Questo lavoro è finanziato dal progetto DELL'UE PATROLS (Physiologically Anchored Tools for Realistic nanomaterial hazard aSsessment) e dal Ministero olandese della Salute, del Benessere e dello Sport (progetto V/050012). Vorremmo ringraziare la Dott.ssa Yvonne Staal e il Dr. Jan van Benthem per aver esaminato criticamente il manoscritto.

1. Preparazione del supporto di coltura cellulare (CCM)
<ol><li>Preparare una bottiglia da 500 ml di mezzo essenziale minimo (MEM) integrata con glutammina.</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di penicillina-streptomicina (cioè 100 U/mL di penicillina e 100 μg/mL di streptomicina).</li>
	<li>Aggiungere 5 mL di soluzione di amminoacidi non essenziali (NEAA).</li>
	<li>Aggiungere 10 mL di ampotericina B (opzionale).</li>
	<li>Aggiungere 50 mL di FBS (inattivato dal calore, seguire il protocollo ATCC per l'inattivazione del calore; (https://www.atcc.org/~/media/PDFs/Culture%20Guide/AnimCellCulture_Guide.ashx, pagina 19)).</li>
</ol>2. Sottocultura delle cellule calu-3
NOTA: Le cellule Calu-3 sono coltivate in contenitori di coltura cellulare T75 o T175 a 37 °C e al 5% di CO2. Le cellule vengono passaggio al 60-80% di confluenza ogni 7 giorni con rinnovo ccm ogni 2-3 giorni. CCM viene versato e CCM fresco (T25 = 5 mL, T75 = 15 mL e T175 = 25 mL) viene pipettato nel pallone e il pallone viene riposto nell'incubatore. Le cellule devono essere passaggio almeno 2 volte dopo lo scongelamento, prima dell'uso negli esperimenti o prima del congelamento, e devono essere passaggio non più di 25 volte in totale.
<ol><li>Verificare se il pallone è confluente al 60-80% controllando al microscopio luminoso.</li>
	<li>Versare il CCM dal pallone.</li>
	<li>Lavare le cellule 2 volte con 5 mL di 1x Hanks's Balanced Salt Solution (HBSS) senza calcio e senza magnesio. Scartare l'HBSS dopo ogni lavaggio. HBSS rimuove il siero, che inibisce la tripside.</li>
	<li>Aggiungere 3 ml di tripside-EDTA per un T75 (4 mL per un T175) e riposizionare il pallone nell'incubatore a 37 °C e 5% di CO2 per 10-15 min. Controllare dopo 10 minuti, assicurandosi che le cellule si siano staccate dalla superficie del pallone. Nel caso in cui le cellule siano coltivate fino a >80% di confluenza, non si staccano usando tripina 0,05% e potrebbe essere utilizzata tripina 0,25%.</li>
	<li>Aggiungere 6 mL (cioè raddoppiare il volume trypsin-EDTA originariamente aggiunto) di CCM al pallone e scuotere delicatamente i contenitori per garantire una corretta miscelazione. Questo per garantire che la tripina sia stata neutralizzata dall'FBS nel CCM e la sua attività sulle cellule si sia fermata. Se la tripina può rimanere a contatto con le cellule per troppo tempo, non si riattaccano quando vengono messe in un nuovo pallone di coltura cellulare.</li>
	<li>Versare il contenuto completo del pallone in un tubo di centrifuga da 50 ml.</li>
	<li>Centrifugare le cellule per 5 min a 130 x g,assicurando che la centrifuga sia correttamente bilanciata.</li>
	<li>Riportare la fiala contenente le cellule in condizioni asettiche e rimuovere delicatamente il supernatante, senza disturbare il pellet. Il supernatante può essere versato e il resto è stato sganciato, assicurando che il pellet non sia disturbato.</li>
	<li>Rimescolare il pellet cellulare in 1 mL di MCC tubazione su e giù fino a quando tutte le cellule non sono sospese (cioè non si osservano agglomerati di pellet o cellule). È possibile aggiungere CCM aggiuntivo per diluire la sospensione cellulare.</li>
	<li>Contare le cellule, sia morte che vive, in 1 mL di MCC usando un emocitometro. Se necessario per un corretto conteggio, diluire le cellule in 3 o 4 mL.</li>
	<li>Sospendere le celle nel volume CCM richiesto e aggiungere la sospensione cellulare in ogni pallone. Per ottenere circa l'80% di confluenza in una settimana, seminare 2 x 106 cellule in un T75 o 6 x 106 cellule in un T175.</li>
	<li>Dondolare delicatamente il pallone e quindi riposizionare nell'incubatrice a 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Sostituire con CCM fresco ogni 2-3 giorni e sottocultura quando le cellule raggiungono la confluenza del 60-80%.</li>
</ol>3. Semina di celle Calu-3 su inserti di coltura
NOTA: Gli inserti sono disponibili con diverse dimensioni dei pori. Le piccole dimensioni dei pori (ad esempio, 0,4 μm) hanno il vantaggio che le cellule crescono più facilmente e possono raggiungere una buona barriera già dopo 5 giorni di coltivazione in condizioni sommerse, come misurato dalla resistenza elettrica epiteliale trans (TEER). Tuttavia, quando sono interessati alla traslocazione delle particelle, questi pori sono troppo piccoli e intrappolano le particelle. Pertanto, le dimensioni dei pori più grandi (ad esempio, 3 μm) sono solitamente scelte per testare le particelle. Quando si utilizza una dimensione dei pori più grande, le cellule hanno bisogno di periodi di tempo più lunghi (ad esempio, 7-10 giorni di coltivazione in condizioni sommerse) per ottenere un buon TEER.
<ol><li>Preparare la sospensione cellulare con concentrazione nota seguendo i passaggi 2.1–2.10.</li>
	<li>Diluire le cellule a una concentrazione di 5 x 105 celle/mL in CCM prebellico per 6 inserti di pozzi o 2,5 x 105 celle/mL per 12 inserti di pozzi.</li>
	<li>Prendere una piastra di coltura cellulare con inserti e posizionare in condizioni asettiche.</li>
	<li>Riempire il lato basolaterale con 2 mL di CCM prebellico per 6 inserti di pozzo, o 1 mL per 12 inserti di pozzo. Durante l'aggiunta del supporto di coltura, esettare l'inserto utilizzando una pinzetta.</li>
	<li>Mescolare con cura la sospensione cellulare pipettando su e giù. Pipetta 1,0 mL per 6 inserti di pozzo e 500 μL per 12 inserti di pozzi (equivalenti a 100.000 celle/cm2)sulla parte superiore dellamembrana nell'inserto di coltura cellulare con pori da 0,4 μm. Per i pori da 3,0 μm, aumentare la densità cellulare a 128.000 cellule/cm2.</li>
	<li>Coprire la piastra di coltura cellulare e incubare a 37 °C e 5% CO2.</li>
	<li>Modificare il CCM ogni 2-3 giorni.</li>
	<li>Lasciare che le cellule diventino confluenti per 7 giorni in condizioni sommerse prima di continuare a coltura all'ALI.</li>
	<li>Misurare TEER.<ol>
<li>Prendi un voltohmmetro epiteliale integrato con il set di elettrodi a bacchetta e carica il sistema di batterie durante la notte.</li>
		<li>Scollegare il Voltohmmeter dal caricabatterie e collegare l'elettrodo della bacchetta.</li>
		<li>Pulire l'elettrodo con il 70% di etanolo.</li>
		<li>Posizionare l'elettrodo nel CCM inserendo l'elettrodo più lungo nel supporto di coltura esterno fino a quando non tocca il fondo del piatto e mettendo l'elettrodo più corto nel supporto senza toccare la membrana.</li>
		<li>Iniziare con un inserto vuoto senza celle. Attendere che la misurazione si stabilizzi e annotare la resistenza in Ohm. Questa misurazione è la resistenza della membrana dell'inserto senza cellule (cioè resistenza al vuoto).</li>
		<li>Ripetere la misurazione per ogni inserto e sottrarre la resistenza del vuoto per ottenere la vera resistenza.</li>
		<li>Per l'analisi dei dati, moltiplicare i valori di resistenza per la superficie dell'inserto Ω x cm2. Per un inserto di 6 po', la superficie è di 4,67 cm2. Pertanto, se viene misurata una resistenza di 600 Ohm e lo sfondo è 120 Ohm, la resistenza è di 480 Ohm, che viene quindi moltiplicata per la superficie di 4,67 cm2 per un totale di 2.241,6 Ohm x cm2. Il TEER deve essere >1.000 Ω x cm2 per continuare.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimuovere il CCM dal lato apicico degli inserti.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di CCM prebellico per 6 pozza e 1 mL per 12 inserti di pozzo sul lato basolaterale del pozzo (cioè sotto l'inserto di coltura cellulare). Il CCM deve toccare la membrana dal basso, ma non perdere sulla parte superiore dell'inserto.</li>
	<li>A questo punto le cellule sono apicalmente esposte all'aria, che viene definita ristrutturazione all'ALI.</li>
	<li>Cellule di coltura presso l'ALI nell'incubatore a 37 °C e 5% CO2 per 7 giorni prima dell'esposizione.</li>
	<li>Cambiare il CCM basolaterale ogni 2-3 giorni. Le cellule possono essere utilizzate presso l'ALI per 6 settimane.</li>
</ol>4. Preparazione dell'impostazione dell'esposizione
NOTA: Le sezioni da 5 a 7 descrivono i preparati per l'esposizione alle particelle mediante una stazione di esposizione automatizzata (AES, vedi Tabella dei materiali). La configurazione per la nebulizzazione e la caratterizzazione delle particelle è anche compatibile con altri sistemi di esposizione ALI di altri produttori. Ad esempio, l'esposizione alle particelle è descritta di seguito. Tali sistemi possono anche essere utilizzati per altre esposizioni, come sensibilizzanti, fumo di sigaretta e scarico diesel. La figura 1 mostra l'AES e un modulo di esposizione. La figura 2 mostra una rappresentazione schematica dell'impostazione dell'esposizione, compresi tutti gli altri strumenti.
