Isolare le cellule progenitrici muscolari umane che regolano la rigenerazione muscolare scheletrica ci consente di indagare processi che sono alla base del processo rigenerativo pur mantenendo la variabilità del donatore. Questa tecnica consente di ottenere grandi rese di cellule progenitrici muscolari umane da piccole quantità di tessuto e la loro analisi fenotipico utilizzando un piccolo numero di cellule. Questo metodo è specificamente progettato per isolare le cellule progenitrici muscolari umane per tracciare le loro capacità di proliferazione e differenziazione e per correlare questi dati al processo rigenerativo muscolare scheletrico.
L'aspetto più difficile di questa tecnica abbastanza semplice è garantire che ogni passaggio sia eseguito in modo riproducibile per ottimizzare la resa e la purezza delle cellule. È necessario completare più passaggi per un corretta isolamento delle celle. Molti dei passaggi sono più facili da capire se vengono osservati visivamente.
Per isolare le cellule progenitrici muscolari umane dal tessuto della biopsia, posizionare il tessuto muscolare in una piastra di Petri sterile in condizioni sterili e utilizzare un bisturi sterile per tritare il tessuto in pezzi a cubetti di un millimetro. Quando tutto il tessuto è stato tritato, trasferire i pezzi in un tubo da 15 millilitri contenente 10 millilitri di PBS e lasciare che i tessuti si sistemino per gravità prima di aspirare attentamente il supernatante senza disturbare il tessuto. Dopo aver lavato i frammenti una seconda volta come appena dimostrato, sostituire il PBS con 10 millilitri di mezzo Eagle modificato di Dulbecco a basso glucosio.
Rimuovere il supernatante dopo che i tessuti sono stati sistemati e rimescolare i pezzi in tre millilitri di mezzo di digestione. Posizionare i tessuti a 37 gradi Celsius per 30 minuti, con triturazione dei frammenti muscolari ogni 10 minuti con una pipetta sierologica da un millilitro. Al termine dell'incubazione, aggiungere 83 microlitri di mezzo di digestione aggiuntivo e 24 microlitri di soluzione di dispasi ai campioni e triturare i tessuti ogni cinque-10 minuti con una punta di pipetta a foro largo fino a ottenere un liquame uniforme.
Un liquame uniforme è importante per il massimo recupero delle cellule progenitrici muscolari umane. Continuare la digestione se il liquame non passa attraverso una punta standard di pipetta da 1.000 microliter. Per isolare le cellule positive di Pax7, macchiare e gateare le cellule secondo il protocollo.
Ordinare le cellule progenitrici muscolari umane doppie positive CD56, CD29 su un citometro a flusso con un ugello da 100 micrometri a una pressione di 20 libbre per pollice quadrato in tubi di raccolta contenenti un cuscino da 300 microliter di tampone di smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. Quindi seminare le cellule progenitrici muscolari umane ordinate in piastre di 24 po 'rivestite di collagene contenenti mezzo di crescita pre-riscaldato a una concentrazione quadrata 3,5 per 10 alla quarta parte per centimetro. Per eseguire scansioni di confluenza, caricare la piastra su un citometro di imaging e selezionare Crea nuova scansione e categoria piastra, profilo piastra e ID piastra.In Applicazione selezionare Confluenza e Confluenza 1 e selezionare un pozzo da visualizzare.
Individuare un piano di messa a fuoco in cui le celle appaiono bianche rispetto allo sfondo e selezionare Registra manuale. Utilizzare il mouse per evidenziare tutti i pozzali da analizzare e selezionare Avvia analisi. L'intera area del pozzo verrà scansionata automaticamente.
Selezionate le impostazioni di analisi ottimali per il tipo di piastra e cella e selezionate Avvia analisi (Start Analysis). Utilizzare il citometro di imaging per misurare inizialmente la confluenza. Quindi, per contare le cellule sul citometro di imaging, sostituire il mezzo in ogni pozzo con 200 microlitri di soluzione di colorazione.
Dopo 15 minuti a 37 gradi Celsius, sostituire la soluzione di colorazione con 100 microlitri di F12 di prosciutto fresco. Riportare la piastra al citometro di imaging e in Applicazione selezionare Vitalità cella e Totale morto vivo. Il canale Live sarà un'immagine a campo luminoso, il canale Dead mostrerà la colorazione del propidio ioduro e il canale Totale sarà la colorazione Hoechst 33342.
In Configurazione messa a fuoco fare clic su Registra automaticamente. Sotto il canale Totale, impostare il canale su blu. Utilizzate Trova messa a fuoco (Find Focus) per mettere a fuoco i nuclei e fate clic su Imposta offset (Set Offset) per selezionare lo stato attivo.
Sotto il canale Morto, imposta il canale su rosso e usa Trova messa a fuoco per mettere a fuoco le celle morte. Fate clic su Imposta offset (Set Offset) per selezionare lo stato attivo e selezionate Avvia analisi (Start Scan) per avviare l'analisi. Selezionare quindi i parametri di analisi appropriati per il tipo di piastra e cella e selezionare Avvia analisi per avviare l'analisi.
Al termine dell'analisi, verificare visivamente che l'analisi conterà in modo appropriato le celle. Se la scansione e l'analisi sono soddisfacenti, restituire la piastra all'incubatore, altrimenti riscansare o modificare i parametri di analisi. Le cellule progenitrici muscolari umane possono essere identificate da primi eventi di gating basati sull'area di dispersione laterale e anteriore per eliminare cellule morte o detriti, seguiti selezionando solo le cellule che sono negative per 7-AAD e quindi sono vitali.
Le cellule positive sia per i marcatori di superficie cellulare CD56 che CD29 rappresentano quindi la popolazione cellulare progenitrice muscolare umana. Le cellule progenitrici muscolari umane possono anche essere identificate dalla loro espressione Pax7. In effetti, Pax7 è arricchito nella popolazione totale dopo facs e viene mantenuto attraverso più passaggi.
Qui viene mostrata una scansione di confluenza rappresentativa. I contorni verdi sono stati generati dal citometro di imaging e mostrano come il citometro di imaging ha determinato la confluenza in base alle impostazioni di analisi selezionate. Un'eterogeneità e un conteggio dei nuclei è comune tra i donatori.
Scoprire e caratterizzare accuratamente questa eterogeneità è un'applicazione chiave del citometro di imaging. Le misurazioni della confluenza e il conteggio dei nuclei da donatori unici, tuttavia, sono altamente correlati. Le cellule progenitrici muscolari umane differenziate per formare miotubi possono essere distinte per la loro espressione della catena pesante della miosina embrionale.
È importante essere coerenti quando si selezionano i parametri di gating sul citometro di flusso al fine di isolare la stessa popolazione di cellule da ogni donatore. Una volta isolate, le cellule progenitrici muscolari umane possono essere utilizzate per molteplici scopi, tra cui l'identificazione dei requisiti metabolici unici di proliferazione e differenziazione delle cellule progenitrici muscolari umane. L'isolamento delle cellule progenitrici muscolari umane ha permesso la discriminazione delle differenze nell'espressione del marcatore della superficie cellulare sulle cellule progenitrici muscolari umane e del topo.
