Questo protocollo è significativo, perché utilizza un metodo di visualizzazione privo di macchie invece di una visualizzazione basata sulla tintura sul tessuto cerebrale umano post-mortem, che aiuta a preservare l'integrità dell'RNA. La conservazione dell'RNA è un grande vantaggio in questo protocollo, in quanto è utile, non solo nel tessuto cerebrale umano post-mortem, ma anche in altri tipi di tessuti, con alta attività RNasi. Per iniziare, rimuovere il tessuto dal congelatore e posizionarlo sul ghiaccio secco per il trasporto al criostato.
Posizionare i pennelli puliti, il mandrino e il tessuto nel criostato per almeno 20 minuti, per consentire loro di raggiungere la temperatura ottimale. Per i criostatici con camere doppie e temperature di tenuta del campione, impostare la temperatura dell'oggetto su meno 16 gradi Celsius e la temperatura della camera a meno 18 gradi Celsius. Impostare lo spessore della sezione del criostato su 14 micrometri e lo spessore dell'assetto a 30 micrometri.
Quindi, pulire il palco con una miscela uno-a-uno di decontaminatore di RNasi e 70% di etanolo, per evitare il congelamento. Ottenere una nuova lama criostatica usa e getta e pulirla con decontaminatore RNase. Posizionare la lama pulita nel supporto della lama sul palco.
Quindi, pulire la piastra antirollio con il decontaminatore RNase. Attaccare la piastra pulita al palco e attendere almeno 20 minuti che la lama e la piastra antirollio si aggireranno alla temperatura del criostato. In primo luogo, tagliare un piccolo pezzo di tessuto per la sessatura, assicurandosi che la sezione sia circa il 95% della corteccia cerebellare.
Riportare il tessuto rimanente a ghiaccio secco, o a in un congelatore, a meno 80 gradi Celsius. Quindi, iniziare lentamente ad aggiungere lo Strumento di personalizzazione di Office sopra il mandrino con un movimento lento e circolare. Costruisci strati di OTC fino a quando non c'è un supporto alto circa tre millimetri che copre il mandrino.
Quando lo Strumento di personalizzazione di Office è parzialmente congelato, ma ha ancora del liquido al centro, posizionare i tessuti sopra il supporto. Lasciare riposare il tessuto sopra lo Strumento di personalizzazione di Office per uno o due minuti fino a quando non è completamente congelato. Quindi, trasferire il mandrino con l'OCT congelato e il tessuto nel braccio di taglio del criostato.
Regolare il tessuto in modo che sia a filo con la lama da taglio e lasciare riposare il tessuto nel braccio di taglio per 20 minuti per adattarsi alla nuova temperatura. Il passaggio più critico è consentire al tessuto di acclimatarsi nel braccio di taglio del criostato per tutto il tempo necessario. Se i tessuti si distruggono, la visualizzazione delle cellule purkinje sarà molto difficile.
Consiglio di utilizzare pezzi di tessuto più piccoli e sottili, per consentire al tessuto di acclimatarsi più velocemente. Dopo questo, spostare lentamente il tessuto più vicino alla lama. Una volta che il tessuto ha raggiunto la lama, iniziare il processo di taglio.
Tagliare il tessuto da due a tre volte, fino a quando gli strati della corteccia sono visibili. Quindi, posizionare e allineare la piastra antirollio appena sopra la lama del criostato. Tagliare da quattro a sei sezioni dello spessore di 14 micrometri, notando che le sezioni correttamente tagliate saranno piatte sotto la piastra antirollio.
Allineare le sezioni tagliate orizzontalmente attraverso lo stadio criostato. Inclinare una diapositiva per raccogliere tutti i pezzi di tessuto contemporaneamente. Subito dopo aver sessato il tessuto, posizionare lo scivolo nel supporto dello scivolo con il 70% di etanolo sul ghiaccio per due minuti.
Trasferire lo scivolo su un supporto scorrevole con 95% di etanolo sul ghiaccio per 45 secondi. Quindi, posizionare lo scivolo nel supporto scorrevole con 100% di etanolo a temperatura ambiente per due minuti. Immergere lo scivolo tre volte nel porta scorrevole contenente xilene numero uno a temperatura ambiente.
