Name: preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics
Uploaded: 2018-06-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics at JoVE.com

Grazie ai membri dell'impianto di spettroscopia massa di Indiana University e la University of Utah metabolomica Core Facility per assistenza nell'ottimizzazione di questo protocollo. J.M.T. è supportato dal National Institute of General Medical Sciences del National Institutes of Health, sotto Premio numero R35GM119557.

1. uovo collezione
<ol><li>Raccogliere adulti maschi e femmine vergini dei genotipi desiderati. Individualmente l'età questi animali in un flaconcino di cibo con supporti standard di Bloomington per 3 – 5 giorni.</li>
	<li>Impostare gli accoppiamenti appropriati trasferendo 50 femmine vergini e 25 maschi ad un nuovo flacone di cibo. Nota: Un minimo di sei accoppiamenti indipendenti dovrebbe essere impostato per ciascun genotipo. Un solo campione sarà raccolti da ogni accoppiamento (cioè, sei campioni raccolti da sei accoppiamenti indipendenti).</li>
	<li>
Preparare i tappi di deposizione delle uova di melassa.
	<ol>
<li>Mescolare 115 mL di melassa e 29 g di agar con 700 mL di H2O in un pallone da 2 L.</li>
		<li>Far bollire la melassa agar composto su un piatto caldo.</li>
		<li>Raffreddare fino a 70 ° C.</li>
		<li>Aggiungere 25 mL di miscela acida (20 mL di acido fosforico 85% e acido propionico 209 mL in 1 L di H2O; Conservare in una bottiglia scura) e 10 mL di estere metilico dell'acido p-idrossi-benzoico di 10% in etanolo al 95%.</li>
		<li>Versare l'agar di melassa in parte il coperchio ed il fondo di un piatto di coltura del tessuto2 35 x 10 mm. Nota: Prima di versare la melassa piastre di agar, assicurarsi che i coperchi e/o la base della piastra2 35 x 10 mm misura snuggly nella bocca di una bottiglia di stock di Drosophila (descritta nel punto 1.6). A seconda della marca di lastre utilizzate, la base potrebbe non essere utilizzabile.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fare il lievito fresco pasta aggiungendo acqua distillata ad attivo lievito secco (5 g lievito/7 mL di acqua) fino a quando la miscela diventa una pasta che possa essere facilmente distribuita su una superficie solida (cioè, la consistenza del burro di arachide).</li>
	<li>Sviluppa circa 1,5 g di pasta di lievito sulla superficie di un tappo di deposizione delle uova di melassa.</li>
	<li>Colpire i quattro fori di aria in lati opposti di una plastica 6 once bottiglia stock Drosophila , usando un ago 22 G.</li>
	<li>Trasferire le mosche appena accoppiate dal flaconcino di cibo in flaconi per coltura. Nota: Le mosche possono essere trasferiti mediante l'utilizzo di CO2 come un anestetico temporaneo o mantenendo la parte superiore della fiala in bocca della bottiglia e acutamente toccando il fondo della bottiglia contro un benchtop.</li>
	<li>Inserire rapidamente un tappo di deposizione delle uova di melassa con pasta di lievito sulla superficie nella bocca di una bottiglia di stock di Drosophila . Utilizzare nastro di laboratorio per fissare il tappo di deposizione delle uova nel luogo. Nota: Se mosche erano anestetizzato prima del trasferimento, la bottiglia dovrebbe essere posizionata orizzontalmente sul banco fino a quando tutte le mosche hanno recuperato. Una volta che le mosche sono completamente mobile, posizionare la bottiglia in un incubatore con il tappo di deposizione delle uova di melassa nella parte inferiore della cultura.</li>
	<li>Sostituire il tappo di deposizione delle uova di melassa almeno una volta al giorno per i primi due giorni invertendo la bottiglia stock, toccando il fondo della bottiglia contro il benchtop, rimuovendo il vecchio tappo di uovo e mettendo subito una nuova PAC di uovo nella bocca della bottiglia. Scartare il vecchio tappo di deposizione delle uova. Nota: Questo passaggio garantisce che le femmine non tengono le loro uova e permette per la raccolta delle popolazioni sincronizzati.</li>
	<li>Mettere un nuovo tappo di deposizione delle uova la bottiglia stock dopo giorno 3, sostituire dopo 2 h e scartare. Rimuovere e sostituire il secondo tappo di deposizione delle uova dopo quattro ore. Etichettare il fondo di questo cappellino di deposizione delle uova con la data, il tempo e il genotipo. Nota: Le uova raccolte durante questa finestra 4h saranno utilizzate per analisi. Questo passaggio di sincronizzazione è fondamentale per l'analisi di specifici stadi di sviluppo. Le uova possono essere raccolti in questo modo per diversi giorni.</li>
	<li>Inserire i tappi di deposizione delle uova in una piastra di Petri 60x15 mm2 e posto in un incubatore alla temperatura desiderata e umidità.</li>
	<li>Ispezionare i tappi di deposizione delle uova ogni giorno per problemi con la fame, la densità della popolazione o la contaminazione. Nota: Larve devono avere accesso ad un'alimentazione adeguata per garantire lo sviluppo continuo. Se necessario, pasta di lievito fresco può essere spalmato su tutti i tappi di deposizione delle uova che verranno utilizzati nell'esperimento. Inoltre, se la densità di popolazione larvale è troppo alto, larve inizierà a vagare fuori la piastra di coltura. Questi campioni non devono essere utilizzati per analisi metabolomica perché l'alta densità di popolazione e periodi intermedi di inedia sperimentato girovagando si tradurrà in dati incoerenti. Una densità di ~ 80 – 100 medio secondo instar larve (L2) per piastra o 40 – 50 intermedio terzo instar larve (L3) per ciascuna piastra è consigliato. I campioni che sono visibilmente contaminati con batteri o funghi dovrebbero essere scartati.</li>
</ol>2. larvale campionario
<ol><li>Larve di età fino alla fase desiderata. Se raccogliendo larve L3, risincronizzare i campioni presso i molt L2 – L3. Risincronizzazione è comunemente ottenuto utilizzando un metodo descritto in precedenza che utilizza gli spiracoli anteriori come una pietra miliare dello sviluppo15. In alternativa, metà-L3 larve possono essere sincronizzate utilizzando un sgs3 reporter gene16. Nota: A questo proposito, abbiamo trovato larve di metà-L2 (~ 60 h dopo la deposizione delle uova) sono ideali per la maggior parte delle analisi perché lo sviluppo larvale è ancora relativamente sincrono in questa fase, accuratamente raccolti campioni hanno un'alimentazione adeguata per sviluppare per questo timepoint e la numero di animali per esempio è gestibili (Vedi sotto). Un passo ulteriore sincronizzazione è necessario per le larve L3 perché gli impulsi di ecdisone numerose che si verificano durante lo sviluppo L3 hanno effetti drammatici sul metabolismo e genereranno gli artefatti in popolazioni non sincronizzati.</li>
	<li>Utilizzare un ago per dissezione per sollevare delicatamente la pasta di lievito fuori l'agar. Mettere il lievito su una nuova PAC di agar di melassa. Nota: La maggior parte delle larve mangiano all'interfaccia fra l'agar di melassa e la pasta di lievito.</li>
