicata (linea nera). Il picco di vuoto è evidenziato in grigio a circa 5,9 <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig01large.jpg" target="_blank">minuti. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig02.jpg"> Figura 2: Funzione di calibrazione delle dimensioni esterne ottenuta, comprese le barre di errore derivate dalle rispettive deviazioni standard delle misurazioni DLS (tabella 4) e le varianze nei tempi di ritenzione AF4 ottenuti (Tabella 5), dopo aver tracciato il raggio idrodinamico specificato rispetto al tempo di ritenzione di ogni singolo standard di calibrazione delle dimensioni AuNP al rispettivo picco massimo. Una funzione di calibrazione lineare con errori standard sotto forma di y = a + bx con a = -3,373 nm ± 1,716 nm e b = 1,209 nm·min-1 ± 0,055 nm·min-1 è stata calcolata da un'analisi di regressione lineare. È stato determinato un coefficiente di correlazione al quadrato con R2 = 0,9958, che indica una relazione lineare. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig03.jpg"> Figura 3: Fractogrammi AF4-UV-vis di misurazioni triplicate di tre aliquote che mostrano l'AuNP sconosciuto. La portata trasversale costante applicata nel tempo di misurazione è illustrata come una linea nera. Il picco di vuoto a circa 5,9 minuti è evidenziato in grigio. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61757/61757fig04.jpg"> Figura 4: Sovrapposizione della distribuzione media delle dimensioni delle particelle ottenuta (rosso) del campione AuNP sconosciuto e della funzione di calibrazione lineare applicata (linea tratteggiata). <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61757/61757fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Componente</td>
			<td>Cas-No</td>
			<td>Peso (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acqua</td>
			<td>7732-18-5</td>
			<td>88.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Acido 9-ottadecenoico (Z)-, composto con 2,2',2''-nitrilotris[etanolo](1:1)</td>
			<td>2717-15-9</td>
			<td>3.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Carbonato di sodio</td>
			<td>497-19-8</td>
			<td>2.7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Alcoli, C12-14-secondari, etossilati</td>
			<td>84133-50-6</td>
			<td>1.8</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">EDTA tetrasodico</td>
			<td>64-02-8</td>
			<td>1.4</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Polietilenglicole</td>
			<td>25322-68-3</td>
			<td>0.9</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Oleato di sodio</td>
			<td>143-19-1</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Bicarbonato di sodio</td>
			<td>144-55-8</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1 : La commissione per i dati Elenco dei componenti della miscela di tensioattivi utilizzati per preparare l'eluente (vedere anche Tabella dei materiali).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parametri AF4-UV-vis</td>
			<td>Unità</td>
			<td>Valore</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spessore distanziale</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata del rivelatore</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata incrociata</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0 (costante per 8 min)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata di messa a fuoco</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di ritardo /tempo di stabilizzazione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata di iniezione</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di transizione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di iniezione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase di eluizione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Risciacquare il tempo di passaggio</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Velocità di flusso del passo di risciacquo</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume di iniezione</td>
			<td>Μl</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentrazione del campione</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo di membrana</td>
			<td></td>
			<td>Cellulosa rigenerata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taglio del peso molecolare della membrana</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluente</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) miscela di tensioattivi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lunghezza d'onda UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilità UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 2 : La commissione per i dati Riepilogo dei parametri del metodo di frazionamento AF4-UV-vis per eseguire l'iniezione diretta senza applicazione di una forza di separazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Parametri AF4-UV-vis</td>
			<td>Unità</td>
			<td>Valore</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spessore distanziale</td>
			<td>Μm</td>
			<td>350</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata del rivelatore</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata incrociata</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1 (60 min costanti, 10 min lineari)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata di messa a fuoco</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>1.3</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di ritardo /tempo di stabilizzazione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Portata di iniezione</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di transizione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tempo di iniezione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fase di eluizione</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>70 (60 min costanti, 10 min lineari)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Passaggio di risciacquo</td>
			<td>Minimo</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Velocità di flusso del passo di risciacquo</td>
			<td>mL min-1
</td>
			<td>0.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume di iniezione</td>
			<td>Μl</td>
			<td>50</td>
		</tr>
<tr>
<td>Concentrazione del campione</td>
			<td>mg L-1
</td>
			<td>12.5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tipo di membrana</td>
			<td></td>