<ol><li>Prima di iniziare un'esposizione utilizzando l'AES, collegare il sistema a diversi strumenti per misurare le caratteristiche dell'aerosol; questi vengono misurati in un flusso laterale poco prima che gli aerosol entrino nell'armadio. NOTA: uno splitter di flusso viene utilizzato per collegare il flusso laterale all'apparecchiatura di caratterizzazione dell'esposizione. Generalmente, vengono utilizzate le seguenti apparecchiature: scanning mobility particle sizer (SMPS), optical particle sizer (OPS), condensation particle counter (CPC), tapered element oscillante microbalance (TEOM). Le misurazioni SMPS e OPS vengono eseguite 1 volte all'ora e utilizzano gli stessi tubi dello splitter di flusso. CPC e TEOM eseguono misurazioni continue e i dati di entrambi sono registrati su un data logger Squirrel model 2020. Inoltre, la concentrazione di massa gravimetrica viene determinata utilizzando un microbilanciamento nell'umidità relativa controllata (40-70%) temperatura (21-23 °C). I filtri in teflon vengono pesati prima e dopo ogni esposizione per confermare la concentrazione di esposizione. Per catturare lo scarico, viene utilizzato un filtro HEPA. La configurazione, comprese le sospensioni e il nebulizzatore in nanomateriale ingegnerizzati (ENM), è tutta posizionata in un armadio di flusso per prevenire qualsiasi esposizione alle persone. L'AES può essere utilizzato per testare molti tipi diversi di ENM, tra cui metalli e ossidi metallici.</li>
	<li>Preparare una sospensione di nanomateriali poco prima dell'esposizione. Di solito una sospensione dell'1% viene preparata come soluzione stock. Ad esempio, sospendere 100 mg di nanomateriale in 10 mL di acqua pura. NOTA: Per l'esposizione al DQ12, 300 mg vengono utilizzati per raggiungere circa 2 μg/cm2. Questa quantità può essere utilizzata in una singola esposizione o divisa su esposizioni ripetute (ad esempio, 300 mg sono sospesi in 30 mL per una singola esposizione o 21,5 mg sono sospesi in 2,15 mL appena al giorno per 3 settimane di esposizione ripetuta). La sospensione viene preparata al momento in ogni giorno di esposizione. La sospensione delle particelle viene sonicata per 16 minuti utilizzando la sonicazione della sonda. Il volume della soluzione stock dell'1% viene regolato in un volume totale di 100 mL aggiungendo acqua pura.</li>
	<li>Mettere la sospensione ENM in una piccola bottiglia con un tappo e un agitatore magnetico per evitare la sedimentazione delle particelle. Collegare il flacone a una pompa peristaltica tramite un piccolo tubo e regolare il flusso a 25 mL/h.</li>
	<li>Collegare la pompa peristaltica a un ugello di spruzzatura e regolare le impostazioni per consentire l'aerosolizzazione continua.</li>
	<li>L'ugello di spruzzatura è montato su un tubo di alluminio lungo 60 cm (camera di miscelazione, diametro 15 cm, riscaldato a 60 °C). La configurazione è collegata all'AES tramite un tubo di rame lungo 1,5 metri (diametro 15 cm). Sopra l'AES un impactor rimuove tutti gli aerosol più grandi di 2,5 μm.</li>
	<li>Collegare l'ugello di spruzzatura all'aria compressa a 3 barre attraverso due controller di flusso di massa (MFC) per consentire la nebulizzazione delle sospensioni. Un flusso di 14 L/min viene utilizzato per l'ugello di spruzzatura, l'altro MFC per la miscelazione dell'aria nel tubo.</li>
	<li>Il giorno prima dell'inizio dell'esposizione, accendere l'AES per consentire all'armadio di raggiungere una temperatura di 37 °C.</li>
	<li>Accendere il flusso d'aria e l'umidità nell'armadio 2 ore prima dell'inizio dell'esposizione, per raggiungere l'85% di umidità. Accendere il riscaldamento delle camere di esposizione in cui verranno posizionati gli inserti con le celle.</li>
	<li>Accendere il microbilanciamento al quarzo (QCM) e impostare il valore iniziale su 0 utilizzando il software. Avviare la registrazione. Ogni 10 s la massa viene misurata ed espressa come ng/cm2.</li>
	<li>Riscaldare il supporto di coltura cellulare a 37 °C in un bagno d'acqua (~ 20-30 minuti).</li>
</ol>5. Preparazione delle cellule Calu-3 per l'esposizione
NOTA: Per una tipica esposizione ALI utilizzando l'AES, sono necessari 15-20 inserti con uno strato di cella confluente. Si tratta di 3 controlli dell'aria pulita, 3 comandi dell'incubatore che verranno gestiti in modo simile agli altri inserti senza esposizione nell'AES, 6-8 inserti per l'esposizione all'aerosol (a seconda dell'uso di 0, 1 o 2 microbilanciamenti), 1-3 inserti per le misurazioni di controllo (come il massimo rilascio di LDH) e 3 inserti di ricambio nel caso in cui il TEER di alcuni degli inserti non sia sufficiente. Le celle devono avere un TEER di >1.000 Ω x cm2 per continuare.
<ol><li>Il primo giorno di esposizione, lavare le celle 1x con CCM, controllare la morfologia delle cellule e misurare il TEER del modello cellulare utilizzando un Voltohmmeter. Le cellule dovrebbero formare un monostrato stretto senza spazi vuoti.</li>
	<li>Mettere 2 mL/1 mL di CCM tamponato HEPES senza FCS sul lato basolaterale di 6 piastre di pozzo ben/12 e trasferire gli inserti di coltura con le celle alle nuove piastre. NOTA: Durante l'esposizione non è presente alcuna CO2 nell'AES. Pertanto, il mezzo di coltura tamponato HEPES (25 mM HEPES) viene utilizzato durante il trasporto e l'esposizione. Questo mezzo viene utilizzato sia per le cellule esposte nell'AES che per le celle di controllo dell'incubatore.</li>
	<li>Nel caso in cui il tempo di trasporto delle colture cellulari nell'AES sia superiore a 5 minuti, mettere le celle in un incubatore portatile di 37 °C durante il trasporto.</li>
</ol>6. Gestione dell'AES durante un'esposizione
<ol><li>All'AES, riempire i moduli di esposizione con CCM tamponato con HEPES senza siero fetale di vitello (FCS). La quantità di CCM dipende dall'unità utilizzata e dal tipo di inserimento delle impostazioni cultura delle celle. Tieni presente che per mantenere le cellule all'ALI, il mezzo dovrebbe raggiungere il fondo della membrana, ma non dovrebbe fuoriuscire sulla parte superiore della membrana. Quando si utilizzano 6 inserti di pozzo, aggiungere 6 mL di CCM tamponato da HEPES ai moduli di esposizione.</li>
	<li>Trasferire gli inserti con le celle dalle piastre ai moduli di esposizione utilizzando pinzette sterili. Verificare che non vi siano bolle d'aria sul lato basolaterale delle cellule e rimuovere qualsiasi CCM sul lato apicali degli inserti. Nel caso in cui ci siano alcune bolle d'aria sul lato basolaterale, ruotare delicatamente gli inserti usando le pinzette sterili fino a quando non vengono rimosse. Conservare le piastre contenenti CCM in un'incubatrice per il trasferimento dopo un'esposizione.</li>
	<li>Usa il display touchscreen per scegliere la durata dell'esposizione, la portata d'aria e il miglioramento della deposizione elettrostatica. Il display può essere utilizzato anche per controllare l'umidità e la temperatura. Di solito si preleva una durata di esposizione di 4 ore, con una portata di 50 mL/min sugli inserti a 37 °C e umidità dell'85%. NOTA: I moduli di primo livello (figura1) sono utilizzati perl'esposizione all'aria pulita; gli inserti in questo livello vengono utilizzati come controlli di esposizione all'aria pulita. Gli altri moduli del secondo e terzo livello possono essere utilizzati per l'esposizione all'aerosol, inclusi due moduli per microbilanciamenti di cristallo di quarzo (QCM) per misurare la deposizione online.</li>
	<li>La prova di tenuta deve essere effettuata prima di iniziare l'esposizione. La perdita deve essere inferiore a 5 mL/min. Seguire le istruzioni sul display AES. Al termine del test di tenuta, è possibile iniziare l'esposizione. In caso di perdita, il tubo deve essere controllato.</li>
	<li>Al termine dell'esposizione, aprire la porta di un modulo AES, aprire i moduli di esposizione, posizionare gli inserti di coltura cellulare nelle piastre di coltura cellulare e trasferire le piastre all'incubatore portatile.</li>
	<li>Raccogliere il supporto dai moduli (cioè campioni esposti) e dalle piastre (cioè i controlli dell'incubatore) per un'analisi successiva, come la misurazione della lattato deidrogenasi (LDH).</li>
	<li>Di nuovo al laboratorio di coltura cellulare, trasferire gli inserti di coltura cellulare su lastre riempite con CCM standard fresco. Mettere le piastre di coltura cellulare nell'incubatore fino alla successiva esposizione o fino all'analisi.</li>
	<li>Dopo il giorno finale dell'esposizione, mettere gli inserti nell'incubatore fino al giorno successivo.</li>
	<li>Il giorno dopo l'esposizione finale, aggiungere CCM al lato apicico per misurare TEER utilizzando un Voltohmmeter. Raccogliere separatamente sia la CCM apicale che la CCM basolaterale per l'analisi delle citochine.</li>
	<li>Rimuovere tutti i CCM ed eseguire un saggio di vitalità cellulare aggiungendo, ad esempio, un reagente di proliferazione sul lato apicale.</li>
</ol>7. Pulizia dell'AES
<ol><li>Riempire i moduli di esposizione con acqua, attendere 1 minuto e rimuovere l'acqua. Quindi, riempire i moduli con il 70% di etanolo, lasciarlo per 10 minuti e rimuovere l'etanolo. Pulire le trombe di esposizione anche con il 70% di etanolo.</li>
	<li>Interrompere il controllo dell'umidità dell'85%, ma lasciare la temperatura dell'armadio a 37 °C per l'esperimento successivo.</li>
</ol>

