Il metodo fornisce informazioni sugli effetti del trattamento dipendente dal ciclo cellulare e consente e lo studio approfondito dell'interazione tra proliferazione cellulare e meccanismi di coping contro i danni al DNA. Questo metodo combina endpoint importanti dalla risposta ai danni del DNA tra cui il riconoscimento e la riparazione della frattura a doppio filamento, gli effetti del ciclo cellulare e l'eventuale morte cellulare per apoptosi in un unico test completo. Abbiamo utilizzato questa tecnica principalmente per indagare risposte terapeutiche specifiche ed effetti collaterali dei trattamenti radiochemoterapici in oncologia clinica.
Il saggio è molto utile per studi correlativi nei campi della radiobiologia e della radioterapia, ma può anche essere applicato a varie altre aree dell'oncologia. Dopo aver raccolto le cellule dalla coltura secondo le procedure standard di raccolta cellulare, rimorsi il pellet in un millilitro di PBS. E trasferire le cellule in due millilitri di soluzione di fissaggio in un cappuccio.
Dopo un'incubazione di 10 minuti a temperatura ambiente, raccogliere le cellule per centrifugazione e decantare il supernatante. È importante fissare le celle come una singola sospensione cellulare e mantenere costante il tempo di fissazione per tutti i campioni. Dare alle cellule aderenti abbastanza tempo per staccarsi per ottenere cellule ben arrotondate per l'analisi.
Quindi allentare il pellet toccando e rimosi le cellule in tre millilitri di 70%etanolo. Per lavare le cellule prima della colorazione, sedimentare le cellule mediante centrifugazione e allentare il pellet toccando. Quindi rimescolare le celle con due lavaggi consecutivi con tre millilitri di soluzione di lavaggio e un lavaggio con un millilitro di soluzione di lavaggio.
Scartare il supernatante tra ogni lavaggio. Dopo l'ultimo lavaggio, aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet e rimescolare il pellet lucente in 100 microlitri del cocktail anticorpale di interesse. Dopo un'ora a temperatura ambiente, raccogliere le cellule per centrifugazione e aspirare con cura il supernatante senza disturbare il pellet.
Quindi, rimescolare il pellet allentato in 100-250 microlitri di soluzione di colorazione del DNA e distribuire le cellule attraverso il tappo del filtro cellulare di un tubo campione con una dimensione dei pori a rete da 35 micrometri. Per analizzare le celle in base alla citometria del flusso, aprite la scheda parametri nella finestra del citometro e selezionate i parametri come indicato nella tabella. Aprire quindi la finestra del foglio di lavoro e creare grafici come indicato.
Caricare un campione di controllo nel citometro e premere il pulsante esegui. Selezionate il primo tubo nella finestra del browser e fate clic sul nome del tubo. Regolare le tensioni del rivelatore per la dispersione avanti e laterale e DAPI nella scheda parametri della finestra di ispezione.
Premere il pulsante standby per continuare con la configurazione del foglio di lavoro nel software. Utilizzare lo strumento porta poligono per definire la popolazione delle celle nell'area di dispersione in avanti rispetto al tracciato dell'area di dispersione laterale e utilizzare lo strumento cancello rettangolo per definire la popolazione delle singole celle nel tracciato di area DAPI con rispetto a DAPI. Premere il controllo G per visualizzare la gerarchia di popolazione e fare clic sui nomi predefiniti dei gate per rinominarli.
Successivamente, fare clic con il pulsante destro del mouse su tutti gli istogrammi per selezionare mostra popolazioni e singole celle dal menu di scelta rapida. Acquisire campioni di controllo e trattati per ottimizzare le tensioni del rivelatore per i fluorofori accoppiati agli anticorpi per coprire l'intera gamma dinamica del segnale. Per misurare i campioni, premere il pulsante esegui sul citometro e utilizzare il dashboard di acquisizione nel software per misurare i campioni.
Selezionare quindi file, esportare ed esperimenti per selezionare l'esportazione della directory nella finestra di dialogo per salvare i dati come file FCS punto. Per valutare i dati, trascinare e rilasciare i file FCS punto nel browser di esempio del software di analisi citometrica del flusso. E usate lo strumento poligono per definire la popolazione delle cellule nel grafico dell'area di dispersione avanti rispetto a quella laterale e per escludere i detriti dall'analisi.
Nel grafico ad area DAPI con rispetto a DAPI, utilizzare lo strumento rettangolo per definire la popolazione delle singole celle ed escludere dall'analisi eventuali doppietti o grumi di celle. Nell'istogramma dell'area DAPI, utilizzare lo strumento bisettore per distinguere singole cellule con un normale contenuto di DNA da cellule apoptotiche con DNA degradato. Selezionate la biologia degli utensili e il ciclo cellulare per aprire lo strumento di modellazione del ciclo cellulare e selezionate Dean-Jett Fox per stimare la frequenza delle cellule nelle fasi G uno S e G due M.
Creare porte di fase G uno S e G due e M nel grafico di fase DAPI con rispetto a DAPI della popolazione del ciclo cellulare per consentire una misurazione gamma H due A X specifica del ciclo cellulare. Utilizzare lo strumento bisettore per distinguere la fosfohistone H tre cellule positive e negative nell'istogramma dell'area Di Alexa 555 della popolazione del ciclo cellulare e per distinguere la base CAS di tre cellule positive e negative nell'istogramma dell'area Di Alexa 647 della popolazione delle singole cellule. Premere il controllo T per aprire l'editor di tabelle e configurare la tabella come indicato.
Quindi selezionare A file per impostare il formato e la destinazione nella sezione di output della barra multifunzione del menu ed esportare i dati in un foglio di diffusione. Gli ioni di carbonio inducono livelli di picco gamma H due AX più elevati nelle cellule di glioblastoma che diminuiscono più lentamente e rimangono significativamente elevati in 24-48 ore rispetto alla radiazione fotonica alla stessa dose fisica. Sia per gli ioni di carbonio che per la radiazione fotone, i due livelli di gamma H due AX erano più alti nelle cellule di una fase G probabilmente perché la riparazione della rottura del doppio filamento del DNA è limitata alla via dell'unione finale non disomologa in questa fase del ciclo cellulare.
In linea con il più alto tasso di induzione di rottura a doppio filamento e la cinetica di riparazione più lenta, gli ioni di carbonio inducono un arresto del ciclo cellulare più forte e più duraturo in fase G due e un tasso di apoptosi più elevato rispetto ai fotoni. A seconda della forza dell'effetto di trattamento, la risoluzione delle diverse fasi del ciclo cellulare può essere impegnativa. In alcune linee cellulari, la concentrazione di DAPI ha un grande impatto sulla qualità del profilo del ciclo cellulare e deve essere regolata.
Le diapositive possono essere preparate dai campioni rimanenti dopo la citometria del flusso per valutare il numero, le dimensioni e la forma della gamma H due focolai AX e per distinguere tra gamma focale e parnucleare H due colorazioni AX. Usando il nostro metodo, potremmo dimostrare che le cellule staminali mesenchimali sono relativamente resistenti alle radiazioni ionizzanti e all'inibizione della topoisomerasi ma sensibili alla gliomicina. Poiché i fumi PFA sono tossici, utilizzare sempre una cappa aspirante durante la preparazione della soluzione di fissazione e durante la fase di fissazione.
Ricorda anche di indossare guanti durante la manipolazione di DAPI.