			<td>Cellulosa rigenerata</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taglio del peso molecolare della membrana</td>
			<td>Kda</td>
			<td>10</td>
		</tr>
<tr>
<td>Eluente</td>
			<td></td>
			<td>0,025% (v/v) miscela di tensioattivi</td>
		</tr>
<tr>
<td>Lunghezza d'onda UV-vis</td>
			<td>Nm</td>
			<td>532</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sensibilità UV-vis</td>
			<td>-</td>
			<td>0.001</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 3 : La commissione per i dati Riepilogo dei parametri del metodo di frazionamento AF4-UV-vis per eseguire l'esecuzione del frazionamento con l'applicazione di un flusso incrociato come forza di separazione.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standard di calibrazione</td>
			<td>Agente di tappatura</td>
			<td>Dimensione media (TEM) (nm)</td>
			<td>CV (dimensione media TEM) (%)</td>
			<td>Potenziale zeta (mV)</td>
			<td>SD (potenziale zeta) (mV)</td>
			<td>Raggio idrodinamico (DLS) (nm)</td>
			<td>SD (Raggio idrodinamico) (nm)</td>
			<td>Pdi</td>
			<td>SD (PDI)</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 20 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>20.1</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-48.9</td>
			<td>1.5</td>
			<td>10.95</td>
			<td>0.12</td>
			<td>0.082</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 40 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>40.8</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-30.4</td>
			<td>1.0</td>
			<td>20.30</td>
			<td>0.13</td>
			<td>0.127</td>
			<td>0.006</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 80 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>79.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-51.5</td>
			<td>1.3</td>
			<td>38.85</td>
			<td>0.23</td>
			<td>0.138</td>
			<td>0.013</td>
		</tr>
<tr>
<td>AuNP 100 nm</td>
			<td>Citrato</td>
			<td>102.2</td>
			<td>≤ 8</td>
			<td>-50.9</td>
			<td>0.9</td>
			<td>52.30</td>
			<td>0.37</td>
			<td>0.078</td>
			<td>0.009</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 4 : La commissione per i dati Riepilogo dei parametri fisico-chimici degli standard di calibrazione AuNP applicati, tra cui agente tappante, dimensione media TEM, potenziale Zeta determinato nella sospensione nativa così come raggio idrodinamico DLS e indice di polidispersità (PDI) determinato nell'eluente.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Standard di calibrazione</td>
			<td>Correre</td>
			<td>Tempo di ritenzione al massimo massimo (min)</td>
			<td>Tempo di ritenzione netto al massimo massimo (min)</td>
			<td>Tempo medio di ritenzione netta (min)</td>
			<td>DS (%) (tempo di conservazione netto)</td>
			<td>SD (min) (tempo di ritenzione netto)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 20 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>17.368</td>
			<td>11.468</td>
			<td rowspan="3">11.56</td>
			<td rowspan="3">1.02</td>
			<td rowspan="3">0.12</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>17.409</td>
			<td>11.509</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>17.589</td>
			<td>11.689</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 40 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>25.316</td>
			<td>19.416</td>
			<td rowspan="3">19.49</td>
			<td rowspan="3">0.68</td>
			<td rowspan="3">0.13</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>25.32</td>
			<td>19.42</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>25.548</td>
			<td>19.648</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 80 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>42.095</td>
			<td>36.195</td>
			<td rowspan="3">36.29</td>
			<td rowspan="3">0.23</td>
			<td rowspan="3">0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>42.219</td>
			<td>36.319</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>42.257</td>
			<td>36.357</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">AuNP 100 nm</td>
			<td>1</td>
			<td>50.975</td>
			<td>45.075</td>
			<td rowspan="3">45.06</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">0.03</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>50.924</td>
			<td>45.024</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>50.986</td>
			<td>45.086</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 5 : La commissione per i dati Tempi di ritenzione degli standard di calibrazione AuNP al rispettivo picco UV-Vis massimo derivato dai rispettivi fractogrammi AF4-UV-vis utilizzando il metodo descritto nella tabella 3.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Aliquote</td>
			<td>Correre</td>
			<td>Tempo di ritenzione massimo (min)</td>
			<td>Tempo medio di ritenzione al massimo massimo (min)</td>
			<td>Tempo di ritenzione netto al massimo massimo (min)</td>
			<td>DS (%) tempo di conservazione</td>
			<td>Raggio idrodinamico (nm)</td>
			<td>Recupero (%)</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">1</td>
			<td>1</td>
			<td>32.689</td>
			<td rowspan="3">32.70</td>
			<td>26.789</td>
			<td rowspan="3">0.07</td>
			<td rowspan="3">29.03</td>
			<td rowspan="3">85.34</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>32.687</td>
			<td>26.787</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>32.719</td>
			<td>26.819</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">2</td>
			<td>1</td>
			<td>32.989</td>
			<td rowspan="3">33.08</td>
			<td>27.089</td>
			<td rowspan="3">0.37</td>
			<td rowspan="3">29.49</td>
			<td rowspan="3">81.73</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.073</td>
			<td>27.173</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.187</td>
			<td>27.287</td>
		</tr>
<tr>
<td rowspan="3">3</td>
			<td>1</td>
			<td>33.053</td>
			<td rowspan="3">33.14</td>
			<td>27.153</td>
			<td rowspan="3">0.49</td>
			<td rowspan="3">29.56</td>
			<td rowspan="3">82.14</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>33.071</td>
			<td>27.171</td>
		</tr>
<tr>
<td>3</td>
			<td>33.291</td>
			<td>27.391</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 6 : La commissione per i dati Riepilogo dei tempi di ritenzione al rispettivo picco UV-Vis massimo, del raggio idrodinamico calcolato dalla calibrazione delle dimensioni esterne (Figura 2) e del tasso di recupero del campione AuNP sconosciuto ottenuto dall'analisi AF4-UV-vis.

