Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda su come l'integrazione del provirus HIV influenzi l'espressione genica androgina e perché alcuni siti di integrazione genomica vengano selezionati nelle cellule infettate dall'HIV negli ultimi tempi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che possono essere prodotti modelli in vitro per l'infezione da HIV, che trasportano reporter pro-virali mirati a siti di integrazione scelti utilizzando l'ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9. A dimostrare la procedura saranno Thomas Walther, dottorando, e Julia Bialek, un postdoc del mio laboratorio.
Inizia usando UCSC Genome Browser per in-silico-estrarre la sequenza genomica del locus genomico desiderato da prendere di mira. Per scegliere gli RNA guida di 20 nucleotidi per il targeting del locus genomico scelto, utilizzare lo strumento web E-CRISP. Quindi selezionare Homo Sapiens Genome Reference Consortium Human Genome:Build 38.
Genoma di riferimento come organismo e input 2.000 coppie di basi della sequenza genomica, che coprono il locus genomico desiderato precedentemente estratto. Avvia una ricerca di guide-RNA utilizzando impostazioni di applicazione medie con qualsiasi PAM, qualsiasi 5-prime-base, fuori bersaglio tollerano disallineamenti e introni esclusi e isole CPG. Dall'elenco con possibili progetti di guida-RNA che appare, selezionare un RNA guida con un punteggio elevato per specificità ed efficienza, che è il più vicino possibile al locus genomico desiderato da prendere di mira.
Aprite il browser NCBI Blast per far esplodere la sequenza guida-RNA scelta contro il genoma di riferimento. Per verificare l'unicità del sito di associazione guida-RNA selezionato, selezionare prima l'essere umano come genoma e quindi inserire la sequenza guida-RNA come sequenza di query. Quindi seleziona sequenze altamente simili o Mega Blast come programma per assicurarti che la sequenza guida-RNA sia unica.
Successivamente, selezionare in-silico 1.000 coppie di basi, a monte e a valle della sequenza guida-RNA dalla sequenza genomica estratta all'inizio. Usa queste 1.000 coppie di basi selezionate, a monte e a valle come bracci di omologia a cinque e tre primi per mirare alla costruzione vettoriale e alla sequenza di reporter adiacente da prendere di mira. 24 ore prima della trasfezione delle cellule T di jurkat, preparare una piastra completa di 6 pozzetti delle cellule per un singolo esperimento di targeting.
Per iniziare, piastra 1, 250,000 cellule in 2,5 millilitri di RPMI 1640 con integratori e senza antibiotici, per pozzo. Il giorno seguente, aggiungere ai microgrammi di vettore di targeting circolare e due microgrammi di Cas9 e plasmide di espressione guida-RNA per pozzo, a 250 microlitri di mezzo RPMI commerciale ottimizzato per la trasfezione, in un tubo di reazione e mescolare bene con il vortice. Quindi aggiungere lentamente 12 microlitri di agente trasfezione al mezzo di DNA senza toccare la parete del tubo.
Scorrere il tubo e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere la miscela dropwise a un pozzo di cellule. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.
E 72 ore dopo la trasfezione, estrarre le cellule trasfette, contarle e prepararsi per l'arricchimento da parte della FACS. Dopo aver confermato gli eventi di targeting nella popolazione di cellule miste mirate, inizia a generare cloni a singola cellula preparando in anticipo mezzi condizionati con jurkat, raccogliendo RPMI con antibiotici da cellule T di jurkat sane e non trattate. Centrifugare i tubi per 5 minuti a 300 G e filtrare il supernatante con una siringa da 25 millilitri, utilizzando un filtro da 0,22 micrometri in nuovi tubi conici da 50 millilitri.
Contare le cellule mirate precedentemente arricchite dalla FACS, da 10 a 14 giorni dopo l'espansione, e poi diluirle in RPMI con antibiotici a una concentrazione di 100.000 cellule per millilitro. Diluire 100 microlitri di questa diluizione cellulare con 9,9 millilitri di mezzo per ottenere 1.000 cellule per millilitro. Quindi diluire un millilitro di questa diluizione con nove millilitri di mezzo a una concentrazione di 100 cellule per millilitro.
Per placcare 96 piastre di pozzo per contenere una cella per pozzo, mescolare delicatamente un millilitro di soluzione da 100 cellule per millilitro con cinque millilitri di mezzo di condizione e quattro millilitri di mezzo fresco, in un serbatoio di reagente sterile. Quindi, utilizzare una pipetta multicanale per aggiungere 100 microlitri della rispettiva diluizione cellulare per pozzo di nuove piastre inferiori rotonde da 96 po 'per ottenere una e due celle per diluizioni del pozzo. Impilare le 96 piastre del pozzo e coprire ogni pila con una piastra a sei pozza di pozzo contenente tre millilitri di PBS per pozzo.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con 5% di anidride carbonica, per tre settimane. Dopo aver completato l'incubazione, confermare visivamente la presenza di colonie coltivate utilizzando la microscopia leggera con ingrandimento quattro volte superiore e contrassegnare i pozzi con colonie coltivate. Resospend delicatamente le cellule di una marcata bene dalla pipettazione.
Trasferire 100 microlitri di questa sospensione cellulare in un unico pozzo di piastra inferiore rotonda da 96 ben preparata con 100 microlitri di RPMI con antibiotici, per pozzo e ripetere per tutti i pozzi contrassegnati, mescolare delicatamente con pipettazione. Per duplicare la piastra, trasferire 100 microlitri di questa sospensione cellulare in una seconda piastra inferiore rotonda vuota da 96 po 'e ripetere questo processo per tutti i pozzi contrassegnati. Infine, riempire i pozzi vuoti con 200 microlitri di RPMI con antibiotici.