	<li>Utilizzare un piccolo pennello per raccogliere larve dalla superficie recentemente esposta dell'agar melassa. Posizionare le larve in una provetta da centrifuga da 1,5 mL sul ghiaccio. Nota: Dimensioni del campione appropriato per ogni stadio di sviluppo sono come segue: 50 primo instar larve (L1); 25 larve di metà-L2; 20 prime larve di L3; 15 metà-L3 o tardo L3 larve.</li>
	<li>Lavare e congelare i campioni (passaggi 2.3 attraverso 2.8) in piccoli lotti (quattro a sei campioni) durante la raccolta di un insieme di grande campione. I campioni devono essere congelati entro 20 min di immissione larve nei tubi. Nota: Si consiglia di utilizzare Eppendorf 1,5 mL Flex tubi perché altri tubi possono interferire con il trasferimento del campione al passaggio 3. I campioni devono essere raccolti in provette microfuge. Non raccogliere campioni nei tubi perlina descritti al punto 3.1. Perle in ceramica conservano la soluzione di lavaggio di NaCl, che si traduce in misure di massa imprecise e introduce contaminanti nel campione.</li>
	<li>Aggiungere 1 mL di gelida 0,9% NaCl nel tubo, chiudere il coperchio e capovolgere verticalmente il tubo a accuratamente lavare le larve.</li>
	<li>Riposizionare il tubo sul ghiaccio per ~ 30 s. Durante questo tempo, larve affonderanno alla parte inferiore del tubo, ma lievito rimarrà in sospensione. Una volta tutte le larve hanno formato un pellet sciolto, rimuovere la soluzione di NaCl utilizzando una pipetta da 1 mL.</li>
	<li>Ripetere i passaggi 2.4 e 2.5 due volte, o fino a quando la soluzione di lavaggio finale è chiaro. Nota: Fasi di lavaggio supplementare potrebbero essere necessari se il campione prelevato contiene una quantità eccessiva di lievito.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 2.000 × g per 1 min a 4 ° C.</li>
	<li>Rimuovere tutti i residui della soluzione utilizzando una pipetta 200 µ l.</li>
	<li>Congelare immediatamente il campione in azoto liquido. Nota: Il protocollo può essere sospeso in questa fase. I campioni possono essere conservati fino a 3 mesi a-80 ° C.</li>
</ol>3. trasferire i campioni ai tubi della perla
<ol><li>Ogni campione larvale dovrà essere trasferiti dal tubo microfuge 1,5 mL per un tubi di coperchio a vite di 2 mL contenente microsfere di ceramica di 1,4 mm. In preparazione per questo passaggio di trasferimento, è possibile utilizzare un marcatore di etanolo-prova per etichettare il lato di una provetta da 2 mL per raccordi perlina (marcature sul coperchio saranno distrutti durante passaggio 4.4).</li>
	<li>Tare la massa del tubo della perla con etichetta utilizzando una bilancia analitica, in grado di misurare con precisione 0,01 mg.</li>
	<li>Se larvali campioni sono stati conservati a-80 ° C, inserire le provette campione in prima dell'azoto liquido per trasferire.</li>
	<li>Utilizzare pinze lunghe per rimuovere la provetta da 1,5 mL dall'azoto liquido dewar.</li>
	<li>Indossando guanti di nitrile, afferrare il congelato tubo, invertire e acutamente pestare il coperchio del tubo contro il benchtop per sloggiare il pellet congelato. Versare immediatamente il pellet in una provetta di perlina di coperchio a vite pre-tarato 2 mL. Se la pallina non riesce a sloggiare, tornare il tubo a azoto liquido e ripetere. Nota: Pellet larvale non sloggiare da tutti i tubi del microfuge. Se si utilizza un tubo diverso da quello consigliato, è necessario determinare se pellet larvale può essere sloggiato prima del prelievo dei campioni per l'analisi.</li>
	<li>Misurare rapidamente la massa combinata del tubo pellet e perlina larvale. Posizionare immediatamente la provetta in azoto liquido. Il pellet larvale massa verrà utilizzato per normalizzare i dati metabolomica. Nota: Il protocollo può essere sospeso in questa fase. I campioni possono essere conservati fino a 3 mesi a-80 ° C.</li>
</ol>4. campione estrazione
<ol><li>Disporre le provette campione in un benchtop di-20 ° C più fresco.</li>
	<li>Aggiungere 0,8 mL di metanolo al 90% prechilled (-20 ° C) contenente 2 µ g/mL di acido succinico-d4 in ogni provetta. Riportare il campione del benchtop di-20 ° C più fresco. Nota: L'acido succinico-d4 serve come standard interno. Utilizzare solo HPLC grade H2O e metanolo. Poiché sono metanolo e altri solventi organici volatili e difficili da misurare con precisione utilizzando pipette a spostamento aria, si consiglia di utilizzare pipette a spostamento positivo per questo passaggio e tutti i passaggi seguenti.</li>
	<li>Impostare un controllo negativo aggiungendo 0,8 mL di metanolo al 90% prechilled (-20 ° C) contenente 2 µ g/mL di acido succinico-d4 in una provetta vuota della perla.</li>
	<li>Omogeneizzare campioni per 30 secondi a 6,45 m/s usando un omogeneizzatore del mulino della perla si trova in una sala di controllo di temperatura di 4 ° C. Nota: Il mancato rapidamente e completamente omogeneizzare il pellet larvale è una comune fonte di variabilità nell'analisi metabolomica. Utilizzare solo omogeneizzatori che sono in grado di distruggere congelati tessuti larvali entro 30 s.</li>
	<li>Ritornare le provette di campioni omogeneizzati del benchtop di-20 ° C più fresco e li Incubare in un congelatore a-20 ° C per almeno 1 h.</li>
	<li>Centrifugare le provette a 20.000 × g o massima velocità per 5 min a 4 ° C per rimuovere il precipitato risultante.</li>
	<li>Trasferire 600 µ l del surnatante in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL. Non disturbare il precipitato. Se il sedimento precipitato diventa sloggiato durante il pipettaggio il supernatante, restituire tutti i surnatante al tubo e ripetere il passaggio 4.6.</li>
	<li>Posizionare i tubi di campione in una centrifuga vuoto. Assicurarsi che tutti i tubi siano aperti prima di sigillare la centrifuga. Asciugare i campioni a temperatura ambiente finché non viene rimosso tutto solvente (questo passaggio solitamente richiede ~ 16 h per completare). Nota: Se necessario, il protocollo può essere sospeso in questa fase. Secchi campione può essere conservato a-80 ° C.</li>
</ol>5. chimica derivatizzazione
<ol><li>Se i campioni essiccati sono stati conservati a-80 ° C, posizionare le provette non aperti in una centrifuga vuoto e asciugare per 30 min. Questo passaggio deve essere eseguito prima di aprire la provetta del campione. Nota: Questo passaggio consente di rimuovere la condensa che si raccoglie sulla parte esterna del tubo microfuge quando rimosso dal freezer. Questa porzione del protocollo è estremamente sensibile alle H2O e precauzione supplementare deve essere presa per mantenere tutti i reagenti più asciutto possibile.</li>
	<li>
Preparare una soluzione di cloridrato di methoxylamine 40 mg/mL (MOX) in piridina anidra. Utilizzare solo piridina anidra. Conservare MOX e piridina in un essiccatore e preparare la soluzione MOX ogni giorno. Attenzione: MOX e piridina sono tossici. Preparare questa soluzione nella cappa fumi.<ol>
<li>Utilizzare una pistola di calore per asciugare una siringa di vetro da 1 mL.</li>