<ol>
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A., Fowler, P., Kirkland, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+updated+review+of+the+genotoxicity+of+respirable+crystalline+silica.">An updated review of the genotoxicity of respirable crystalline silica.</a> Particle and Fibre Toxicology. 15 (1), 23 (2018).</li><li>Kawasaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mechanistic+review+of+silica-induced+inhalation+toxicity.">A mechanistic review of silica-induced inhalation toxicity.</a> Inhalation Toxicology. 27 (8), 363-377 (2015).</li><li>Sayes, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changing+the+dose+metric+for+inhalation+toxicity+studies:+short-term+study+in+rats+with+engineered+aerosolized+amorphous+silica+nanoparticles.">Changing the dose metric for inhalation toxicity studies: short-term study in rats with engineered aerosolized amorphous silica nanoparticles.</a> Inhalation Toxicology. 22 (4), 348-354 (2010).</li><li>Driscoll, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pulmonary+response+to+inhaled+silica+or+titanium+dioxide.">Pulmonary response to inhaled silica or titanium dioxide.</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 111 (2), 201-210 (1991).</li><li>Muhle, H., Kittel, B., Ernst, H., Mohr, U., Mermelstein, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neoplastic+lung+lesions+in+rat+after+chronic+exposure+to+crystalline+silica.">Neoplastic lung lesions in rat after chronic exposure to crystalline silica.</a> Scandinavian Journal of Work, Environment and Health. 21, 27-29 (1995).</li><li>Peeters, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silica-induced+NLRP3+inflammasome+activation+in+vitro+and+in+rat+lungs.">Silica-induced NLRP3 inflammasome activation in vitro and in rat lungs.</a> Particle and Fibre Toxicology. 11, 58 (2014).</li><li>Reuzel, P. G., Bruijntjes, J. P., Feron, V. J., Woutersen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subchronic+inhalation+toxicity+of+amorphous+silicas+and+quartz+dust+in+rats.">Subchronic inhalation toxicity of amorphous silicas and quartz dust in rats.</a> Food and Chemical Toxicology. 29 (5), 341-354 (1991).</li><li>Arts, J. H., Muijser, H., Duistermaat, E., Junker, K., Kuper, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Five-day+inhalation+toxicity+study+of+three+types+of+synthetic+amorphous+silicas+in+Wistar+rats+and+post-exposure+evaluations+for+up+to+3+months.">Five-day inhalation toxicity study of three types of synthetic amorphous silicas in Wistar rats and post-exposure evaluations for up to 3 months.</a> Food and Chemical Toxicology. 45 (10), 1856-1867 (2007).</li><li>Cho, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+mediators+induced+by+intratracheal+instillation+of+ultrafine+amorphous+silica+particles.">Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles.</a> Toxicology Letters. 175 (1-3), 24-33 (2007).</li><li>Herzog, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exposure+of+silver-nanoparticles+and+silver-ions+to+lung+cells+in+vitro+at+the+air-liquid+interface.">Exposure of silver-nanoparticles and silver-ions to lung cells in vitro at the air-liquid interface.</a> Particle and Fibre Toxicology. 10 (1), 11 (2013).</li><li>M&#252;lhopt, S., Diabate, S., Krebs, T., Weiss, C., Paur, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lung+toxicity+determination+by+in+vitro+exposure+at+the+air+liquid+interface+with+an+integrated+online+dose+measurement.">Lung toxicity determination by in vitro exposure at the air liquid interface with an integrated online dose measurement.</a> Journal of Physics: Conference Series. 170, 012008 (2009).</li><li>van Ravenzwaay, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparing+fate+and+effects+of+three+particles+of+different+surface+properties:+nano-TiO(2),+pigmentary+TiO(2)+and+quartz.">Comparing fate and effects of three particles of different surface properties: nano-TiO(2), pigmentary TiO(2) and quartz.</a> Toxicology Letters. 186 (2), 152-159 (2009).</li><li>Henderson, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+the+inflammatory+response+of+the+lung+to+inhaled+versus+instilled+particles+in+F344+rats.">A comparison of the inflammatory response of the lung to inhaled versus instilled particles in F344 rats.</a> Fundamental and Applied Toxicology. 24 (2), 183-197 (1995).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo articolo descrive un metodo per coltivare cellule epiteliali bronchiali umane sotto ALI ed esporre questo modello bronchiale ad aerosol o gas. Il vantaggio dell'uso delle cellule Calu-3 è che formano giunzioni strette, rimangono un monostrato, sono in grado di resistere al flusso d'aria e possono essere coltivate per settimane all'ALI, a differenza di molti altri tipi di cellule (ad esempio, 16HBE, H292 e BEAS-2B). L'utilizzo dellastazione ® esposizione automatizzata vitrocell (AES) ha il vantaggio che le cellule possono essere esposte in condizioni realistiche e rilevanti in quanto basse concentrazioni possono essere applicate utilizzando un flusso d'aria continuo.
I sistemi a flusso continuo, come l'AES, hanno vantaggi rispetto all'utilizzo di sistemi cloud3,32, che utilizzano un'unica nebulizzazione di una sospensione. Il flusso continuo è più realistico e molte variabili come portata, umidità e temperatura sono controllate. Inoltre, la deposizione può essere migliorata utilizzando un campo elettrico. Infine, le caratteristiche dell'aerosol come dimensioni, concentrazione del numero e massa vengono monitorate online. Uno svantaggio è che i sistemi di flusso continuo sono più complessi rispetto ai sistemi cloud. Pertanto, è importante eseguire esperimenti preparatori che si concentrano sulle caratteristiche delle particelle dell'aerosol e sulla dose erogata sull'inserto. La concentrazione iniziale iniziale delle particelle e le impostazioni AES possono quindi essere regolate per ottenere la dose desiderata sulle cellule33. A seconda del tipo di particelle testate, il metodo di generazione dell'aerosol può differire. L'uso della deposizione elettrostatica dipende dal tipo di particella e funziona meglio per le particelle metalliche. Per le particelle con una carica superficiale positiva deve essere applicato un campo elettrostatico negativo e viceversa.
La selezione delle concentrazioni di esposizione può essere difficile per qualsiasi esperimento di esposizione aria-liquido. Per le esposizioni al DQ12, l'obiettivo era quello di raggiungere una dose cumulativa totale di 1 μg/cm2 dopo 3 settimane di esposizione, 5 giorni alla settimana, 4 ore al giorno. Questa dose è simile alle dosi che hanno indotto un effetto in vivo21,25,27,32,33. Durante l'esecuzione delle esposizioni, c'è stata una certa variazione tra i diversi giorni di esposizione. Sebbene la dose effettiva depositata di 1,6 μg/cm2 sia superiore a quella di 1 μg/cm2 che era stata mirata, la dose potrebbe essere stata troppo bassa per osservare gli effetti nel modello Calu-3. Sono state osservate solo piccole differenze nella risposta al TEER, alla vitalità e alla citochina tra l'esposizione all'aria pulita e l'esposizione al DQ12, e queste differenze non erano statisticamente significative. Una spiegazione per l'osservazione che l'esposizione al DQ12 per 3 settimane non ha prodotto effetti significativi nelle cellule Calu-3 è che i macrofagi mancavano dal modello Calu-3. Probabilmente, dopo l'assorbimento del DQ12, i macrofagi producono citochine proinfiammatorie che possono influenzare le cellule calu-3. Un'altra spiegazione è che il batch DQ12 utilizzato per gli esperimenti non era reattivo come previsto. Quando si utilizza LPS come sostanza di controllo positiva, Calu-3 mostra una risposta, misurata da un aumento del rilascio di LDH e da un aumento del rilascio di TNF-α. Ciò indica che il modello è in grado di rilevare la tossicità.
Il modello di cella Calu-3 presenta molti vantaggi, come discusso nella sezione risultati. Inoltre, se coltivate più a lungo all'ALI, le cellule calu-3 possono coltivare strutture simili a ciglia /ciglia13 e produrre muco11,12,13. Nonostante questi vantaggi, il modello ha dei limiti rispetto alla sua rilevanza fisiologica. Le linee cellulari Calu-3 provengono da un adenocarcinoma, mentre 16HBE e BEAS-2B provengono da tessuti sani. Sfortunatamente, questi ultimi due non sono adatti per l'esposizione ripetuta all'ALI in quanto non rimangono un monostrato stabile nel tempo. Un'altra limitazione del modello Calu-3 è che rappresenta solo un singolo tipo di cella. Nel polmone umano sono presenti più tipi di cellule che interagiscono e rispondono in modo diverso all'esposizione. Le particelle inalato si depositeranno in diverse regioni dei polmoni a seconda delle loro dimensioni aerodinamiche. È qui che le particelle contattano la barriera cellulare epiteliale, come minato dal modello Calu-3. Nel polmone umano, i macrofagi alveolari sono attratti dalle particelle, le inghiottiscono e le liberano dai polmoni. I macrofagi svolgono anche un ruolo essenziale nella risposta infiammatoria all'esposizione alle particelle. Pertanto, si stanno compiendo sforzi per estendere il modello Calu-3 aggiungendo macrofagi primari per imitare più da vicino la barriera polmonare. Lo svantaggio dei macrofagi è che rimangono vitali solo per circa 7 giorni quando coltivati sopra le cellule Calu-3 dell'ALI. Pertanto, i macrofagi devono essere letti settimanalmente per trasformare l'attuale modello Calu-3 in un modello di cocultura. L'ottimizzazione del protocollo di cocultura è attualmente in corso.
Dato quanto sopra, il modello bronchiale Calu-3 è un modello adatto per l'esposizione ripetuta ad aerosol di sostanze parzialmente solubili come sostanze chimiche dal fumo di sigaretta e LPS. Queste sostanze solubili inducono aumenti significativi delle risposte delle citochine nelle cellule calu-3. Per testare particelle insolubili come lo scarico diesel e il DQ12, è necessario un modello di cocoltura, perché i macrofagi svolgono un ruolo cruciale nell'induzione degli effetti dall'esposizione alle particelle.
Per le esposizioni descritte, sono state utilizzate membrane inserte con pori da 3,0 μm. Il motivo principale per scegliere questo tipo di inserto è che è possibile testare la traslocazione dei nanomateriali. Quando si utilizza una dimensione dei pori di 0,4 μm più piccola, gli agglomerati di particelle non saranno in grado di attraversare la membrana dell'inserto. Lo svantaggio dell'uso di una grande dimensione dei pori è che le cellule hanno bisogno di un tempo più lungo per diventare confluenti e che è più difficile visualizzare la morfologia delle cellule usando la microscopia ottica. Per verificare che le celle formino un monostrato confluente, il TEER deve essere >1.000 Ω x cm2 prima di iniziare un'esposizione.
Nel complesso, il modello bronchiale Calu-3 qui presentato è adatto all'uso per l'esposizione ripetuta agli aerosol, almeno fino a 3 settimane. Il modello può resistere alla coltura e all'esposizione attraverso un flusso d'aria continuo ed è in grado di rilevare la tossicità per l'epitelio bronchiale.