Incubare le piastre a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica. Dopo che la piastra duplicata ha incubato per 24-48 ore duplicarla di nuovo aggiungendo 100 microlitri di RPMI con antibiotici ad ogni pozzo. Utilizzare una pipetta multicanale per mescolare delicatamente e trasferire 100 microlitri in ogni pozzo di una nuova piastra a fondo tondo da 96 pozzi.
Posizionare una di queste due piastre duplicate nell'incubatrice. Utilizzare la seconda delle nuove piastre duplicate per la citometria a flusso, aggiungendo prima cinque microlitri di PMA/Ionomicina Master Mix per pozzo, per stimolare le cellule. Incubare per 24 ore e preparare le cellule per la citometria del flusso come descritto nel testo.
Gate tutte le singole celle vitali in base alle dimensioni in avanti e lateralmente. Analizza l'espressione genica del reporter fluorescente per citometria a flusso. Per schermare cloni a cella singola da PCR, progettare primer P5 e P6 per lo screening della PCR in base alla sequenza di reporter scelta, per amplificare da 500 a 800 coppie di basi della sequenza reporter.
Per un controllo positivo PCR, progettare primer P7 e P8 che amplificano 630 coppie di basi di un locus genomico di tipo selvaggio e non mirato. Progettare una terza coppia di primer che amplifica da 500 a 600 coppie di basi della dorsale del vettore di destinazione come controllo per l'integrazione non specifica delle sequenze backbone del vettore di destinazione. Una volta che i cloni nella seconda piastra duplicata sono cresciuti a sufficienza, prepararli per lo screening PCR centrifugando prima la piastra per 10 minuti a 300-G a temperatura ambiente.
Togliere con cura il supernatante, assicurandosi di non disturbare il pellet cellulare. Lavare le celle con 100 microlitri di PBS con pipettazione delicata, centrifugando la piastra per cinque minuti a 300 G a temperatura ambiente. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 microlitri di tampone dilisi per pozzo.
Pipettare delicatamente per mescolare e trasferire la sospensione su una nuova piastra PCR. Sigillare il piatto con pellicola di paraffina e incubare per un'ora a 55 gradi Celsius in un termociclo. Dopo aver centrifugato i detriti cellulari alla massima velocità per 10 minuti, trasferire il supernatante su una nuova piastra PCR.
Aggiungere 10 microlitri di questo lysate cellulare ad ogni pozzo di una piastra PCR da 96 po', riempita con 110 microlitri di H2O distillato, per pozzo. Quindi incubare per 10 minuti a 99 gradi Celsius in un termociclo, per inattivare la proteinasi K.Utilizzare 2 microlitri di questo lisato cellulare come modello e utilizzare un master mix PCR commerciale per lo screening, il controllo e la PCR dorsale. Eseguire PCR per 38-40 cicli di amplificazione PCR in un formato da 96 po'.
Utilizzare cinque microlitri di prodotti PCR ed eseguirli su un gel TAE agarosio dell'1,5% per analizzare e combinare la citometria del flusso e i risultati pcr, per confermare i cloni a singola cella. L'espressione genica reporter dopo l'induzione di PMA/ionomicina è stata confermata sia dalla citometria a flusso che dalla PCR nel 4-12% delle cellule, a seconda del sito di integrazione. L'analisi PCR del DNA genomico utilizzando primer per la giunzione di integrazione a cinque e tre numeri primi, conferma che si sono verificati eventi di targeting.
Dopo lo screening dei cloni a singola cellula per il corretto targeting mediante citometria a flusso, sono stati osservati cloni con espressione genica reporter alta, bassa e senza fluorescente. I cloni a cella singola sono stati confermati anche dalla PCR utilizzando primer e primer di controllo specifici per i reporter. I cloni confermati positivi nello screening della PCR sono stati spesi e ulteriormente analizzati per il corretto targeting da parte di Southern blot, utilizzando una sonda specifica del reporter e un legame genomico-sonda all'esterno del reporter.
Solo una parte ha mostrato le dimensioni corrette delle bande nell'analisi southern blot e aveva integrato eterozabilmente il reporter, dimostrando che è importante verificare i risultati della PCR da parte di Southern blot. I cloni sono stati anche analizzati sequenziando per confermare ulteriormente i cloni positivi a cella singola. Sequenziamento del sito bersaglio:allele omologo, se il reporter non si fosse integrato, ha rivelato mutazioni indotte da Cas9.
Una volta padroneggiata, la generazione di reporter-linee hiv può essere realizzata in due o tre mesi. Prima di mirare, è importante dedicare abbastanza tempo alla scelta di un sito di integrazione e di un reporter appropriato, a seconda della domanda di ricerca che si desidera affrontare. I giornalisti possono, ad esempio, includere diversi elementi normativi sull'HIV, se lo si desidera.
Seguendo questa procedura, le linee cellulari possono ad esempio essere utilizzate per testare l'effetto dei diversi agenti che aumentano la latenza sull'attività trascrizionale del reporter LTR, a seconda del suo sito di integrazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare linee di reporter HIV specifiche del sito di integrazione per progettare RRNA guida e vettore di targeting, eseguire l'ingegneria del genoma basata su CRISPR / Cas9 nelle cellule di jurkat, produrre cloni a singola cellula e selezionare cloni correttamente mirati tramite screening FACS e PCR. Non dimenticare che se scegli di lavorare con un reporter HIV competente per la replicazione, devi lavorare in condizioni di sicurezza BSL3.