		<li>Inserire l'ago della siringa nel flacone di piridina anidra. Prelevare 1 mL della piridina e aggiungerla in una provetta di microfuge contenenti 40 mg di MOX.</li>
		<li>Svuotare la bottiglia di piridina anidra con argon. Tappare la bottiglia e tornare nell'essiccatore.</li>
		<li>Sciogliere il MOX nella piridina incubando il tubo in un miscelatore termico a 35 ° C per 10 min a 600 giri/min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aggiungere 40 µ l di 40 mg/mL MOX in soluzione di piridina anidra al campione essiccato.</li>
	<li>Vortexare per 10 s e brevemente centrifuga (10.000 x g per 20 s).</li>
	<li>Incubare a 30 ° C per 1 h a 600 giri/min in un miscelatore termico.</li>
	<li>Centrifugare a 20.000 × g o velocità massima per 5 min rimuovere la materia di particelle.</li>
	<li>Trasferire 25 μl del surnatante in una fiala di autocampionatore con inserto in vetro microvolume 250 µ l disattivato.</li>
	<li>Aggiungere 40 µ l di N- metil -N- trimethylsilyltrifluoracetamide (Sandro) contenente l'1% TMC. Attenzione: Massimiliano è tossico. Eseguire questo passaggio nella cappa. Nota: Se disponibile, questo passaggio può essere completato da un autocampionatore Gerstel.</li>
	<li>Mettere un tappo sul flacone autocampionatore e sigillare utilizzando un tool crimper.</li>
	<li>Incubare il campione a 37 ° C per 1 ora con agitazione (250 giri/min).</li>
	<li>Preparare una soluzione (FAMES) standard di acido grasso metil estere come precedentemente desceribed3. Aggiungere 3 µ l di FAMES al flaconcino campionatrice automatica utilizzando un autocampionatore robotico immediatamente prima dell'iniezione. Nota: FAMEs vengono utilizzati per calibrare lo spostamento del tempo di ritenzione e verificare le prestazioni dello strumento. Se nessun autocampionatore robotico è disponibile, è possibile aggiungere FAMEs durante passaggio 5.8.</li>
</ol>6. GC-MS rilevamento
Nota: Nella maggior parte dei casi, l'utente effettuerà questo passaggio con l'assistenza di una struttura di nucleo di spettroscopia di massa. Questo protocollo è progettato per essere utilizzato con un 30 m, colonna GC con una colonna di guardia di 5 m.
<ol><li>Randomizzare l'ordine del campione.</li>
	<li>
Preparare la GC-MS.
	<ol>
<li>Insieme la portata del gas vettore elio a 1 mL/min.</li>
		<li>Impostare la temperatura a 250 ° C.</li>
		<li>Programmare il GC per eseguire il seguente gradiente di temperatura:<ol>
<li>Temperatura iniziale a 95 ° C con una sospensione di 1 min.</li>
			<li>Aumentare la temperatura a 110 ° C alla velocità di 40 ° C/min con una tenuta di 2 min.</li>
			<li>Aumentare a 250 ° C 5° C/min rampa.</li>
			<li>Aumentare a 330 ° C alla velocità di 25 ° C/min con una stretta finale di 4 min.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Ritardo impostato solvente a 3,5 min. Nota: Il tempo può essere modificato secondo il sistema GC-MS. Lo scopo di questo passaggio è quello di evitare che Massimiliano e MOX danneggino il rivelatore.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Iniettare 1 µ l di campione derivatizzato in GC-MS (split rapporto 10:1). Nota: Iniettare 2 µ l di campione se l'intensità dei picchi è troppo basso. L'ordine di iniezione dei campioni deve essere randomizzato.</li>
	<li>Azionare lo spettrometro di massa in modalità di scansione completa in un intervallo di massa di 50 – 500 m/z.</li>
</ol>7. analisi dei dati
<ol><li>Analizzare i dati di metabolomica utilizzando sia un approccio mirato o non mirato. Analisi mirata è focalizzata su misura l'abbondanza di un insieme definito di metaboliti, quali le misurazioni di lattato che descriviamo qui di seguito. Al contrario, non mirati analisi utilizza un approccio imparziale per identificare qualsiasi funzionalità metabolica che è cambiato significativamente tra due insiemi di esempio. Nota: Il nostro laboratorio utilizza principalmente i programmi gratuiti MetAlign17 e MetaboAnalyst18,19 per l'analisi dei dati. Poiché un'adeguata descrizione sia il controllo della qualità, della normalizzazione e passaggi di elaborazione dei dati sono oltre la portata di questo manoscritto, ci riferiamo all'utente a protocolli più dettagliati che sono dedicati all'elaborazione dei dati20,21, 22. Inoltre, un diagramma di flusso che descrive i passaggi necessari per questa analisi può essere trovato altrove8.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Owusu-Ansah, E., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modeling+metabolic+homeostasis+and+nutrient+sensing+in+Drosophila:+implications+for+aging+and+metabolic+diseases.">Modeling metabolic homeostasis and nutrient sensing in Drosophila: implications for aging and metabolic diseases.</a> Disease Models &amp; Mechanisms. 7 (3), 343-350 (2014).</li><li>Sieber, M. H., Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+metabolic+states+in+development+and+disease.">The role of metabolic states in development and disease.</a> Current Opinion in Genetics &amp; Development. 45, 58-68 (2017).</li><li>Tennessen, J. M., Barry, W. E., Cox, J., Thummel, C. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Sinelnikov, I. V., Han, B., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MetaboAnalyst+3.0-making+metabolomics+more+meaningful.">MetaboAnalyst 3.0-making metabolomics more meaningful.</a> Nucleic Acids Research. 43 (W1), W251-W257 (2015).</li><li>Lommen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Data+(pre-)processing+of+nominal+and+accurate+mass+LC-MS+or+GC-MS+data+using+MetAlign.">Data (pre-)processing of nominal and accurate mass LC-MS or GC-MS data using MetAlign.</a> Methods in Molecular Biology. 860, 229-253 (2012).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+MetaboAnalyst+3.0+for+comprehensive+metabolomics+data+analysis.">Using MetaboAnalyst 3.0 for comprehensive metabolomics data analysis.</a> Current Protocols in Bioinformatics. 55, (2016).</li><li>Xia, J., Wishart, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Web-based+inference+of+biological+patterns,+functions+and+pathways+from+metabolomic+data+using+MetaboAnalyst.">Web-based inference of biological patterns, functions and pathways from metabolomic data using MetaboAnalyst.</a> Nature Protocols. 6 (6), 743-760 (2011).</li><li>Li, H., Tennessen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+studying+the+metabolic+basis+of+Drosophila+development.">Methods for studying the metabolic basis of Drosophila development.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 6 (5), (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Metabolomica fornisce un'opportunità senza precedenti per sorvegliare le reazioni metaboliche che compongono il metabolismo intermedio. La sensibilità di questa tecnologia, tuttavia, rende i dati suscettibili di background genetico, stecche inerente allo sviluppo e una varietà di stress ambientali, tra cui temperatura, umidità, densità della popolazione e disponibilità di nutrienti. Di conseguenza, un'alta qualità e riproducibili metabolomica analisi richiedono che i campioni raccolti in condizioni altamente contr...

