Questo protocollo sta dimostrando che ora possiamo determinare l'effetto degli inibitori emicrastatici in dettaglio nei modelli di cancro 3D. Il vantaggio principale è la facilità e l'approccio all-in-one con cui questa tecnica può essere eseguita. Questa tecnica consente la valutazione dei farmaci emicrastatici nella ricerca sul cancro in un ambiente 3D, consentendo il test di farmaci in un ambiente più rilevante per l'ambiente tumorale.
Questo metodo può essere applicato alla sperimentazione di farmaci citotossici nel cancro o, ad esempio, per valutare l'effetto delle radiazioni sulla proliferazione del cancro e sulla migrazione cellulare. È utile praticare la fase di rimozione media e la sostituzione del collagene con normali piastre da 96 pozzi per diventare sicuri. Inoltre, l'allenamento al microscopio confocale è essenziale.
La dimostrazione visiva di questa tecnica è fondamentale per i ricercatori per comprendere la delicata gestione richiesta degli sferoidi e il loro uso in microscopia confocale. Il primo giorno di sperimentazione, avere il mezzo di coltura standard, in questo caso, U251, pronto per l'appropriata linea cellulare. In una cappa di coltura tissutale, aggiungere 0,5 millilitri di tripside nella coltura per tripinare le cellule tumorali.
Contare le cellule tumorali su un emocitometro e diluire a una concentrazione di cinque volte 10 alla terza cellule per millilitro. Mantenere le sospensioni cellulari in tubi universali sterili chiaramente etichettati. Rimospendare le cellule per inversione delicata per evitare il raggruppamento cellulare.
Utilizzare una pipetta per aggiungere 200 microlitri della coltura cellulare a ciascun pozzo in una piastra da 96 potte. Aggiungere 200 microlitri di 1X PBS ad ogni pozzo vuoto per evitare l'evaporazione. Incubare le cellule in un'incubatrice a 37 gradi Celsius.
Dopo 24 ore, controllare le cellule con microscopia a campo luminoso. Linee cellulari come le linee cellulari del cancro al glioma formano sferoidi nella parte inferiore del pozzo entro 24 ore. Incubare gli sferoidi per altre 48 ore per consentire la forma di un'architettura cellulare 3D.
Il terzo giorno, posizionare collagene, mezzo di coltura 5X, idrossido di sodio un molare e un tubo da 20 millilitri sul ghiaccio. Aggiungere con cura e lentamente 10,4 millilitri di collagene freddo nel tubo di coltura refrigerato. Evitare bolle.
Quindi, aggiungere delicatamente 1,52 millilitri di mezzo di coltura sterile 5X freddo. Evitare bolle. Poco prima dell'uso, aggiungere delicatamente 72 microlitri di idrossido di sodio monomolare sterile a freddo e mantenere la soluzione sul ghiaccio.
Mescolare delicatamente pipettando ed evitando bolle. Una miscelazione efficiente porta a un cambiamento di colore dal rosso all'arancione-rosso nel mezzo. Lasciare la miscela sul ghiaccio fino all'uso.
Successivamente, per rimuovere 190 microlitri di supernatante dalla piastra da 96 porri preparata il primo giorno, utilizzare una pipetta con un angolo verso il lato del pozzo. Fare molta attenzione a non disturbare gli sferoidi che si sono formati nel fondo del pozzo. Aggiungere delicatamente 100 microlitri del mix di collagene ad ogni pozzo, pipettando lungo il lato del pozzo.
Evitare bolle e disturbi dello sferoide. Conservare la miscela di collagene rimanente nel tubo da 20 millilitri a temperatura ambiente per valutare la polimerizzazione. Incubare la piastra nell'incubatrice per almeno 10 minuti per consentire al collagene di polimerizzare.
Quando il collagene rimasto diventa semisolido e simile a una spugna, gli sferoidi sono pronti per essere trattati con inibitore. Aggiungere gli inibitori a concentrazione 2X a cinque millilitri di mezzo di coltura. Pipetta 100 microlitri del mezzo delicatamente lungo il lato di ogni pozzo per evitare disturbi dello sferoide.
Osservare e osservare ogni sferoide mediante microscopia a campo luminoso in momenti di zero ore, 24 ore, 48 ore e 72 ore per valutare l'attività del farmaco. Quindi, riportare la piastra all'incubatore. Ora, posizionare la piastra in un cappuccio di coltura tissutale e sostituire delicatamente il supernatante con 100 microlitri di 1X PBS.
