Questo protocollo descrive una coltura di cellule intestinali fetali del topo che è la più adatta per ottenere la maturazione allo stadio adulto in vitro. Questo approccio in vitro può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari della transizione da allutto a svezzamento e i modulatori di questo processo e per ottenere un uso più efficiente degli animali da esperimento. È essenziale che questo modello in vitro di maturazione intestinale utilizzi cellule intestinali primarie da stadio di sviluppo tardivo, tra il giorno embrionale 18 e il 20.
Con due piccole forcep, allungare l'intestino. Usando lo stomaco e l'appendice come guide, tagliare le parti prossimali e distali dell'intestino tenue. Usando l'appendice come guida, tagliare i due punti.
Per rendere l'intestino aperto longitudinalmente, posizionare una lama di rasoio longitudinalmente lungo l'intestino e tirare l'intestino facendo scorrere le forcep lungo la lama del rasoio. Successivamente, tagliare l'intestino aperto in pezzi di un centimetro. Preparare tre tubi da 50 millilitri con dieci millilitri di PBS ghiacciato.
Trasferire separatamente le parti prossimali e distali dell'intestino tenue e del colon ai tubi. Tenere i tubi sul ghiaccio mentre si seziona l'intestino di topi aggiuntivi. Raccogliere tutte le parti intestinali di una cucciolata insieme nello stesso tubo.
Dopo aver lavato i pezzi intestinali con PBS ghiacciato, incubare con due EDTA millimolare per 30 minuti. Per dissociare le cripte dal tessuto, lavare parzialmente i pezzi con PBS ghiacciato e siero di vitello al dieci per cento e filtrare attraverso un filtro cellulare da 70 micron in un nuovo tubo. Ripetere il lavaggio del tessuto due volte in più e combinare la soluzione filtrata.
Centrifugare la soluzione filtrata contenente le cripte a 150 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per raccogliere le cripte come pellet. Trasferire le cripte in un tubo da 15 millilitri e centrifugare di nuovo. Per placcare i pozzi, aggiungere la quantità totale di gel a matrice extracellulare necessaria nel tubo e sciogliere il pellet.
Aggiungere 20 microlitri delle cripte disciolte in ogni pozzo di una calda piastra da 48 porri. Dopo aver placcato il primo pozzo, guarda al microscopio per confermare la densità di circa 250-300 cripte per pozzo. Posizionare la piastra in un incubatore Celsius di 37 gradi per dieci minuti per lasciare solidificare il gel della matrice extracellulare.
Quindi, preparare il supporto ENR. Aggiungere 250 microlitri del mezzo ENR in ogni pozzo sul gel. Cambiare il mezzo tre volte a settimana e passare gli organoidi una volta alla settimana.
Per un mese, ogni tre giorni dopo ogni passaggio, analizza la cultura. Tre giorni dopo ogni passaggio, isolare l'RNA da un pozzo aggiungendo al pozzo 200 microlitri di lisi dell'RNA integrati con due microlitri di beta mercaptoetanolo. Quindi, trasferire il campione dal pozzo in un tubo RNAse-free da 1,5 millilitri.
Nei nostri esperimenti in vitro, abbiamo usato il desamethosone come esempio di un fattore esterno noto per accelerare la maturazione intestinale in vivo. Per isolare le proteine, aggiungere 250 microlitri di soluzione di recupero di cellule fredde ghiacciate per pozzo a cinque pozzi di organoidi e raccoglierli tutti in un tubo da 15 millilitri. Incubare per almeno 30 minuti sul ghiaccio per sciogliere il gel a matrice extracellulare.
Lavare con PBS ghiacciato, aggiungere 250 microlitri di tampone di lysis cellulare e conservare a meno 80 gradi Celsius. Per analizzare l'attività enzimatica, preparare prima 0,625 tampone maleico molare a pH sei e 0,05 soluzioni molare di lattosio, saccarosio, maltosio e trealasi e conservarle sul ghiaccio. Preparare gli standard di dosaggio diluire la soluzione di glucosio molare 5.56 con acqua ultra pura per ottenere soluzioni con 5 diverse concentrazioni.
Quindi, in una piastra da 96 pozzetti, aggiungere otto diversi gruppi di lisato organoide con i rispettivi substrati, inclusi standard e controllo secondo il manoscritto. Incubare per 60 minuti a 37 gradi Celsius. Per determinare la quantità di glucosio prodotta dagli enzimi presenti nel lysato organoide, aggiungere rapidamente 200 microlitri di soluzione di colore IGP appena preparata e misurare l'assorbanza sullo spettrofotometro a 450 nanometri ogni cinque minuti per trenta minuti a 37 gradi Celsius.
In questo protocollo, l'intestino prossimale e distale sono stati isolati dai feti del topo da E18 a E20. Dopo l'isolamento, le cellule epiteliali venivano seminate in cupole di gel a matrice extracellulare. Dopo circa 28-30 giorni di coltura, gli organoidi fetali sono stati sviluppati allo stato adulto maturo.
I marcatori prossimali Onecut2 e Gata4 erano espressi principalmente nella coltura organoide prossimale, mentre i marcatori distale Fabp6 e Guca2a erano per lo più espressi nella cultura organoide distale. I marcatori fetali lattasi, Ass1, Dirigibile-1 e il recettore neonatale Fc sono diminuiti nella loro espressione relativa e i marcatori adulti sucrasi isomaltasi, argenasi 2, trehalasi e llysozima sono aumentati nel tempo sia nelle colture organoidi prossimali che distale. Gli effetti dei fattori estrinseci non dovrebbero necessariamente essere genomici.
L'espressione genica del marcatore fetale Dirigibile-1 è diminuita al giorno 12 per gli organoidi trattati con desametasone rispetto agli organoidi di controllo. Tuttavia, sia l'espressione genica che l'attività enzimatica dei marcatori adulti sucrasi isomaltasi sono state aumentate. Quando si utilizza questo protocollo, è importante rendersi conto che solo gli organoidi allo stadio fetale tardivo sono in grado di transitare verso organoidi adulti in vitro.
Il numero di sei-dieci feti come punto di partenza di questa coltura può essere ulteriormente ridotto usando l'intero intestino per studiare la maturazione complessiva. Il valore traslazionale di questo modello risiede nella possibilità che gli effettori estremi ad alto gruppo siano in grado di modulare la maturazione intestinale che è un processo conservato tra mammiferi da latte.