I polmoni sono vulnerabili all'esposizione all'inalazione di particelle trasportate dall'aria. Per valutare la potenziale tossicità delle particelle trasportate dall'aria, sono stati compiuti progressi per sviluppare sistemi di esposizione all'interfaccia aria-liquido (ALI)1,2,3,4,5. I sistemi di esposizione ALI consentono modelli di esposizione più pertinenti e realistici rispetto all'esposizione sommersa tradizionale tramite mezzo di coltura che altera le caratteristiche e la cinetica delle particelle6. I sistemi di esposizione ALI vengono richiesti in modo specifico ai modelli di coltura cellulare, in quanto i modelli mancano di mezzi di coltura e quindi di nutrienti sul lato apicale. Molti modelli cellulari sono influenzati negativamente dall'essere coltivati ed esposti all'aria (ad esempio, essiccazione) e rimangono vitali solo per pochi giorni. Questo limita le condizioni di esposizione che possono essere utilizzate in questi modelli: di solito concentrazioni relativamente elevate vengono applicate in un breve periodo di tempo come nuvola (cioè goccioline contenenti particelle, che si depositano rapidamente). Tali condizioni sperimentali non riflettono un'esposizione realistica a lungo termine a basse concentrazioni di particelle; pertanto, la pertinenza dei risultati può essere messa in discussione. Per superare questi limiti, è stato ottimizzato il protocollo di coltura ed esposizione per un modello bronchiale costituito dalla linea cellulare epiteliale bronchiale umana Calu-37.
La maggior parte dei modelli polmonari in vitro utilizzati per l'esposizione all'ALI contiene altre linee cellulari come A549, BEAS-2B e 16HBE14o- (16HBE) o cellule primarie come base8. Queste linee cellulari hanno lo svantaggio di rimanere vitali solo per pochi giorni quando coltivate all'ALI. Inoltre, alcune di queste linee cellulari vengono sovrascritte quando coltivate per un periodo superiore a 5 giorni. Infine, le cellule A549 mancano di giunzioni funzionali strette e quindi non possono formare una barriera stretta necessaria perimitare i polmoni 9,10. Le cellule epiteliali primarie potrebbero essere una buona opzione per l'esposizione all'ALI in quanto possono essere coltivate all'ALI per settimane. Tuttavia, le cellule primarie differiscono da lotto a lotto, sono più difficili da mantenere e sono più costose rispetto alle linee cellulari, il che le rende meno adatte per i test di tossicità e lo screening. Quando si confrontano diverse linee cellulari epiteliali bronchiali umane (16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B), solo le cellule Calu-3 soddisfano tutti i criteri necessari per un'esposizione ali realistica e ripetuta: rimangono vitali per settimane mentre coltivate all'ALI, forniscono un'elevata integrità barriera, non fanno crescita eccessiva e sono facili da coltura e mantenere. Le cellule calu-3 provengono da un adenocarcinoma e sono in grado di produrre muco11,12. Ci sono incongruenze sul fatto che le cellule possano sviluppare ciglia11,13. Le cellule Calu-3 sono anche un modello adatto per studiare le infezioni da virus respiratorio sinciziale (RSV) che infettano le cellule epiteliali delle vie aeree ciliate14.
Oltre al modello cellulare, viene utilizzato un sistema di esposizione automatizzato (AES) per l'esposizione aria-liquido agli aerosol15,16. L'AES ha il vantaggio di utilizzare un flusso d'aria continuo per esporre il modello cellulare agli aerosol. Questo è in contrasto con altri sistemi di esposizione aria-liquido che di solito usano concentrazioni relativamente elevate in un breve periodo di tempo come nube (cioè goccioline contenenti particelle che si depositano rapidamente)17,18,19. Questi sistemi cloud non riflettono un'esposizione realistica a lungo termine a basse concentrazioni di particelle. Applicando un flusso d'aria continuo utilizzando l'AES, il modello cellulare può essere esposto a una bassa concentrazione di particelle per un periodo di tempo più lungo, riflettendo condizioni di esposizione realistiche. Un altro vantaggio rispetto ai sistemi cloud è che l'AES ha la possibilità di collegare strumenti di caratterizzazione delle particelle, consentendo la misurazione delle dimensioni delle particelle, della concentrazione dei numeri e della massa nel tempo. Una limitazione dell'AES è che utilizza flussi d'aria relativamente elevati tra 10 mL/min e 100 mL/min.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>0.01 M NaOH</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>0.1M (x10) PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14200-059</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2&#8217;,7&#8217;-dichlorodihydrofluoresin diacetate (DCFH2-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D6883</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3-Morpholinosydnonimine hydrochloride (SIN-1 hydrochloride)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab141525</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amphotericin B</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15290</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Automated exposure station</td>
			<td>Vitrocell</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell proliferation reagent WST-1</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644807001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CPC</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytotoxicity detection kit LDH</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11644793001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DQ12</td>
			<td>IOM</td>
			<td></td>
			<td>nanomaterials</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ELISA Ready-SET-Go</td>
			<td>Fischer Scientific</td>
			<td>88-8086-86, 88-7399-88</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVOM2</td>
			<td>World Precision Instruments Inc., FL, USA</td>
			<td>EVOM2-STX2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS</td>
			<td>Greiner bio-one</td>
			<td>758093</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow splitter</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>model 3708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescein diacetate (F-DA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>14175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>CKX41</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass flow controllers</td>
			<td>MFC, Bronkhorst, the Netherlands</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol (analytical grade)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>34860</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microbalance</td>
			<td>Sartorius, Goettingen, Germany</td>
			<td>ME-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Minimum essential medium (MEM) + GlutaMAX</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>41090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NEAA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>11140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3339</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pen/Strep</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>15140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phenol red free MEM</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>10500-064</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pure water</td>
			<td>Merck</td>
			<td>MilliQ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SMPS</td>
			<td>TSI inc., St Paul MN, USA</td>
			<td>3936</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Spray nozzle</td>
			<td>Schlick, Coburg, Germany</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Teflon filters</td>
			<td>Pall</td>
			<td>R2PJ46</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TEOM</td>
			<td>Rupprecht &#38; Patashnick NY, USA</td>
			<td>series 1400</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue culture flask</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>690175, 658175, 660175</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transwell inserts</td>
			<td>Corning</td>
			<td>3460, 3462</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td>
			<td>25300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tryptan Blue</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

