Questo metodo può aiutare ad affrontare le domande relative all'efficienza, alla resa di recupero e alla purezza delle vescicole extracellulari derivate dal liquido di lavanda broncoalveolare utilizzando un approccio di centrifugazione dell'ultrafiltrazione. Abbiamo confrontato direttamente questa tecnica con una tecnica di purificazione del gradiente di ultracentrifugazione e densità. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è semplice, efficiente e adatto per campioni di piccolo volume come il liquido di lavanda broncoalveolare murino.
Ancora più importante, fornisce un'elevata purezza e una scalabilità significativamente più elevata rispetto a un metodo di isolamento dell'ultracentrifugazione. A dimostrare la procedura sarà il signor Norman Garrett III, ricercatore associato al mio laboratorio. Per iniziare, inserire un angiocatetere calibro 22 nella trachea di un topo eutanasiato.
Attaccare una siringa per insulina con un millilitro di DPBS sterile ghiacciato e infondere un millilitro in entrambi i polmoni. Ritirare lentamente lo stantuffo per recuperare il liquido di lavanda broncoalveolare o il liquido BAL. E distribuire il fluido BAL in un tubo conico sul ghiaccio.
Dopo questo, estrarre il liquido BAL da 25 topi e dividerlo in due insiemi uguali. Centrifugare il fluido BAL a 400 volte G per cinque minuti a quattro gradi celsius. Raccogli il supernatante e centrifugalo a 15.000 volte G a quattro gradi Celsius per 10 minuti.
Quindi raccogliere il supernatante e procedere immediatamente ai passaggi di isolamento dell'EV. In primo luogo, filtrare il super natale attraverso un filtro siringa sterile da 0,2 micrometri. Successivamente, equilibrare l'unità filtrante centrifuga con DPBS sterile per 10 minuti.
Quindi centrifugare l'unità centrifuga a 15.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi celsius. Riempire il filtro con 15 millilitri di liquido BAL. E centrifugarlo a 3.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Successivamente, lavare il ritensionato con 14 millilitri di DPBS sterile tubazionando delicatamente ripetutamente. Centrifugare l'unità filtrante a 3.000 G a quattro gradi celsius per 30 minuti per rimuovere il DPBS e concentrare la ritrascita. Per raccogliere i veicoli elettrici derivati dal fluido BAL concentrato, inserire un pipetter nella parte inferiore dell'unità filtrante e ritirare il campione utilizzando un movimento di spazzamento da un lato all'altro.
Quindi aliquota il fluido BAL derivato EV e conservarli a meno 80 gradi celsius. In alternativa, iniziare trasferendo il precedente supernatante acquisito su un tubo ultracentrifugo. E centrifugarlo a 10.000 G per 30 minuti a quattro gradi Celsius.
Quindi raccogli il supernatante e la centrifuga. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo il pellet EV in 200 microlitri di DPBS. Successivamente, mescolare le sospensioni EV con 300 microlitri di soluzione di lavoro 50%iodixanolo.
E trasferirlo su un tubo ultracentrifugo da 15 millilitri. Quindi aggiungere la soluzione tampone in base al protocollo di testo per creare un gradiente di densità vivace e centrifugarlo a 100.000 G per tre ore e 50 minuti. Raccogliere le frazioni del 15% e del 25% di iodixanolo e diluirle in DPBS per portare il volume a 15 millilitri.
Trasferire le frazioni in un nuovo tubo ultracentrifugo e centrifugare a 100.000 G a quattro gradi celsius per 60 minuti. Scartare il supernatante e sospendere di nuovo i pellet EV in 50 microlitri di DPBS sterile. Per iniziare l'analisi di tracciamento delle nano particelle, diluire il campione di EV in un millilitro di DPBS.
E caricare il campione in una siringa per insulina. Successivamente, attaccare la siringa a una pompa di siringhe e misurare i numeri e le dimensioni delle particelle. Impostare il livello della fotocamera su 14 e la soglia di rilevamento su uno.
Successivamente, utilizzare un lettore di lastre per quantificare la quantità di proteine nel campione di veicoli elettrici tramite il rilevamento colorimetrico. Sciogliere una quantità uguale di proteine EV da ogni campione con un tampone di carico blotting e DTT. Quindi riscaldare i campioni a 70 gradi celsius per 10 minuti.
Caricare i campioni in un gel di acrilammide Bis-Tris Plus ed eseguire l'elettroforesi per 35 minuti. Quindi trasferire le proteine su una membrana di nitrocellulosa utilizzando un metodo di trasferimento a secco. Successivamente, bloccare la membrana con il 5% di latte scremato per 60 minuti con un dolce dondolo.
Incubare la membrana con un anticorpo contro un marcatore proteico superficiale EV a quattro gradi celsius con un dolce dondolo durante la notte. Sviluppare la membrana incubando la membrana con anticorpo di collegamento HRP per 60 minuti a temperatura ambiente. Lavare la membrana per 10 minuti con tampone TBST tre volte.
Infine, sviluppare la membrana con reagente di rilevamento degli anticorpi HRP chemiluminescenti prima di procedere all'imaging. Per iniziare la citometria a flusso, diluire il liquido BAL derivato EV in 49 microlitri di tampone di colorazione PEB. Quindi aggiungere tre anticorpi a ciascuno dei campioni, prima di incubare i campioni a quattro gradi Celsius con dondolo per 60 minuti al buio.
Infine, diluire i campioni con 40 microlitri di tampone di colorazione PEB filtrato a membrana ed eseguire analisi della citometria del flusso. In questo protocollo, gli EV sono stati isolati dal fluido BAL del mouse utilizzando metodi UFC e UC-DGC. I veicoli elettrici derivati dal liquido BAL da topi normali isolati con il metodo UFC mostravano dimensioni più piccole e una distribuzione delle dimensioni più uniforme rispetto agli UC-DGC-EV.
La tecnica UFC aveva anche un numero totale di particelle significativamente più elevato rispetto alla tecnica UC-DGC. Anche il recupero totale delle proteine misurato in milligrammi degli UFC-EV è stato superiore a quello dell'UC-DGC-EV, indicando che la tecnica UFC è più efficiente in termini di tempo e fatica. Infine, anche gli EV derivati dal fluido BAL sono stati ulteriormente caratterizzati dalla citometria del flusso.
Gli UFC-EV e gli UC-DGC-EV espressero entrambi CD63, CD9 e CD81. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di reidratare la membrana dell'unità di ultrafiltrazione con DPBS. Una volta idratata la membrana, l'unità deve essere mantenuta bagnata in ogni momento fino a quando non viene utilizzata.
Recuperare la rete di vescicola extracellulare dall'unità filtro può essere impegnativo. Assicurarsi che la punta della pipetta sia spazzata da un lato all'altro per recuperare la maggior parte degli EV dall'unità filtro. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori nel campo dell'isolamento vescicolare extracellulare per esplorare le funzioni biologiche delle vescicole extracellulari derivate dal lavaggio broncoalveolare in condizioni sia normali che patologiche in piccoli animali.