Fare attenzione a non disturbare lo sferoide ed evitare di toccare il collagene. Ripetere questo passaggio di lavaggio altre tre volte. Rimuovere il lavaggio finale in ogni pozzo e sostituirlo con 100 microlitri di formaldeide al 4% in 1X PBS.
Posizionare la piastra da 96 po', coprire con un foglio e lasciare per 24 ore a temperatura ambiente. Il giorno successivo, rimuovere con cura la formaldeide e sostituirla con 1X PBS. Ripetere questo lavaggio altre tre volte.
Quindi, sostituire il lavaggio 1X PBS con 100 microlitri di soluzione Triton X-100 appena preparata. Incubare per 30 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, preparare la soluzione di blocco con 50 millilitri di 1X PBS e 05% di latte scremato in polvere in un tubo da 50 millilitri e mescolare accuratamente.
Dopo 30 minuti, rimuovere il Triton X-100 e lavare tre volte con 1X PBS. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di blocco ad ogni pozzo e incubare per 15 minuti. Successivamente, diluire l'anticorpo della tubulina acetilata IgG anti-topo nel tampone di blocco con un rapporto da uno a 100.
Centrifugare la miscela tampone principale che blocca gli anticorpi per cinque minuti a 15, 682 volte g. Rimuovere con cura la soluzione di blocco in ogni pozzo e aggiungere dal tubo da 25 a 50 microlitri del supernatante tampone bloccante anticorpale. Incubare al buio a temperatura ambiente per un'ora.
Quindi, rimuovere la soluzione anticorpale da ogni pozzo e lavare tre volte con 100 microlitri di 1X PBS. Diluire l'anticorpo secondario nel tampone di blocco alla concentrazione raccomandata oltre a eventuali macchie fluorescenti aggiuntive. Ancora una volta, centrifugare la soluzione anticorpale secondaria per cinque minuti a 15,682 volte g.
Rimuovere la soluzione di blocco da ogni pozzo e aggiungere da 25 a 50 microlitri del supernatante anticorpo secondario. Incubare al buio per 1 ora e mezza a temperatura ambiente. Rimuovere la soluzione di colorante anticorpale secondario e lavare tre volte con 1X PBS, 100 microlitri per pozzo.
Sollevare con cura i singoli tappi di collagene per aspirazione con una pipetta in plastica da 200 microliter al centro di uno scivolo di vetro. Aggiungere una goccia di un montante adatto per coprire il tappo di collagene. Posizionare un coverslip sopra il campione e memorizzare lo scivolo a temperatura ambiente al buio.
La tecnologia tridimensionale degli sferoidi sta facendo progredire la comprensione delle interazioni farmaco-tumore perché è più rappresentativa dell'ambiente specifico del cancro. In questo studio sono stati rilevati potenziali effetti anti-o pro-migratori. Questo è particolarmente evidente in KNS42 con apparentemente nessuna migrazione né negli sferoidi di controllo né in quelli trattati.
La morte cellulare è stata osservata alla più alta concentrazione inibitore di 10 micromolari. La frammentazione nucleare e le cellule migrate erano evidenti nelle cellule U251. Gli sferoidi cellulari U251 avevano picchi che si irradiavano lontano dallo sferoide originale, con un aumento dell'arrotondamento cellulare nelle cellule apparentemente con una crescente concentrazione di inibitori.
Microtubuli collassati e frammentazione nucleare sono stati osservati in KNS42. Sporgenze simili a fogli con punte a cella singola indicano la migrazione KNS42. Alla più bassa concentrazione di inibitori, questo fenotipo è stato pronunciato ma è stato perso con l'aumento della concentrazione di inibitori.
È fondamentale lasciare tutti i reagenti sul ghiaccio fino a quando non sono pronti. Altrimenti, il collagene inizia a polimerizzare prima che sia stato tutto aggiunto agli sferoidi. C'è spazio per quantificare le immagini generate dalla microscopia confocale per valutare gli effetti, ad esempio, dei farmaci emicrastatici sulla morfologia cellulare.
Ci ha permesso, per la prima volta, di confermare l'effetto dell'inibitore emicrastatico MI-192 sui livelli di acetilazione dei microtubuli e di esplorarlo ulteriormente in termini di migrazione cellulare. Prestare particolare attenzione quando si maneggia la formaldeide per la fase di fissazione. Si applicano le consuete linee guida in materia di salute e sicurezza.