an air-liquid interface bronchial epithelial model for realistic, repeated inhalation exposure to airborne particles for toxicity testing

Per le prove di tossicità delle particelle trasportate dall'aria, sono stati sviluppati sistemi di esposizione aria-liquido (ALI) per test in vitro al fine di imitare condizioni di esposizione realistiche. Ciò pone esigenze specifiche ai modelli di coltura cellulare. Molti tipi di cellule sono influenzati negativamente dall'esposizione all'aria (ad esempio, essiccazione) e rimangono vitali solo per pochi giorni. Questo limita le condizioni di esposizione che possono essere utilizzate in questi modelli: di solito concentrazioni relativamente elevate vengono applicate come una nuvola (cioè goccioline contenenti particelle, che si depositano rapidamente) in un breve periodo di tempo. Tali condizioni sperimentali non riflettono un'esposizione realistica a lungo termine a basse concentrazioni di particelle. Per superare questi limiti è stato studiato l'uso di una linea cellulare epiteliale bronchiale umana, Calu-3. Queste cellule possono essere coltivate in condizioni ALI per diverse settimane pur mantenendo una morfologia sana e un monostrato stabile con giunzioni strette. Inoltre, questo modello bronchiale è adatto per testare gli effetti di esposizioni ripetute a basse concentrazioni realistiche di particelle trasportate dall'aria utilizzando un sistema di esposizione ALI. Questo sistema utilizza un flusso d'aria continuo in contrasto con altri sistemi di esposizione ALI che utilizzano una singola nebulizzazione che produce una nuvola. Pertanto, il sistema di flusso continuo è adatto per l'esposizione ripetuta e prolungata alle particelle trasportate dall'aria, monitorando continuamente le caratteristiche delle particelle, la concentrazione di esposizione e la dose erogata. Nel complesso, questo modello bronchiale, in combinazione con il sistema di esposizione continua al flusso, è in grado di imitare condizioni realistiche e ripetute di esposizione all'inalazione che possono essere utilizzate per i test di tossicità.

