L'espansione ex vivo delle cellule staminali ematopoietiche dall'unità sanguigna del cordone ombelicale promette molto per l'applicazione dell'HSC nella medicina rigenerativa e nella terapia dei trapianti. Questo protocollo utilizza un cocktail di citochine combinato con il trattamento con acido valproico per espandere rapidamente un gran numero di HSC funzionali con caratteristiche che assomigliano molto agli HSC primitivi primari. A causa dei rapidi effetti del trattamento con acido valproico, questo metodo ha anche il potenziale per superare la perdita di HSC associati all'editing genico.
Questo metodo potrebbe essere utile per la generazione di un maggior numero di cellule geneticamente modificate entro un periodo di tempo rilevante per i protocolli di modifica genica attualmente utilizzati. Il protocollo di espansione ex vivo dell'acido valproico è relativamente semplice e affidabile. La purificazione delle cellule cd34-positive con il dispositivo separatore cellulare è altamente riproducibile e rapida, consentendo un rapido recupero di cellule CD34 positive altamente purificate.
24 ore prima dell'isolamento delle cellule positive CD-34 dal sangue del cordone ombelicale, preparare il tampone di separazione aggiungendo due millilitri di EDTA molare 0,5 e 33 millilitri del 7,5%BSA a 465 millilitri di 1X PBS. Mescolare delicatamente il tampone e mantenerlo durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno della purificazione, riscaldare il supporto a temperatura ambiente.
Erogare l'intera unità di sangue del cordone ombelicale in un pallone di 75 centimetri quadrati. Diluire il sangue con un volume uguale di PBS a temperatura ambiente e mescolare delicatamente. Successivamente, determinare il numero di tubi necessari per l'elaborazione dell'intera unità sanguigna del cordone ombelicale.
Aggiungere 15 millilitri di mezzi gradienti di densità a ciascun tubo. Erogare il sangue diluito molto lentamente sopra il gradiente di densità mantenendo il tubo con un angolo di 45 gradi per creare due strati. Centrifugare il tubo a 400 g per 30 minuti con una bassa accelerazione e velocità di decelerazione.
Dopo la centrifugazione, le cellule mononucleari si trovano nello strato bianco tra gli strati del plasma e del gradiente di densità. Trasferire con cura lo strato di mantello buffy in un nuovo tubo da 50 millilitri. Raccogliere tutte le cellule mononucleari dalla stessa unità sanguigna del cordone ombelicale in un tubo da 50 millilitri fino a raggiungere i 25 millilitri.
Aggiungere 25 millilitri di PBS freddo al tubo contenente 25 millilitri di cellule mononucleari e mescolare bene. Centrifuga a 400 g e a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Aspirare con cura il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in 50 millilitri di PBS freddo.
Successivamente, rimuovere 20 microlitri della sospensione cellulare per il conteggio. Utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare il numero di celle macchiate con acridina arancione o ioduro di propidio e calcolare il numero totale di cellule mononucleari. Quindi, centrifugare le cellule a 400 g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti.
In primo luogo, mescolare 300 microlitri di tampone di separazione con 100 microlitri di IgG umano FCR umano e 100 microlitri di perline magnetiche CD34 per isolare le cellule cd34-positive da 10 milioni di cellule mononucleari. Successivamente, rimuovere con cura il supernatante da un tubo di cellule mononucleari precedentemente centrifugate. Resuspend il pellet nella soluzione di perline magnetiche utilizzando 500 microlitri per 10 milioni di cellule.
Mescolare delicatamente e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Durante l'incubazione, preparare il dispositivo separatore cellulare sostituendo la soluzione di stoccaggio con il tampone di lavoro ed eseguendo un programma di lavaggio seguito da un programma di risciacquo. Quindi, aggiungere il buffer di funzionamento del separatore di celle fredde al tubo che contiene la miscela cellulare fino a quando il tubo non è completamente riempito.
Centrifugare il tubo a 400 g e a quattro gradi Celsius per 15 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare il pellet cellulare in tampone di funzionamento separatore freddo utilizzando due millilitri per 10 milioni di cellule. Trasferire la miscela di sospensione cellulare a due millilitri in tubi da 15 millilitri.