Moscerino della frutta Drosophila melanogaster è emerso come un sistema ideale per studiare i meccanismi molecolari che regolano il metabolismo intermedio. Non solo sono la maggior parte delle vie metaboliche conservate tra Drosophila e gli esseri umani, ma nutrienti chiave sensori e regolatori di crescita, come l'insulina, Tor e myc, sono anche attivi in volare1,2. Di conseguenza, Drosophila consente di esplorare la base metabolica delle malattie umane che vanno dal diabete e obesità a neurodegenerazione e cancro. A questo proposito, lo sviluppo larvale della drosofila fornisce il quadro ideale in cui studiare un programma metabolico conosciuto come glicolisi aerobica, o l'effetto di Warburg. Proprio come molti tumori utilizzano la glicolisi aerobica per generare biomassa da carboidrati, così per fare della drosofila larve attivano glicolisi aerobica per promuovere la crescita dello sviluppo3,4,5. Queste somiglianze tra larvale e metabolismo del tumore stabilire Drosophila come modello chiave per la comprensione come aerobico glicolisi è regolamentato in vivo.
Nonostante il fatto che la Mosca è emerso come un modello popolare per studiare il metabolismo, la maggior parte degli studi di Drosophila si basano su metodi che sono progettati per misurare diversi metaboliti3, quali trealosio, trigliceridi o ATP. Poiché un protocollo specifico è necessaria per misurare ogni metabolita, studi basati su analisi sono laboriosi, costoso e prevenuto verso quei composti che possono essere misurati usando i kit commerciali. Una soluzione a queste limitazioni è emerso dal campo della metabolomica, che fornisce un mezzo più efficiente ed imparziale di studiare il metabolismo di Drosophila . A differenza di uno studio basato su analisi, un'analisi metabolomica singolo può simultaneamente misurare centinaia di piccole molecole metaboliti e fornire una comprensione globale di stato metabolico6,7 di un organismo. Questa tecnica ha notevolmente ampliato il campo di studi metabolici di Drosophila e rappresenta il futuro di questo settore emergente8.
Metabolomica studi vengono condotti principalmente utilizzando tre tecnologie: (i) risonanza magnetica nucleare (NMR), (ii) liquida spettrometria della cromatografia-massa (LC-MS) e (iii) gas cromatografia-spettrometria (GC-MS)9. Ogni approccio offre vantaggi e svantaggi, e tutte queste tecnologie sono state usate per studiare con successo metabolismo di Drosophila . Poiché le ricerche condotte nel nostro laboratorio sono focalizzata sui metaboliti polari, piccoli, principalmente ci avvaliamo di un metodo basato su GC-MS. GC-MS fornisce all'utente una serie di vantaggi, tra cui alta riproducibilità, risoluzione dei picchi, sensibilità, e la disponibilità di una libreria spettrale di impatto (EI) standard dell'elettrone, che permette la rapida identificazione di scoperto metabolica caratteristiche10,11. La preparazione dei campioni per GC-MS, tuttavia, è piuttosto complessa e richiede una grande attenzione al dettaglio. Campioni devono essere raccolto, lavati, pesati e congelati in un modo che disseta rapidamente reazioni metaboliche. Inoltre, la carcassa Vola è resistente ai protocolli standard omogeneizzazione e richiede un mulino di tallone per assicurare l'estrazione ottimale del metabolita. Infine, i campioni analizzati mediante GC-MS devono subire derivatizzazione chimica prima del rilevamento12. Mentre precedentemente pubblicati metodi descrivono tutti questi passaggi3,13,14, è ancora necessario un protocollo visual che consentirebbe l'utente inesperto di riproducibile generare dati di alta qualità. Qui dimostriamo come preparare Drosophila larvali campioni per l'analisi metabolomica basati su GC-MS. Questo protocollo permette all'utente di misurare riproducibile molti dei piccoli metaboliti polari che compongono il metabolismo del carbonio centrale.