Questo articolo fornisce un metodo per coltivare ed esporre le cellule epiteliali bronchiali umane all'ALI che imita condizioni realistiche e ripetute di esposizione all'inalazione che possono essere utilizzate per i test di tossicità. Le caratteristiche sia del modello cellulare che del sistema di esposizione sono essenziali per ottenere un modello realistico di esposizione all'inalazione che può essere utilizzato per esposizioni ripetute. Di seguito sono riportati i risultati di queste caratteristiche.
Requisiti e selezione del modello di cella
Quando si seleziona un modello di cella adatto, si devono prendere in considerazione le seguenti caratteristiche:
<ol><li>Il modello cellulare dovrebbe essere in grado di formare un monostrato confluente con giunzioni strette funzionanti per imitare la barriera polmonare.</li>
<li>Il modello di cella deve mostrare prestazioni ottimali se esposto ripetutamente all'aria condizionata (temperatura e umidità).</li>
<li>Il modello cellulare deve rispondere a un'esposizione.</li>
</ol>Questo studio è iniziato con quattro diverse linee cellulari epiteliali bronchiali umane: 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B. Questi sono tutti ampiamente utilizzati per i test di tossicità di nanomateriali e sostanze chimiche. Delle quattro linee cellulari, solo le celle Calu-3 soddisfacevano tutti i requisiti di cui sopra. Le celle formavano un monostrato con giunzioni strette (Figura 3) che rimaneva una barriera stabile nel tempo misurata dal TEER, mentre le altre linee cellulari non formavano una barriera o mostravano una caduta della funzione barriera quando coltivate all'ALI(Figura 4). Inoltre, H292 e BEAS-2B tendevano a sovraboscorsi in più strati cellulari quando coltivati per un periodo di tempo più lungo. La tradizionale coltivazione cellulare sommersa e la ristrutturazione ALI differivano notevolmente, perché al ALI i nutrienti erano disponibili solo dal lato basolaterale e le cellule erano esposte a condizioni asciutte sul lato apicale. Queste condizioni possono causare stress ai modelli cellulari, che potrebbero essere osservati misurando la vitalità cellulare nel tempo. Le linee cellulari 16HBE, H292 e BEAS-2B hanno mostrato un aumento del rilascio di LDH quando coltivate all'ALI, mentre le celle Calu-3 hanno mostrato solo un leggero rilascio di LDH (Figura 5).
Successivamente, è stata testata la risposta del modello Calu-3 alle sostanze. Come sostanza di controllo positiva, l'LPS è stato somministrato tramite nebulizzazione sul lato apicale del modello. La dose depositata era di 0,25 μg/cm2. Le cellule calu-3 hanno mostrato una reazione al lipolisaccaride (LPS) da un aumento del rilascio di LDH e del rilascio del fattore alfa della necrosi tumorale (TNF-α) (Figura 6).
Infine, il monostrato Calu-3 è stato esposto a nanomateriali di silice di quarzo (DQ12) (IOM, Edimburgo). La silice cristallina può indurre silicosi e può anche causare tumori polmonari. Pertanto, l'Agenzia internazionale per la ricerca sul cancro (IARC) ha classificato la silice cristallina come cancerogena umana del Gruppo I20. Si pensa che il meccanismo d'azione della silice cristallina sia attraverso l'induzione di infiammazione persistente causata dalla sua superficiereattiva 21,22,23. Diversi studi in vivo su ratti e topi riportano l'induzione di infiammazioni e cambiamenti istopatologia, tra cui tumori e fibrosi, dopo l'esposizione per inalazione alla silicecristallina 24,25,26,27,28,29. Questi effetti sono tutti osservati dopo ripetute esposizioni e/o follow-up a lungo termine. Il modello Calu-3 è stato utilizzato per studiare se le osservazioni degli studi in vivo potessero essere mimickate utilizzando un modello in vitro che potesse essere esposto ripetutamente all'ALI.
Le cellule Calu-3 sono state esposte per 3 settimane consecutive, 5 giorni alla settimana, 4 ore al giorno al DQ12. La dose depositata è stata misurata utilizzando un QCM. La dose media depositata era di 120 ng/cm2 al giorno, con una dose cumulativa di 1,6 μg/cm2, simile alle dosi che inducono un effetto in vivo. Altre caratteristiche delle particelle sono indicate nella tabella 1. Dopo 3 settimane di esposizione, DQ12 non ha indotto effetti significativi nel rilascio di TEER, vitalità cellulare e proteina chemioattrice monocita 1 (MCP-1), rispetto ai controlli dell'aria pulita(Figura 7). Poiché era prevista una maggiore tossicità del DQ12 sulla base dei dati in vivo, la reattività delle particelle è stata controllata utilizzando un saggio cellulare secondo il protocollo ottimizzato all'interno del progetto UE GRACIOUS (risultato finale 5.3). La reattività del lotto DQ12 è stata inferiore al previsto (Figura 8), ordini di grandezza inferiori rispetto alle particelle di controllo positive carbon black (CB). Questa mancanza di reattività potrebbe spiegare l'assenza di una risposta di tossicità nel modello Calu-3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig01.jpg"> Figura 1: Stazione di esposizione automatizzata (AES). La figura sinistra mostra l'esterno dell'armadio con il pannello a sfiorare. L'AES ha tre livelli con moduli di esposizione: il livello superiore per le esposizioni all'aria pulita e il livello medio e inferiore per le esposizioni aerosol. La figura giusta mostra il modulo di esposizione in cui sono posizionati gli inserti con le celle. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61210/61210fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig02.jpg"> Figura 2: Rappresentazione schematica dell'impostazione dell'esposizione. Da sinistra a destra: 1) la sospensione ENM collegata all'ugello di spruzzatura tramite una pompa peristaltica; 2) Utilizzando aria compressa l'ugello di spruzzatura nebulizza la sospensione ENM e tramite una camera di miscelazione gli aerosol vengono portati all'AES; 3) Poco prima di entrare nell'AES, sono collegati strumenti di caratterizzazione aerosol: SMPS, OPS, CPC e TEOM. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61210/61210fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig03.jpg"> Figura 3: Immagine rappresentativa delle cellule Calu-3 dopo la coltivazione all'interfaccia aria-liquido (ALI) per 10 giorni. Immagine di microscopia a fluorescenza delle cellule Calu-3 dopo la coltivazione all'ALI per 10 giorni. La proteina di giunzione stretta ZO-1 è macchiata di verde, i nuclei delle cellule sono macchiati di blu. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61210/61210fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig04.jpg"> Figura 4: Resistenza elettrica transepiteliale (TEER) di quattro diverse linee cellulari durante un periodo di coltura di 21 giorni. Valori TEER di 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B se coltivati per 21 giorni: primi 7 giorni sommersi, seguiti da 14 giorni all'ALI. I valori TEER sono stati corretti per la resistenza di fondo dell'inserto e moltiplicati per l'area di superficie dell'inserto. I simboli e le barre di errore rappresentano il valore medio e la deviazione standard di sei inserti. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61210/61210fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig05.jpg"> Figura 5: Rilascio LDH di quattro diverse linee cellulari durante un periodo di coltura di 21 giorni. Rilascio LDH di 16HBE, Calu-3, H292 e BEAS-2B se coltivato per 21 giorni: 7 giorni sommersi, seguito da 14 giorni all'ALI. I valori LDH visualizzati sono relativi alla versione massima di LDH per tipo di cella. I simboli e le barre di errore rappresentano il valore medio e la deviazione standard di cinque inserti. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61210/61210fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig06.jpg"> Figura 6: Effetti cellulari nelle cellule Calu-3 esposte a LPS. Le cellule Calu-3 sono state esposte tramite nebulizzazione delle nubi a 0,25 μg/cm2 LPS. (A) Conversione WST-1. (B) Rilascio LDH. (C) Rilascio di TNF-α dopo l'esposizione all'LPS. I simboli e le barre di errore rappresentano valori medi e deviazioni standard di tre inserti. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61210/61210fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig07.jpg"> Figura 7: Effetti cellulari nelle cellule Calu-3 esposte ai nanomateriali DQ12. Le cellule calu-3 sono state esposte per 3 settimane (4 ore al giorno, 5 giorni alla settimana) a nanomateriali DQ12, circa 120 ng/cm2 al giorno, dose cumulativa di 1,6 μg/cm2. (A) Valori TEER. (B) Rilascio LDH. (C) rilascio MCP-1 dopo l'esposizione a DQ12. Tutti i simboli e le barre di errore rappresentano valori medi e deviazioni standard di tre inserti per i controlli e sei inserti per l'esposizione al DQ12. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61210/61210fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61210/61210fig08.jpg"> Figura 8: Reattività cellulare di DQ12. DQ12 è stato incubato con una sonda 2ʹ,7ʹ-Diclorofluoresceina Diacetato (DCFH-DA) per rilevare la sua reattività superficiale. Come controllo positivo, sono state incluse particelle di nero fumo (CB). Rispetto a CB, DQ12 ha una reattività superficiale molto bassa. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/61210/61210fig08large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Massa particellare (μg/m3)</td>
			<td>Numero di particelle (#/cm3)</td>
			<td>Dimensione delle particelle di mobilità (nm)</td>
			<td>Deviazione standard geometrica</td>
			<td>Dimensione ottica delle particelle (μm)</td>
		</tr>
<tr>
<td>2969 (418)</td>
			<td>83983 (10215)</td>
			<td>66.6</td>
			<td>2.5</td>
			<td>1.1 (1.3)</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Caratteristiche di esposizione al DQ12. I valori sono indicati come media con deviazione standard tra parentesi quadre.