Caricare tre set di tubi nel rack separatore di celle, che è stato pre-refrigerato a quattro gradi Celsius. Un insieme di tubi contiene MMC, il secondo set di tubi verrà utilizzato per raccogliere la frazione negativa e un terzo set di tubi verrà utilizzato per raccogliere celle cd34-positive purificate. Caricare il rack nel dispositivo separatore di cella ed eseguire il programma preimpostato.
Successivamente, centrifugare i tubi contenenti la frazione positiva a 400 g e quattro gradi Celsius per 15 minuti. Aspirare il supernatante e rimescolare le cellule cd34-positive purificate in un millilitro di supporti senza siero. Quindi, utilizzare un contatore di celle automatizzato per contare le celle macchiate con arancio acridina o ioduro di propidio.
In primo luogo, preparare un volume sufficiente di supporti per placcare le cellule cd34 positive purificate ad una densità di 33.000 cellule per millilitro. Placcare le cellule cd34 positive purificate in una piastra da 12 porri a una densità cellulare di 50.000 cellule in 1,5 millilitri di supporto per pozzo. Incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica per 16 ore.
Aggiungere acido valproico alle colture in modo che la concentrazione finale sia di un millimolare. Continuare a coltivare le cellule alle stesse condizioni per altri sette giorni. In questo protocollo ex vivo, il numero di cellule staminali ematopoietiche primitive generate da cellule positive cd34 isolate dal sangue del cordone ombelicale è aumentato.
Il numero totale di cellule nucleate è significativamente più elevato nelle colture trattate con il solo cocktail di citochine. Nonostante il maggior numero di cellule nucleate totali, il numero di cellule staminali ematopoietiche nelle colture che ricevono il cocktail di citochine da solo rimane basso durante l'intero periodo di espansione, rispetto alle colture trattate con cocktail di citochina e acido valproico. Il maggior numero di cellule staminali ematopoietiche viene generato in colture trattate con una combinazione del cocktail di citochine e dell'acido valproico.
In particolare, la maggiore espansione viene raggiunta dopo cinque o sette giorni dopo il trattamento con acido valproico. Questo aumento del numero di cellule staminali ematopoietiche è correlato con un rapido aumento della percentuale di cellule staminali ematopoietiche, che è notevole entro 24 ore dal trattamento con acido valproico. Mentre l'aumento della percentuale viene mantenuto durante i primi quattro giorni di coltura ex vivo, diminuisce progressivamente dopo cinque o sette giorni di trattamento.
Tuttavia, questa diminuzione è inversamente correlata con un aumento del numero assoluto di cellule staminali ematopoietiche. Il rapido aumento della percentuale di cellule staminali ematopoietiche nelle colture trattate con acido valproico è dovuto all'acquisizione del fenotipo CD90. Le cellule cd34 positive che esprimono il marcatore fenotipico CD90 raggiungono quasi il 40-50% delle cellule espanse in colture ex vivo trattate con il cocktail di citochine e l'acido valproico per quattro giorni.
L'acquisizione del fenotipo CD90 è poi confermata dall'espansione ex vivo delle cellule cd34-positive altamente purificate che mancano di espressione del marcatore CD90. Entro 24 ore dal trattamento con acido valproico, quasi il 75% delle cellule espanse ex vivo esprime CD90. Questo fenotipo è altamente mantenuto durante i primi quattro giorni in queste culture.
Il sangue del cordone ombelicale diluito deve essere erogato molto lentamente sopra il gradiente di densità mantenendo il tubo con un angolo di 45 gradi per creare due strati distinti. Seguendo questa procedura di espansione ex vivo, le cellule espanse possono essere iniettate nei topi NSG immuno-carenti mieloablati per testarne la funzionalità e il potenziale di innesto. Le cellule espanse possono essere utilizzate per testare una varietà di domande riguardanti la biologia dell'HSC umano e del topo e il ruolo di diversi geni o giocatore critico sull'integrità funzionale degli HSC.
La funzionalità dell'HSC espanso ex vivo dall'unità ematica del cordone ombelicale umano, utilizzando questa tecnica, sarà presto testata in uno studio clinico in paziente con neoplasie maligne ematologiche che richiedono il trapianto di midollo osseo allogenico. Questa tecnica ci ha anche permesso di indagare il meccanismo alla base dell'espansione ex vivo con il trattamento VPA e ottenere approfondimenti sulla biologia degli HSC primitivi.