<table><tbody><tr><td>Unsulfured blackstrap molasses</td><td>Good Food, INC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Drosophila Agar Type II</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>EMD Millipore</td><td>PX2012-7</td><td></td></tr><tr><td>Methoxyamine hydrocholoride (MOX)</td><td>MP Biomedicals, LLC</td><td>155405</td><td></td></tr><tr><td>MSTFA with 1% trimethylchlorosilane</td><td>Sigma</td><td>69478</td><td></td></tr><tr><td>Fleischmann&amp;rsquo;s Active dry yeast</td><td>AB Mauri Food Inc</td><td>2192</td><td></td></tr><tr><td>6oz Drosophila stock bottle</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-130</td><td></td></tr><tr><td>Soft tissue homogenizing mix (2 mL tubes)&amp;nbsp;</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-627</td><td></td></tr><tr><td>Vial insert, 250 &amp;micro;L deactivated glass with polymer feet</td><td>Agilent</td><td>5181-8872</td><td></td></tr><tr><td>Succinic acid-2,2,3,3-d&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>293075</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo&amp;nbsp;</td><td>SC210A</td><td></td></tr><tr><td>o-Phosphoric acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A242-1</td><td></td></tr><tr><td>Propionic acid</td><td>Sigma</td><td>P5561</td><td></td></tr><tr><td>p-Hydroxy benzoic acid methyl ester</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-258</td><td></td></tr><tr><td>Bead Ruptor</td><td>Omni International</td><td>SKU:19-040E</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer F1.5</td><td>Eppendorf</td><td>5384000012</td><td></td></tr><tr><td>MultiTherm Shaker with a 24 X 12 mm block</td><td>Benchmark Scientific</td><td>H5000</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL centrifuge tube</td><td>Eppendorf</td><td>22364111</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 X 10 mm tissue culture dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>GC column</td><td>Phenomex</td><td>ZB-5MSi</td><td></td></tr></tbody></table>

