Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia vascolare cerebrale in relazione alla regolazione del flusso sanguigno cerebrale durante l'invecchiamento e lo sviluppo di malattie croniche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente la misurazione simultanea del calcio intracellulare e del potenziale di membrana dell'endotelio arterioso cerebrale nella sua forma nativa in condizioni fisiologiche. Per isolare il cervello del topo, al microscopio rimuovere la pelle e i capelli sul cranio.
E rimuovere il sangue eccessivo con PSS senza calcio freddo. Successivamente, fare un'incisione usando solo le punte delle forbici di dissezione standard. A partire dall'osso occipitale e estendendosi attraverso l'osso nasale del cranio.
Quindi aprire attentamente il cranio lungo l'incisione, usando forcep dalla punta grossolana e separare il tessuto connettivo per esporre il cervello. Lavare delicatamente il cervello isolato con PSS freddo privo di calcio in un becher per rimuovere il sangue. Posizionare il lato ventrale cerebrale in una camera contenente soluzione di dissezione fredda per l'isolamento delle arterie cerebrali.
Per isolare le arterie cerebrali, fissare il cervello isolato in soluzione di dissezione fredda inserendo due perni in acciaio inossidabile attraverso di essa, in un rivestimento polimerico di silicio infuso di carbone sul fondo di una piastra di Petri in vetro. Successivamente, isolare chirurgicamente le arterie cerebrali posteriori di circa 0,3-0,5 centimetri dalle arterie comunicanti e basillari posteriori. Utilizzare perni in acciaio inossidabile per fissare entrambe le arterie cerebrali posteriori isolate nella soluzione di dissezione nella piastra di Petri.
Quindi pulire attentamente le arterie cerebrali posteriori isolate rimuovendo il tessuto connettivo utilizzando forcelle affilate a punta fine. Tagliare le arterie intatte in segmenti da uno a due millimetri per la digestione enzimatica. In questa procedura, preparare l'apparato di triturazione utilizzando un microscopio, una fotocamera e uno stadio di alluminio che tiene una camera e micromanipolatori.
Fissare una microsiringa con un controller della pompa adiacente allo stadio e al campione. Successivamente riempire completamente una pipetta di titolazione con olio minerale e fissarla sul pistone di microsiringa. Quindi l'utilizzo della microsiringa con il controller della pompa preleva circa 130 nanolitri di soluzione di dissociazione nella pipetta garantendo al contempo l'assenza di bolle d'aria.
Successivamente, posizionare segmenti arteriosi intatti in un millilitro di soluzione di dissociazione con le concentrazioni richieste di enzimi in un tubo di vetro da 10 millilitri. Incubare a 34 gradi Celsius per 10-12 minuti per la digestione parziale. Dopo la digestione, sostituire la soluzione enzimatica con cinque millilitri di soluzione di dissociazione fresca.
Utilizzando una pipetta da un millilitro, trasferire un segmento nella camera contenente la soluzione di dissociazione a temperatura ambiente. Quindi posizionare la pipetta nella soluzione di dissociazione nella camera e posizionarla vicino a un'estremità del vaso digerito. Impostare una velocità nell'intervallo da due a cinque nanolitri al secondo sul controller della pompa per una triturazione delicata.
Durante la visualizzazione attraverso 100 volte o 200 volte l'ingrandimento si ritira ed espelle il segmento arterioso per dissociare le cellule muscolari lisce mentre si produce un tubo endoteliale. Se necessario, utilizzare con cura le forcep a punta fine per separare l'avventizia dissociata e la lamina elastica interna dal tubo endoteliale. Confermare che tutte le cellule muscolari lisce sono dissociate e che solo le cellule endoteliali rimangono come tubo intatto.
Utilizzando micromanipolatori, fissare ogni estremità del tubo endoteliale sullo scivolo di copertura in vetro della camera di superfusione utilizzando pipette di pinning in vetro borosilicato. Lavare l'avventizia dissociata e levigare le cellule muscolari dalla camera. E sostituire la soluzione di dissociazione con due molare più cloruro di calcio PSS.