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Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation for Sizing of Gold Nanoparticles in Suspension

Questo protocollo descrive l'uso del frazionamento campo-flusso di flusso asimmetrico accoppiato con il rilevamento UV-vis per la determinazione delle dimensioni di un campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto.

Frazionamento asimmetrico del flusso campo-flusso per il dimensionamento delle nanoparticelle d'oro in sospensione

Particle size is arguably the most important physico-chemical parameter associated with the notion of a nanoparticle. Precise knowledge of the size and ...

asymmetrical-flow-field-flow-fractionation-for-sizing-gold

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.1K Views.  Postnova Analytics GmbH. Questo protocollo descrive l'uso del frazionamento campo-flusso di flusso asimmetrico accoppiato con il rilevamento UV-vis per la determinazione delle dimensioni di un campione di nanoparticelle d'oro sconosciuto.

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Fabrication, Operation and Flow Visualization in Surface-acoustic-wave-driven Acoustic-counterflow Microfluidics

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we present the fabrication protocol for a multilayered SAW acoustic counterflow device. The device is fabricated starting from a lithium niobate (LN) substrate onto which two interdigital transducers (IDTs) and appropriate markers are patterned. A polydimethylsiloxane (PDMS) channel cast on an SU8 master mold is finally bonded on the patterned substrate. Following the fabrication procedure, we show the techniques that allow the characterization and operation of the acoustic counterflow device in order to pump fluids through the PDMS channel grid. We finally present the procedure to visualize liquid flow in the channels. The protocol is used to show on-chip fluid pumping under different flow regimes such as laminar flow and more complicated dynamics characterized by vortices and particle accumulation domains.

In this video we first describe fabrication and operation procedures of a surface acoustic wave (SAW) acoustic counterflow device. We then demonstrate an experimental setup that allows for both qualitative flow visualization and quantitative analysis of complex flows within the SAW pumping device.

Fabbricazione, il funzionamento e la visualizzazione del flusso in superficiali acustiche onda-driven Microfluidics Acoustic-controcorrente

Surface acoustic waves (SAWs) can be used to drive liquids in portable microfluidic chips via the acoustic counterflow phenomenon. In this video we ...

Ricerca

Ingegneria

Confocal Imaging of Confined Quiescent and Flowing Colloid-polymer Mixtures

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed assembly1-3, drug delivery4, improved hydrocarbon recovery5-7, and flowable electrodes for energy storage8. Suspensions containing fluorescent colloids and non-adsorbing polymers are appealing model systems, as the ratio of the polymer radius of gyration to the particle radius&#160;and concentration of polymer control the range and strength of the interparticle attraction, respectively. By tuning the polymer properties and the volume fraction of the colloids, colloid fluids, fluids of clusters, gels, crystals, and glasses can be obtained9.&#160;Confocal microscopy, a variant of fluorescence microscopy, allows an optically transparent and fluorescent sample to be imaged with high spatial and temporal resolution in three dimensions. In this technique, a small pinhole or slit blocks the emitted fluorescent light from regions of the sample that are outside the focal volume of the microscope optical system. As a result, only a thin section of the sample in the focal plane is imaged. This technique is particularly well suited to probe the structure and dynamics in dense colloidal suspensions at the single-particle scale: the particles are large enough to be resolved using visible light and diffuse slowly enough to be captured at typical scan speeds of commercial confocal systems10. Improvements in scan speeds and analysis algorithms have also enabled quantitative confocal imaging of flowing suspensions11-16,37.&#160;In this paper, we demonstrate confocal microscopy experiments to probe the confined phase behavior and flow properties of colloid-polymer mixtures. We first prepare colloid-polymer mixtures that are density- and refractive-index matched. Next, we report a standard protocol for imaging quiescent dense colloid-polymer mixtures under varying confinement in thin wedge-shaped cells. Finally, we demonstrate a protocol for imaging colloid-polymer mixtures during microchannel flow.