preparation of drosophila larval samples for gas chromatography-mass spectrometry (gc-ms)-based metabolomics

I recenti progressi nel campo della metabolomica hanno stabilito il moscerino della frutta Drosophila melanogaster come un potente modello genetico per studiare il metabolismo degli animali. Combinando la vasta gamma di strumenti genetici della drosofila con la capacità di indagine vaste aree del metabolismo intermedio, un approccio di metabolomica può rivelare interazioni complesse tra dieta, genotipo, eventi di vita-storia e stimoli ambientali. Inoltre, studi di metabolomica possono scoprire nuovi meccanismi enzimatici e scoprire connessioni precedentemente sconosciute tra vie metaboliche apparentemente disparate. Al fine di facilitare l'uso più diffuso di questa tecnologia tra la comunità di Drosophila , qui forniamo un protocollo dettagliato che descrive come preparare campioni larvali della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del gas (GC-MS)- Basato su analisi metabolomica. Il nostro protocollo include descrizioni di campionario larvale, metabolita estrazione, derivatizzazione chimica e analisi GC-MS. Completamento del presente protocollo consentirà agli utenti di misurare l'abbondanza relativa di piccoli metaboliti polari, tra cui amminoacidi, zuccheri e acidi organici coinvolti nella glicolisi e i cicli TCA.

Lattato deidrogenasi (dLDH) mutanti, che mancano di dLDH attività4e geneticamente-hanno abbinato i comandi sono stati raccolti come larve di metà-L2 e trattati secondo il protocollo descritto in precedenza. Rispetto ai controlli, larve mutanti mostrano cambiamenti significativi in lattato, piruvato e L-2-idrossiglutarato4. Gli spettri sono stati acquisiti con un sistema di Agilent GC6890-5973i MS. Generare un esempio degli spettri...