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An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Descritto è il metodo di coltura cellulare e di esposizione di un modello bronchiale in vitro per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle per le prove di tossicità.

Un modello epiteliale bronchiale interfaccia aria-liquido per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle trasportate dall'aria per i test di tossicità

For toxicity testing of airborne particles, air-liquid interface (ALI) exposure systems have been developed for in vitro tests in order to mimic realistic ...

an-air-liquid-interface-bronchial-epithelial-model-for-realistic

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.3K Views.  National Institute for Public Health and the Environment (RIVM). Descritto è il metodo di coltura cellulare e di esposizione di un modello bronchiale in vitro per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle per le prove di tossicità.

Video: An Air-liquid Interface Bronchial Epithelial Model for Realistic, Repeated Inhalation Exposure to Airborne Particles for Toxicity Testing

Testing Nicotine Tolerance in Aphids Using an Artificial Diet Experiment

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well know to have insecticidal properties. One response of tobacco plants to herbivory, or being gnawed upon by insects, is to increase the production of this neurotoxic alkaloid. Here, we will demonstrate how to set up an experiment to address this question of whether a tobacco-adapted strain of the green peach aphid, Myzus persicae, can tolerate higher levels of nicotine than the a strain of this insect that does not infest tobacco in the field.

In this video and assay is demonstrated that tests the tolerance of nicotine to two types of aphids one that infests tobacco plants in the field and one that does not.

Test di tolleranza nicotina in Afidi Utilizzando un esperimento artificiale dieta

Plants may upregulate the production of many different seconday metabolites in response to insect feeding. One of these metabolites, nicotine, is well ...

Ricerca

Biologia

Using an EEG-Based Brain-Computer Interface for Virtual Cursor Movement with BCI2000

A brain-computer interface (BCI) functions by translating a neural signal, such as the electroencephalogram (EEG), into a signal that can be used to control a computer or other device. The amplitude of the EEG signals in selected frequency bins are measured and translated into a device command, in this case the horizontal and vertical velocity of a computer cursor. First, the EEG electrodes are applied to the user s scalp using a cap to record brain activity. Next, a calibration procedure is used to find the EEG electrodes and features that the user will learn to voluntarily modulate to use the BCI. In humans, the power in the mu (8-12 Hz) and beta (18-28 Hz) frequency bands decrease in amplitude during a real or imagined movement. These changes can be detected in the EEG in real-time, and used to control a BCI ([1],[2]). Therefore, during a screening test, the user is asked to make several different imagined movements with their hands and feet to determine the unique EEG features that change with the imagined movements. The results from this calibration will show the best channels to use, which are configured so that amplitude changes in the mu and beta frequency bands move the cursor either horizontally or vertically. In this experiment, the general purpose BCI system BCI2000 is used to control signal acquisition, signal processing, and feedback to the user [3].

In this video, we demonstrate the steps required to run a brain-computer interface experiment, including setting up the EEG cap, calibrating the system, and training the user to move a cursor in two dimensions using imagined movements.

L&#39;utilizzo di un EEG basato su Brain-Computer Interface permette movimenti del cursore virtuale con BCI2000

A brain-computer interface (BCI) functions by translating a neural signal, such as the electroencephalogram (EEG), into a signal that can be used to ...

Primary Human Bronchial Epithelial Cells Grown from Explants

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the function and structure of human epithelial cells. Here we describe in detail the method of growing bronchial epithelial cells from bronchial airway tissue that is harvested by the surgeon at the times of lung surgery (e.g. lung cancer or lung volume reduction surgery). With ethics approval and informed consent, the surgeon takes what is needed for pathology and provides us with a bronchial portion that is remote from the diseased areas. The tissue is then used as a source of explants that can be used for growing primary bronchial epithelial cells in culture. Bronchial segments about 0.5-1cm long and &le;1cm in diameter are rinsed with cold EBSS and excess parenchymal tissue is removed. Segments are cut open and minced into 2-3mm3 pieces of tissue. The pieces are used as a source of primary cells. After coating 100mm culture plates for 1-2 hr with a combination of collagen (30 &mu;g/ml), fibronectin (10 &mu;g/ml), and BSA (10 &mu;g/ml), the plates are scratched in 4-5 areas and tissue pieces are placed in the scratched areas, then culture medium (DMEM/Ham F-12 with additives) suitable for epithelial cell growth is added and plates are placed in an incubator at 37&deg;C in 5% CO2 humidified air. The culture medium is changed every 3-4 days. The epithelial cells grow from the pieces forming about 1.5 cm diameter rings in 3-4 weeks. Explants can be re-used up to 6 times by moving them into new pre-coated plates. Cells are lifted using trypsin/EDTA, pooled, counted, and re-plated in T75 Cell Bind flasks to increase their numbers. T75 flasks seeded with 2-3 million cells grow to 80% confluence in 4 weeks. Expanded primary human epithelial cells can be cultured and allowed to differentiate on air-liquid interface. Methods described here provide an abundant source of human bronchial epithelial cells from freshly isolated tissues and allow for studying these cells as models of disease and for pharmacology and toxicology screening.

Here we describe a detailed method for growing primary human bronchial epithelial cells from explants of human bronchial airway tissue including differentiated growth on an air-liquid interface. This method provides an abundant source of primary cells for investigating the role of the airway epithelium in human lung health and disease.

Primario cellule epiteliali bronchiali umane Grown da espianti

Human bronchial epithelial cells are needed for cell models of disease and to investigate the effect of excipients and pharmacologic agents on the ...

Whole-Body Nanoparticle Aerosol Inhalation Exposures

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle inhalation toxicology studies, the aerosols in a chamber housing the experimental animals must have: 1) a steady concentration maintained at a desired level for the entire exposure period; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable size distribution with a geometric mean diameter &lt; 200 nm and a geometric standard deviation &sigma;g &lt; 2.5 5. The generation of aerosols containing nanoparticles is quite challenging because nanoparticles easily agglomerate. This is largely due to very strong inter-particle forces and the formation of large fractal structures in tens or hundreds of microns in size 6, which are difficult to be broken up. Several common aerosol generators, including nebulizers, fluidized beds, Venturi aspirators and the Wright dust feed, were tested; however, none were able to produce nanoparticle aerosols which satisfy all criteria 5.
A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure system was fabricated, validated and utilized for nano-TiO2 inhalation toxicology studies. Critical components: 1) novel nano-TiO2 aerosol generator; 2) 0.5 m3 whole-body inhalation exposure chamber; and 3) monitor and control system. Nano-TiO2 aerosols generated from bulk dry nano-TiO2 powders (primary diameter of 21 nm, bulk density of 3.8 g/cm3) were delivered into the exposure chamber at a flow rate of 90 LPM (10.8 air changes/hr). Particle size distribution and mass concentration profiles were measured continuously with a scanning mobility particle sizer (SMPS), and an electric low pressure impactor (ELPI). The aerosol mass concentration (C) was verified gravimetrically (mg/m3). The mass (M) of the collected particles was determined as M = (Mpost-Mpre), where Mpre and Mpost are masses of the filter before and after sampling (mg). The mass concentration was calculated as C = M/(Q*t), where Q is sampling flowrate (m3/min), and t is the sampling time (minute). The chamber pressure, temperature, relative humidity (RH), O2 and CO2 concentrations were monitored and controlled continuously. Nano-TiO2 aerosols collected on Nuclepore filters were analyzed with a scanning electron microscope (SEM) and energy dispersive X-ray (EDX) analysis.
In summary, we report that the nano-particle aerosols generated and delivered to our exposure chamber have: 1) steady mass concentration; 2) homogenous composition free of contaminants; 3) stable particle size distributions with a count-median aerodynamic diameter of 157 nm during aerosol generation. This system reliably and repeatedly creates test atmospheres that simulate occupational, environmental or domestic ENM aerosol exposures.