Confocal microscopy is used to image quiescent and flowing colloid-polymer mixtures, which are studied as model systems for attractive suspensions. Image analysis algorithms are used to calculate structural and dynamic metrics for the colloidal particles that measure changes due to geometric confinement.

Imaging confocale di confinati riposo e fluenti miscele colloidali e polimeri

The behavior of confined colloidal suspensions with attractive interparticle interactions is critical to the rational design of materials for directed ...

Chimica

Millifluidics for Chemical Synthesis and Time-resolved Mechanistic Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the first, synthesis of ultra-small copper nanoclusters is described. The second example provides their utility for investigating time resolved kinetics of chemical reactions by analyzing gold nanoparticle formation using in situ X-ray absorption spectroscopy. The final example demonstrates continuous flow catalysis of reactions inside millifluidic channel coated with nanostructured catalyst.

Millifluidic devices are utilized for controlled synthesis of nanomaterials, time-resolved analysis of reaction mechanisms and continuous flow catalysis.

Millifluidics per sintesi chimica e risolte nel tempo meccanicistici Studies

Procedures utilizing millifluidic devices for chemical synthesis and time-resolved mechanistic studies are described by taking three examples. In the ...

Bioingegneria

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a microfluidic chamber assembled in the specimen holder for Transmission Electron Microscopy (TEM) and STEM. The microfluidic system consists of two silicon microchips supporting thin Silicon Nitride (SiN) membrane windows. This article describes the basic steps of sample loading and data acquisition. Most important of all is to ensure that the liquid compartment is correctly assembled, thus providing a thin liquid layer and a vacuum seal. This protocol also includes a number of tests necessary to perform during sample loading in order to ensure correct assembly. Once the sample is loaded in the electron microscope, the liquid thickness needs to be measured. Incorrect assembly may result in a too-thick liquid, while a too-thin liquid may indicate the absence of liquid, such as when a bubble is formed. Finally, the protocol explains how images are taken and how dynamic processes can be studied. A sample containing AuNPs is imaged both in pure water and in saline.

This protocol describes the operation of a liquid flow specimen holder for scanning transmission electron microscopy of AuNPs in water, as used for the observation of nanoscale dynamic processes.

Lo studio dei processi dinamici di dimensioni nano oggetti in liquidi di utilizzare la scansione microscopia elettronica a trasmissione

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

The Diffusion of Passive Tracers in Laminar Shear Flow

A simple method to experimentally observe and measure the dispersion of a passive tracer in a laminar fluid flow is described. The method consists of first injecting fluorescent dye directly into a pipe filled with distilled water and allowing it to diffuse across the cross-section of the pipe to obtain a uniformly distributed initial condition. Following this period, the laminar flow is activated with a programmable syringe pump to observe the competition of advection and diffusion of the tracer through the pipe. Asymmetries in the tracer distribution are studied and correlations between the pipe cross-section and the shape of the distribution is shown: thin channels (aspect ratio &#60;&#60; 1) produce tracers arriving with sharp fronts and tapering tails (front-loaded distributions), while thick channels (aspect ratio ~1) present the opposite behavior (back-loaded distributions). The experimental procedure is applied to capillary tubes of various geometries and is particularly relevant to microfluidic applications by dynamical similarity.

A protocol for the study of the diffusion of passive tracers in laminar pressure-driven flow is presented. The procedure is applicable to various capillary pipe geometries.

La diffusione dei rivelatori passivi nel flusso laminare Shear

A simple method to experimentally observe and measure the dispersion of a passive tracer in a laminar fluid flow is described. The method consists of ...