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Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Questo protocollo descrive come preparare larve di Drosophila per analisi metabolomica basati su GC-MS.

Preparazione di campioni larvale della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del Gas (GC-MS)-base di metabolomica

Recent advances in the field of metabolomics have established the fruit fly Drosophila melanogaster as a powerful genetic model for studying animal ...

preparation-drosophila-larval-samples-for-gas-chromatography-mass

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry (GC-MS)-based Metabolomics

11.1K Views.  Indiana University. Questo protocollo descrive come preparare larve di Drosophila per analisi metabolomica basati su GC-MS.

Video: Preparation of Drosophila Larval Samples for Gas Chromatography-Mass Spectrometry GC-MS-based Metabolomics

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often compromise the lives of those who suffer from these complex diseases. Detecting mitochondrial metabolic changes is vital to the understanding of mitochondrial disorders and mitochondrial responses to pharmacological agents. Although mitochondrial metabolism is at the core of metabolic regulation, the detection of subtle changes in mitochondrial metabolism may be hindered by the overrepresentation of other cytosolic metabolites obtained using whole organism or whole tissue extractions. 
Here we describe an isolation method that detected pronounced mitochondrial metabolic changes in Drosophila that were distinct between whole-fly and mitochondrial enriched preparations. To illustrate the sensitivity of this method, we used a set of Drosophila harboring genetically diverse mitochondrial DNAs (mtDNA) and exposed them to the drug rapamycin. Using this method we showed that rapamycin modifies mitochondrial metabolism in a mitochondrial-genotype-dependent manner. However, these changes are much more distinct in metabolomics studies when metabolites were extracted from mitochondrial enriched fractions. In contrast, whole tissue extracts only detected metabolic changes mediated by the drug rapamycin independently of mtDNAs.

Preparation of Mitochondrial Enriched Fractions for Metabolic Analysis in Drosophila

Mitochondria play central roles in the regulation of metabolism and homeostasis. Subtle changes in mitochondrial metabolism that affect organismal physiology could be difficult to detect in whole organism metabolomics studies. Here we describe an isolation method that enhances the detection of subtle metabolic shifts in Drosophila melanogaster.

Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l&#39;analisi metabolica in<em&gt; Drosophila</em

Since mitochondria play roles in amino acid metabolism, carbohydrate metabolism and fatty acid oxidation, defects in mitochondrial function often ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, organism development, and disease. It is often desirable to obtain PPI information using in vivo material, to gain the most natural and unbiased view of the interaction networks. The fruit fly Drosophila melanogaster is an excellent platform to study PPIs in vivo, and lends itself to straightforward approaches to isolating material for biochemical experiments. In particular, fruit fly embryos represent a convenient type of tissue to study PPIs, due to the ease of collecting animals at this developmental stage and the fact that the majority of proteins are expressed in embryogenesis, thus providing a relevant environment to reveal most PPIs. Here we present a protocol for collection of Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g), which is an ideal amount for a wide range of proteomic applications, including analysis of PPIs by affinity purification-mass spectrometry (AP-MS). We describe our designs for 1 L and 5 L cages for embryo collections that can be easily and inexpensively set up in any laboratory. We also provide a general protocol for embryo collection and protein extraction to generate lysates that can be directly used in downstream applications such as AP-MS. Our goal is to provide an accessible means for all researchers to carry out the analyses of PPIs in vivo.

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

The goal of this protocol is to provide a straightforward and inexpensive approach to collecting Drosophila embryos at medium scale (0.5-1 g) and preparing protein extracts that can be used in downstream proteomic applications, such as affinity purification-mass spectrometry (AP-MS).

Preparazione su media scala di<em&gt; Drosophila</em&gt; Estratti di embrioni per esperimenti proteomici

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology, which all influence muscle development and myofibrillogenesis. Omics data, such as those generated by mass spectrometry or deep sequencing, can provide important mechanistic insights into these biological processes. For such approaches, it is beneficial to analyze tissue-specific samples to increase both selectivity and specificity of the omics fingerprints. Here we present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched muscle samples for omics applications. We first describe how to dissect flight muscles at early pupal stages (&#60;48 h after puparium formation [APF]), when the muscles are discernable by green fluorescent protein (GFP) labeling. We then describe how to dissect muscles from late pupae (&#62;48 h APF) or adults, when muscles are distinguishable under a dissecting microscope. The accompanying video protocol will make these technically demanding dissections more widely accessible to the muscle and Drosophila research communities. For RNA applications, we assay the quantity and quality of RNA that can be isolated at different time points and with different approaches. We further show that Bruno1 (Bru1) is necessary for a temporal shift in myosin heavy chain (Mhc) splicing, demonstrating that dissected muscles can be used for mRNA-Seq, mass spectrometry, and reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) applications. This dissection protocol will help promote tissue-specific omics analyses and can be generally applied to study multiple biological aspects of myogenesis.