A whole-body nanoparticle aerosol inhalation exposure facility was constructed for nano-sized titanium dioxide (TiO2) inhalation toxicology studies. This system provides nano-TiO2 aerosol test atmospheres that have: 1) a steady mass concentration; 2) a homogenous composition free of contaminants; and 3) a stable particle size distribution during aerosol generation.

Tutto il corpo Nanoparticelle Aerosol esposizioni inalatorie

Inhalation is the most likely exposure route for individuals working with aerosolizable engineered nano-materials (ENM). To properly perform nanoparticle ...

Culturing of Human Nasal Epithelial Cells at the Air Liquid Interface

In vitro models using human primary epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory epithelium in the context of microbial infections or inhaled agents. Direct comparisons of cells obtained from diseased populations allow us to characterize different phenotypes and dissect the underlying mechanisms mediating changes in epithelial cell function. Culturing epithelial cells from the human tracheobronchial region has been well documented, but is limited by the availability of human lung tissue or invasiveness associated with obtaining the bronchial brushes biopsies. Nasal epithelial cells are obtained through much less invasive superficial nasal scrape biopsies and subjects can be biopsied multiple times with no significant side effects. Additionally, the nose is the entry point to the respiratory system and therefore one of the first sites to be exposed to any kind of air-borne stressor, such as microbial agents, pollutants, or allergens. 
Briefly, nasal epithelial cells obtained from human volunteers are expanded on coated tissue culture plates, and then transferred onto cell culture inserts. Upon reaching confluency, cells continue to be cultured at the air-liquid interface (ALI), for several weeks, which creates more physiologically relevant conditions. The ALI culture condition uses defined media leading to a differentiated epithelium that exhibits morphological and functional characteristics similar to the human nasal epithelium, with both ciliated and mucus producing cells. Tissue culture inserts with differentiated nasal epithelial cells can be manipulated in a variety of ways depending on the research questions (treatment with pharmacological agents, transduction with lentiviral vectors, exposure to gases, or infection with microbial agents) and analyzed for numerous different endpoints ranging from cellular and molecular pathways, functional changes, morphology, etc. 
In vitro models of differentiated human nasal epithelial cells will enable investigators to address novel and important research questions by using organotypic experimental models that largely mimic the nasal epithelium in vivo.

Nasal epithelial cells, obtained through superficial scrape biopsy of human volunteers, are expanded and transferred onto tissue culture inserts. Upon reaching confluency, cells are grown at air liquid interface, yielding cultures of ciliated and non-ciliated cells. Differentiated nasal epithelial cell cultures provide viable experimental models for studying the respiratory mucosa.

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l&#39;Air Interface Liquid

In vitro models using human primary  epithelial cells are essential in understanding key functions of the respiratory  epithelium in the context of ...

Cryosectioning Method for Microdissection of Murine Colonic Mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The colonic epithelium is dynamically turned over and epithelial cells are generated in the stem cell containing crypts of Lieberk&#252;hn. Progenitor cells produced in the crypt-bases migrate toward the luminal surface, undergoing a process of cellular differentiation before being shed into the gut lumen. In order to study these processes at the molecular level, we have developed a simple method for the microdissection of two spatially distinct regions of the colonic mucosa; the proliferative crypt zone, and the differentiated surface epithelial cells. Our objective is to isolate specific crypt and surface epithelial cell populations from mouse colonic mucosa for the isolation of RNA and protein.

Here we describe a simple method for the isolation of spatially distinct murine colonic epithelial surface cells from the underlying crypt-base cells.

Metodo criosezionamento per Microdissezione di Murine colon mucosa

The colonic mucosal tissue provides a vital barrier to luminal antigens. This barrier is composed of a monolayer of simple columnar epithelial cells. The ...

Procedure to Evaluate the Efficiency of Flocculants for the Removal of Dispersed Particles from Plant Extracts

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.

The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.

Procedura per valutare l&#39;efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used ...

Optimal Lentivirus Production and Cell Culture Conditions Necessary to Successfully Transduce Primary Human Bronchial Epithelial Cells

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of airway cell differentiation and function. In the past few years, the use of lentiviral vectors for transgene delivery became common practice. While there are reports of transduction of fully differentiated airway epithelial cells with certain non-HIV pseudo-typed lentiviruses, the overall transduction efficiency is usually less than 15%. The protocol presented here provides a reliable and efficient method to produce lentiviruses and to transduce primary human bronchial epithelial cells. Using undifferentiated bronchial epithelial cells, transduction in bronchial epithelial growth media, while the cells attach, with a multiplicity of infection factor of 4 provides efficiencies close to 100%. This protocol describes, step-by-step, the preparation and concentration of high-titer lentiviral vectors and the transduction process. It discusses the experiments that determined the optimal culture conditions to achieve highly efficient transductions of primary human bronchial epithelial cells.

Primary human bronchial epithelial cells are difficult to transduce. This protocol describes the production of lentiviruses and their concentration as well as the optimal culture conditions necessary to achieve highly efficient transductions in these cells throughout differentiation to a pseudostratified epithelium.

Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell&#39;uomo epiteliali bronchiali

In vitro culture of primary human bronchial epithelial (HBE) cells using air-liquid interface conditions provides a useful model to study the processes of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.

Protocollo sperimentale per l'utilizzo di Drosophila come sistema modello invertebrati marini per test di tossicità in laboratorio

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ...

Protocols for Testing the Toxicity of Novel Insecticidal Chemistries to Mosquitoes

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such as Zika, dengue and malaria. Assays for rapid, high-throughput analyses of unformulated novel chemistries against mosquito larvae and adults are presented. We describe protocols for single point-dose and dose response assays to evaluate the toxicity of small molecule chemistries to the Aedes aegypti vector of Zika, dengue and yellow fever,&#160;the malaria vector, Anopheles gambiae and the northern house mosquito, Culex quinquefasciatus, on contact and via ingestion. As an example, we evaluated the toxicity of amitriptyline, a small molecule antagonist of G protein-coupled receptors, via larval, adult topical and adult blood-feeding assay. The protocols provide a starting point to investigate insecticide potential. Results are discussed in the context of additional experiments to explore product applications and mechanisms for delivery.

Protocols are described for assessing the toxicity of chemistries to immature and adult mosquitoes for development as new classes of larvicides, adulticides and endectocides. The protocols enable high-throughput testing of multiple chemistries at single-point dose and subsequent evaluation via dose response assay to determine toxicity on contact or via ingestion.

Protocolli per testare la tossicità di romanzo chimiche insetticide per le zanzare

New classes of insecticides with novel modes of action are needed to control insecticide resistant populations of mosquitoes that transmit diseases such ...

Un modello epiteliale bronchiale interfaccia aria-liquido per un'esposizione realistica e ripetuta all'inalazione alle particelle trasportate dall'aria per i test di tossicità

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Test di tolleranza nicotina in Afidi Utilizzando un esperimento artificiale dieta

L'utilizzo di un EEG basato su Brain-Computer Interface permette movimenti del cursore virtuale con BCI2000

Primario cellule epiteliali bronchiali umane Grown da espianti

Tutto il corpo Nanoparticelle Aerosol esposizioni inalatorie

Coltura di cellule umane nasale epiteliali presso l'Air Interface Liquid

Metodo criosezionamento per Microdissezione di Murine colon mucosa

Procedura per valutare l'efficienza di flocculanti per la rimozione di particelle disperse di estratti di piante

Ottimale Lentivirus di produzione e colture cellulari condizioni necessarie al successo le cellule trasdurre primario dell'uomo epiteliali bronchiali

Protocollo sperimentale per l'utilizzo di Drosophila come sistema modello invertebrati marini per test di tossicità in laboratorio

Protocolli per testare la tossicità di romanzo chimiche insetticide per le zanzare