Microfluidic Buffer Exchange for Interference-free Micro/Nanoparticle Cell Engineering

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic properties, enable bio imaging and control cell phenotype. A critical yet inadequately addressed issue is the significant number of particles that remain unbound after cell labeling which cannot be readily removed by conventional centrifugation. This leads to an increase in bio imaging background noise and can impart transformative effects onto neighboring non-target cells. In this protocol, we present an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy termed as Dean Flow Fractionation (DFF) to efficiently separate labeled cells from free NPs in a high throughput manner. The developed spiral microdevice facilitates continuous collection (&#62;90% cell recovery) of purified cells (THP-1 and MSCs) suspended in new buffer solution, while achieving &#62;95% depletion of unbound fluorescent dye or dye-loaded NPs (silica or PLGA). This single-step, size-based cell purification strategy enables high cell processing throughput (106 cells/min) and is highly useful for large-volume cell purification of micro/nanoparticle engineered cells to achieve interference-free clinical application.

This protocol describes the use of an inertial microfluidics-based buffer exchange strategy to purify micro/nanoparticle engineered cells with efficient depletion of unbound particles.

Scambio Buffer Microfluidic per senza interferenze micro / nanoparticelle cellulare Ingegneria

Engineering cells with active-ingredient-loaded micro/nanoparticles (NPs) is becoming an increasingly popular method to enhance native therapeutic ...

Nanoparticle Tracking Analysis of Gold Nanoparticles in Aqueous Media through an Inter-Laboratory Comparison

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). Characterization needs to be thorough and the technique chosen should be well-suited to the property to be determined, the material being analyzed and the medium in which it is present. Furthermore, the instrument operation and methodology need to be well-developed and clearly understood by the user to avoid data collection errors. Any discrepancies in the applied method or procedure can lead to differences and poor reproducibility of obtained data. This paper aims to clarify the method to measure the hydrodynamic diameter of gold nanoparticles by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). This study was carried out as an inter-laboratory comparison (ILC) amongst seven different laboratories to validate the standard operating procedure&#8217;s performance and reproducibility. The results obtained from this ILC study reveal the importance and benefits of detailed standard operating procedures (SOPs), best practice updates, user knowledge, and measurement automation.

The protocol described here aims to measure the hydrodynamic diameter of spherical nanoparticles, more specifically gold nanoparticles, in aqueous media by means of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA). The latter involves tracking the movement of particles due to Brownian motion and implementing the Stokes-Einstein equation to obtain the hydrodynamic diameter.

Analisi del tracciamento delle nanoparticelle di nanoparticelle d'oro nei media acquosi attraverso un confronto tra laboratori

In the field of nanotechnology, analytical characterization plays a vital role in understanding the behavior and toxicity of nanomaterials (NMs). ...

Gold Nanoparticle Synthesis

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of tetrachloroauric acid in 3.0 g (3.7 mmol, 3.6 mL) of oleylamine (technical grade) and 3.0 mL of toluene into a boiling solution of 5.1 g (6.4 mmol, 8.7 mL) of oleylamine in 147 mL of toluene. While boiling and mixing the reaction solution for 2 hours, the color of the reaction mixture changed from clear, to light yellow, to light pink, and then slowly to dark red. The heat was then turned off, and the solution was allowed to gradually cool down to room temperature for 1 hour. The gold nanoparticles were then collected and separated from the solution using a centrifuge and washed three times; by vortexing and dispersing the gold nanoparticles in 10 mL portions of toluene, and then precipitating the gold nanoparticles by adding 40 mL portions of methanol and spinning them in a centrifuge. The solution was then decanted to remove any remaining byproducts and unreacted starting materials. Drying the gold nanoparticles in a vacuum environment produced a solid black pellet; which could be stored for long periods of time (up to one year) for later use, and then redissolved in organic solvents such as toluene.

A protocol for synthesizing ~12 nm diameter gold nanoparticles (Au nanoparticles) in an organic solvent is presented. The gold nanoparticles are capped with oleylamine ligands to prevent agglomeration. The gold nanoparticles are soluble in organic solvents such as toluene.

Sintesi della nanoparticella d'oro

Gold nanoparticles (Au nanoparticles) that are ~12 nm in diameter were synthesized by rapidly injecting a solution of 150 mg (0.15 mmol) of ...