Trasferire la piattaforma mobile con tubo endoteliale protetto al microscopio di superfusione e rig sperimentale. Quindi utilizzare sei serbatoi puliti da 50 millilitri per la consegna continua di PSS e delle rispettive soluzioni farmacologiche durante l'esperimento. Utilizzare la valvola di controllo del flusso in linea per impostare manualmente la portata in modo coerente come il flusso laminare, abbinando l'alimentazione del flusso all'aspirazione sottovuoto.
Consegnare PSS alla camera per la superfusione del tubo endoteliale per almeno cinque minuti prima di registrare i dati di sfondo e il caricamento del colorante. Per misurare il potenziale della membrana contemporaneamente alla concentrazione di calcio intracellulare, tirare un elettrodo affilato e riempirlo con due cloruri di potassio molare da registrare da cellule cariche di colorante fura-2. Per studiare l'accoppiamento intracellulare tramite trasferimento di colorante, riempire il microelettrodo con lo 0,1% di ioduro di propidio disciolto in due cloruri molari di potassio.
Quindi posizionare l'elettrodo su un filo d'argento rivestito con cloruro nel supporto della pipetta attaccato a uno stadio di testa dell'elettrometro fissato con un micromanipolatore. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare brevemente la punta dell'elettrodo nel PSS che scorre nella camera, mentre si guarda attraverso l'obiettivo quattro volte. Successivamente, impostare il potenziale della membrana a riposo su zero come coerente con il potenziale del bagno a terra.
Se lo si desidera, utilizzare monitor di linea udibili collegati agli elettrometri per associare l'intonazione del suono a potenziali registrazioni. Successivamente, aumentare l'ingrandimento a 400 volte usando un obiettivo 40 volte e posizionare la punta dell'elettrodo appena sopra la cella del tubo endoteliale. Regolare la finestra fotometrica utilizzando il software di fotometria per concentrarsi su circa 50-80 cellule endoteliali.
Quindi posizionare delicatamente l'elettrodo in una delle cellule del tubo endoteliale utilizzando il micromanipolatore e attendere almeno due minuti che il potenziale della membrana a riposo si stabilizzi. Una volta che il potenziale della membrana a riposo è stabile al suo valore previsto, accendere il tubo fotomoltiplicatore sull'interfaccia a fluorescenza in assenza di luce e iniziare l'acquisizione della concentrazione di calcio intracellulare mediante eccitante Fura-2 alternativamente a 340 e 380 nanometri mentre si raccoglie l'emissione di florescence a 510 nanometri. Una volta stabilite le misurazioni simultanee del potenziale di membrana e della concentrazione intracellulare di calcio, consentire circa cinque minuti per la superfusione di tubo endoteliale con PSS a una portata laminare costante prima dell'applicazione dei farmaci.
Applicare il farmaco preparato in PSS alla camera di superfusione a una portata costante. Durante il trattamento farmacologico misurare contemporaneamente il potenziale di membrana nei rapporti F340/F380. Una volta fatto l'esperimento, ritirare l'elettrodo dalla cella.
Quindi interrompere le rispettive registrazioni del potenziale di membrana e della concentrazione di calcio intracellulare e salvare i file per l'analisi dei dati. Questa è un'immagine a contrasto di interferenza differenziale di un tubo endoteliale arterioso cerebrale del mouse, regolata per sperimentare in una finestra fotometrica usando un obiettivo 40 volte. Un elettrodo affilato viene posizionato in una cella, come mostrato nella parte superiore dell'immagine.
Ecco gli esempi di tracce grezze per la misurazione simultanea del rapporto F340/F380 e del potenziale di membrana in risposta a 100 ATP micromolare. Seguendo questa procedura, altri metodi come la microscopia fluorescente confocale, possono essere eseguiti al fine di rispondere a ulteriori domande riguardanti la segnalazione del microdominio del calcio endoteliale e le specie reattive dell'ossigeno, come esempi. In generale questa tecnica continuerà a spianare la strada alle ricerche in fisiologia cellulare per esplorare la funzione vascolare e l'invecchiamento nel sangue e nella circolazione linfatica.
