Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia molecolare e cellulare, come l'identificazione di eventi di ricombinazione omologhi nelle cellule staminali embrionali del topo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è accurata, affidabile e ampiamente utilizzata. Quindi, questo metodo può fornire informazioni sull'identificazione di eventi di ricombinazione omologhi nelle cellule staminali embrionali del topo.
Può anche essere applicato ad altri sistemi, come le cellule o gli animali geneticamente modificati. In generale, l'individuo nuovo a questo metodo avrà difficoltà perché richiede molto tempo e comporta più passaggi. Per ogni gDNA, mescolare 30 microlitri di tampone 10 x per DRA uno, tre microlitri di DRA uno e 10 microgrammi di gDNA per campione.
Aggiungere acqua fino a quando il volume finale è di 30 microlitri e incubare a 37 gradi celsius durante la notte per digerire i gDNA. Preparare un gel di elettroforesi all'1%agarosio con bromuro di etidio. Caricare i campioni acquisiti in precedenza insieme a una scala da un KB sul gel e eseguirlo a 30-40 volt durante la notte.
Il giorno dopo, immergere il gel in un vassoio contenente una soluzione di acido cloridrico da 0,2 newton. Utilizzare uno shaker per scuotere delicatamente il vassoio per 20 minuti a temperatura ambiente. Trasferire il gel in un vassoio contenente una soluzione di denaturazione del DNA.
Agitare delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi trasferire il gel in un vassoio contenente una soluzione neutralizzante del DNA. E agitare delicatamente per 20 minuti a temperatura ambiente.
Utilizzando un sistema di trasferimento rapido verso il basso, trasferire i DNA dal gel alla membrana. Quindi, assemblare il grondaio turble e la pila di gonfiore come indicato nelle istruzioni fornite dal produttore. Dopo questo, eseminare la membrana e lavarla con due x citrato di sodio salino per un minuto.
Assorbire il liquido con i tessuti, quindi utilizzare un crosslinker UV per collegare il DNA con la membrana. Per iniziare a etichettare le sonde del DNA con radioattività, aggiungere i DNA della sonda denaturati termicamente al tubo contenente le perline di etichettatura del DNA pronte all'ingannamento. Pipetta su e giù per mescolare.
E aggiungere cinque microlitri di trifosfato di deossicitodina etichettato radioattivamente. Incubare a 37 gradi celsius per 15 minuti. Purificare le sonde etichettate utilizzando colonne G 50 micro secondo le istruzioni fornite dal produttore.
Utilizzare un contatore di scintillazione per misurare la radioattività. Per iniziare ad ibridare le membrane con le sonde etichettate, posizionare la membrana nel tubo di ibridazione. Aggiungere la soluzione di pre ibridazione mista.
Posizionare il tubo nel forno di ibridazione e lasciare che la pre ibridazione proceda a 42 gradi celsius per 30 minuti. Quindi, rimuovere il tubo dal forno e versare la soluzione di pre ibridazione in un tubo da 50 millilitri. Aggiungere la sonda denaturata e mescolare delicatamente.
Per rimuovere le sonde non ibride, posizionare la membrana in un vassoio contenente un citrato di sodio salino X con 0,1%SDS e agitare delicatamente a 55-60 gradi celsius per 10 minuti. Successivamente, avvolgere la membrana con un involucro di plastica e fissarla nella cassetta di esposizione. In una stanza buia, esporre la membrana a due fogli di pellicola a raggi X.
Sviluppare il film per visualizzare i risultati. Determinare se un clone ES corrispondente è quello desiderato con il bersaglio della ricombinazione o meno, in base alle dimensioni delle bande di DNA rilevate dalle sonde. In questo studio, l'blotting meridionale e la PCR vengono utilizzati per identificare gli eventi HR che si verificano nelle cellule ES del mouse per la generazione di NM due modelli di topi sostitutivi genetici utilizzando la tecnologia di targeting mediato HR basata su cellule ES.
Poiché i DNA genomici sono tagliati in molti frammenti con lunghezze diverse, mostrano uno stato di striscio simile al gel del DNA. Questo suggerisce una digestione completa dei DNA genomici. Come fase finale dell'assorbimento meridionale, i segnali di una sonda etichettata radioattività ibridante con un frammento di DNA bersaglio sono mostrati sul film.
L'aspetto delle bande previste riflette l'occorrenza di eventi HR nei cloni ES. Secondo il predesign nello studio, i cloni ES con allele mutato hanno due bande di dimensioni distinte. Mentre i cloni ES di tipo selvaggio hanno una sola banda, suggerendo che i cloni ES desiderati siano eterozigoti.
A seguito della reazione PCR, i prodotti PCR possono essere analizzati sul gel del DNA. Se si osserva una specifica banda NPCR della dimensione corretta, ciò suggerisce il verificarsi di eventi HR che possono essere ulteriormente confermati sequenziando quella banda PCR. L'implicazione di questa tecnica si estese alla terapia di identificazione della mutazione puntino perché la fondazione è identica.
Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di essere pazienti e attenti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la microiniezione della cellula ES in blastocsti al fine di rispondere a domande aggiuntive come la formazione di animali chimerici. A poppa del suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada al ricercatore nel loro campo della biologia molecolare e cellulare per esplorare la funzione di un gene specifico o la conseguenza di un gene mutato nei topi o oltre.
Non dimenticare che lavorare con l'etichettatore di radioattività P32 DCTB può essere estremamente pericoloso e precauzioni come la schermatura con scheda di protezione dovrebbero sempre essere prese durante l'esecuzione di questa procedura.