Optimization of Flow Cytometric Sorting Parameters for High-Throughput Isolation and Purification of Small Extracellular Vesicles

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the physiological and pathological state of a cell. However, there is no standard method for sEV isolation, which prevents downstream biomarker identification and drug intervention studies. In this article, we provide a detailed protocol for the isolation and purification of 50-200 nm sEV by a flow cell sorter. For this, a 50 &#181;m nozzle and 80 psi sheath fluid pressure were selected to obtain a good sorting rate and stable side stream. Standard sized polystyrene microspheres were used to locate populations of 100, 200, and 300 nm particles. With additional optimization of the voltage, gain, and forward scatter (FSC) triggering threshold, the sEV signal could be separated from the background noise. These optimizations provide a panel of critical sort settings that enables one to obtain a representative population of sEV using FSC vs. side scatter (SSC) only. The flow cytometry-based isolation method not only allows for high-throughput analysis but also allows for synchronous classification or proteome analysis of sEV based on the biomarker expression, opening numerous downstream research applications.

This protocol provides a rapid and size-specific isolation method for small extracellular vesicles by optimizing the size of the air spray nozzle, sheath fluid pressure, sample flow pressure, voltage, gain, and triggering threshold parameters.

Ottimizzazione dei parametri di selezione citometrica a flusso per l'isolamento e la purificazione ad alta produttività di piccole vescicole extracellulari

Small extracellular vesicles (sEV) can be released from all cell types and carry protein, DNA, and RNA. Signaling molecules serve as indicators of the ...

Biochimica

Tangential Flow Ultrafiltration: A  &ldquo;Green&rdquo; Method for the Size Selection and Concentration of Colloidal Silver Nanoparticles

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to their powerful antimicrobial properties.3-6 These nanoparticle applications are strongly influenced by the AgNP size and aggregation state. Many challenges exist in the controlled fabrication7 and size-based isolation4,8 of unfunctionalized, homogenous AgNPs that are free from chemically aggressive capping/stabilizing agents or organic solvents.7-13 Limitations emerge from the toxicity of reagents, high costs or reduced efficiency of the AgNP synthesis or isolation methods (e.g., centrifugation, size-dependent solubility, size-exclusion chromatography, etc.).10,14-18 To overcome this, we recently showed that TFU permits greater control over the size, concentration and aggregation state of Creighton AgNPs (300 ml of 15.3 &mu;g ml-1 down to 10 ml of 198.7 &mu;g ml-1) than conventional methods of isolation such as ultracentrifugation.19
TFU is a recirculation method commonly used for the weight-based isolation of proteins, viruses and cells.20,21 Briefly, the liquid sample is passed through a series of hollow fiber membranes with pore size ranging from 1,000 kD to 10 kD. Smaller suspended or dissolved constituents in the sample will pass through the porous barrier together with the solvent (filtrate), while the larger constituents are retained (retentate). TFU may be considered a "green" method as it neither damages the sample nor requires additional solvent to eliminate toxic excess reagents and byproducts. Furthermore, TFU may be applied to a large variety of nanoparticles as both hydrophobic and hydrophilic filters are available.
The two main objectives of this study were: 1) to illustrate the experimental aspects of the TFU approach through an invited video experience and 2) to demonstrate the feasibility of the TFU method for larger volumes of colloidal nanoparticles and smaller volumes of retentate. First, unfuctionalized AgNPs (4 L, 15.2 &mu;g ml-1) were synthesized using the well-established Creighton method22,23 by the reduction of AgNO3 with NaBH4. AgNP polydispersity was then minimized via a 3-step TFU using a 50-nm filter (460 cm2) to remove AgNPs and AgNP-aggregates larger than 50 nm, followed by two 100-kD (200 cm2 and 20 cm2) filters to concentrate the AgNPs. Representative samples were characterized using transmission electron microscopy, UV-Vis absorption spectrophotometry, Raman spectroscopy, and inductively coupled plasma optical emission spectroscopy. The final retentate consisted of highly concentrated (4 ml, 8,539.9 &mu;g ml-1) yet lowly aggregated and homogeneous AgNPs of 1-20 nm in diameter. This corresponds to a silver concentration yield of about 62%.

Tangential flow ultrafiltration (TFU) is a recirculation method used for the weight-based separation of biosamples. TFU was adapted to size-select (1-20 nm diameter) and highly concentrate a large volume of polydisperse silver nanoparticles (4 L of 15.2 &mu;g ml-1 down to 4 ml of 8,539.9 &mu;g ml-1) with minimal aggregation.

Flusso tangenziale Ultrafiltrazione: un metodo &quot;verde&quot; per la selezione del formato e la concentrazione di nanoparticelle di argento colloidale

Nowadays, AgNPs are extensively used in the manufacture of consumer products,1 water disinfectants,2 therapeutics,1, 3 and biomedical devices4 due to ...