Quindi, posizionare lo scivolo nel porta scorrevole con xilene due a temperatura ambiente per cinque minuti. Metti gli scivoli in una cappa pulita e lasciali asciugare all'aria per almeno 30 minuti. Se si conservano i vetrini, posizionare ciascuno in un tubo separato da 50 millilitri e posizionare i tubi in un congelatore a meno 80 gradi Celsius per un massimo di sette giorni.
In primo luogo, utilizzare il decontaminatore RNase per pulire lo stadio del microscopio e il braccio di raccolta del cappuccio. Con le mani guantate, posizionare lo scivolo al microscopio e un cappuccio opaco da 500 microliter nel braccio di raccolta. A basso ingrandimento, allineare il cappuccio opaco sul tessuto cerebellare, assicurando che il cappuccio copra l'intera area che viene visualizzato nell'oculare.
Usa un obiettivo da cinque a 10 volte per visualizzare gli strati cerebellari. Posizionare il cursore sulla sezione in cui lo strato molecolare e lo strato di cellule granuali si intersecano. Passare a un ingrandimento 40 volte superiore e visualizzare le celle purkinje.
Quindi, inizia a catturarli. Per iniziare la raccolta dell'RNA dopo la microdisezione, aggiungere 50 microlitri di tampone dilisi cellulare al cappuccio opaco con il cappuccio rivolto verso l'alto. Chiudere attentamente il tubo sopra il cappuccio e procedere con la raccolta come delineato nel protocollo di testo.
In questo protocollo, fresco, congelato, post mortem, il tessuto cerebrale umano è preparato per la microdisezione di cattura laser UV. Dopo la sezione del criostato nel tempo di disegno assegnato, gli strati cellulari del cervelletto sono facilmente visibili con lenti cinque volte e 10 volte obiettive. Come visto qui, una corretta incubazione di xilene fa sì che il tessuto diventi più scuro e delinea meglio gli strati cellulari rispetto all'etanolo da solo.
Quando si taglia al microscopio di cattura laser, l'obiettivo 40 volte è necessario per garantire la cattura solo delle cellule purkinje e non del tessuto circostante. Come si vede qui, una corretta incubazione in xilene produce un'immagine morfologicamente intatta di alta qualità rispetto alla sola fissazione dell'etanolo. La capacità di slittamento della copertura di un cappuccio opaco viene quindi testata mentre altri protocolli utilizzano un cappuccio riempito di liquido, questi tappi possono ridurre la visualizzazione dei tessuti e causare la granularità e l'iridescenza dell'immagine risultante al microscopio.
Tuttavia, la visualizzazione attraverso un cappuccio opaco si traduce nell'aspetto del tessuto levigato che è più morbido e più nitido nella forma. Immagini rappresentative delle cellule purkinje accisa a bassa potenza e ad alta potenza mostrano una rimozione precisa solo del corpo cellulare purkinje. Dopo questo, l'Rnase di alta qualità viene ottenuto per il successivo sequenziamento dell'RNA.
Sei campioni rappresentativi sono stati sottoposti a estrazione di RNA e sono stati rimescolati in 14 microlitri di acqua priva di Rnase e tutti e sei i campioni hanno prodotto RNA di alta qualità con numeri di integrità dell'RNA pari o superiore a otto. La cosa più importante da ricordare è che la qualità dei tessuti è tutto. Anche il taglio e il posizionamento delle diapositive faranno o infrangeranno questo protocollo.
Seguendo questa procedura, qualsiasi metodo che indaghi sull'RNA o sul DNA potrebbe essere eseguito, in particolare sondiamo il nostro RNA per l'espressione genica differenziale, ma potrebbero essere studiate anche altre domande riguardanti la regolazione genica. Questo metodo potrebbe essere applicato a qualsiasi tipo di tessuto che abbia una morfologia specifica delineata che non richieda l'uso di antigeni o reagenti specifici del colorante per l'identificazione di cellule di interesse. Speriamo che questa tecnica ci aiuti a comprendere la genetica del tremore essenziale e di altre malattie che hanno un fenotipo del tremore.
La sostanza chimica più pericolosa utilizzata in questo protocollo è lo xilene. Deve essere maneggiato correttamente in una cappa aspirante, smaltito correttamente e gli scivoli devono essere autorizzati ad asciugarsi adeguatamente fino a quando non vengono utilizzati in uno spazio aperto. Inoltre, quando si lavora con campioni umani, è necessario utilizzare la gestione dei rifiuti pericolosi e la sicurezza.