Dissection of Drosophila melanogaster Flight Muscles for Omics Approaches

Drosophila flight muscle is a powerful model to study transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and mechanobiology. We present a protocol for dissection of fluorescent-labeled flight muscle from live pupae to generate highly enriched samples ideal for proteomics and deep-sequencing. These samples can offer important mechanistic insights into diverse aspects of muscle development.

Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per gli approcci Omics

Drosophila flight muscle is a powerful model to study diverse processes such as transcriptional regulation, alternative splicing, metabolism, and ...

Genetica

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

In the following we describe the methodological details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with genetic interference, provides a handle to analyze the neuronal and molecular fundamentals of specifically associative learning in a simple larval brain.
Organisms can use past experience to adjust present behavior. Such acquisition of behavioral potential can be defined as learning, and the physical bases of these potentials as memory traces1-4. Neuroscientists try to understand how these processes are organized in terms of molecular and neuronal changes in the brain by using a variety of methods in model organisms ranging from insects to vertebrates5,6. For such endeavors it is helpful to use model systems that are simple and experimentally accessible. The Drosophila larva has turned out to satisfy these demands based on the availability of robust behavioral assays, the existence of a variety of transgenic techniques and the elementary organization of the nervous system comprising only about 10,000 neurons (albeit with some concessions: cognitive limitations, few behavioral options, and richness of experience questionable)7-10.
Drosophila larvae can form associations between odors and appetitive gustatory reinforcement like sugar11-14. In a standard assay, established in the lab of B. Gerber, animals receive a two-odor reciprocal training: A first group of larvae is exposed to an odor A together with a gustatory reinforcer (sugar reward) and is subsequently exposed to an odor B without reinforcement 9. Meanwhile a second group of larvae receives reciprocal training while experiencing odor A without reinforcement and subsequently being exposed to odor B with reinforcement (sugar reward). In the following both groups are tested for their preference between the two odors. Relatively higher preferences for the rewarded odor reflect associative learning - presented as a performance index (PI). The conclusion regarding the associative nature of the performance index is compelling, because apart from the contingency between odors and tastants, other parameters, such as odor and reward exposure, passage of time and handling do not differ between the two groups9.

Appetitive Associative Olfactory Learning in Drosophila Larvae

Drosophila larvae are able to associate odor stimuli with gustatory reward. Here we describe a simple behavioral paradigm that allows the analysis of appetitive associative olfactory learning.

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in<em&gt; Drosophila</em&gt; Le larve

In the following we describe the methodological  details of appetitive associative olfactory learning in Drosophila larvae. The setup, in combination with ...

Neuroscienze

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, Drosophila research lacks popularity in developing countries, possibly due to the misinformed idea that establishing a lab and performing relevant experiments with such tiny insects is difficult and requires expensive, specialized apparatuses. Here, we describe how to build an affordable flylab to quantitatively analyze a myriad of behavioral parameters in D. melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We provide protocols to build in-house vial racks, courtship arenas, apparatuses for locomotor assays, etc., to be used for general fly maintenance and to perform behavioral experiments using adult flies and larvae. We also provide protocols on how to use more sophisticated systems, such as a high resolution oxygraph, to measure mitochondrial oxygen consumption in larval samples, and show its association with behavioral changes in the larvae upon the xenotopic expression of the mitochondrial alternative oxidase (AOX). AOX increases larval activity and mitochondrial leak respiration, and accelerates development at low temperatures, which is consistent with a thermogenic role for the enzyme. We hope these protocols will inspire researchers, especially from developing countries, to use Drosophila to easily combine behavior and mitochondrial metabolism data, which may lead to information on genes and/or environmental conditions that may also regulate human physiology and disease states.

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

We provide protocols for anyone with a "maker culture" mind to start building a flylab for quantitative analysis of a myriad of behavioral parameters in Drosophila melanogaster, by 3D-printing many of the necessary pieces of equipment. We also describe a high resolution respirometry protocol using larvae to combine behavioral and mitochondrial metabolism data.

The usefulness of Drosophila as a model organism for the study of human diseases, behaviors and basic biology is unquestionable. Although practical, ...

Comportamento

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Biochimica

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs provides a tissue-level understanding of energy utilization that cannot be captured when analyzing primary cells and cell lines. While this analysis is ex vivo, it allows for the measurement from a number of specialized cells working together to perform a function in one tissue and more closely models the in vivo organ. Metabolic reprogramming has been observed in many neurological diseases, including neoplasia, and neurodegenerative diseases. This protocol was developed to assist the D. melanogaster community&#39;s investigation of metabolism in neurological disease models using a commercially available metabolic analyzer. Measuring metabolism of whole brains in the metabolic analyzer is challenging due to the geometry of the brain. This analyzer requires samples to remain at the bottom of a 96-well plate. Cell samples and tissue punches can adhere to the surface of the cell plate or utilize spheroid plates, respectively. However, the spherical, three-dimensional shape of D. melanogaster brains prevents the tissue from adhering to the plate. This protocol requires a specially designed and manufactured micro-tissue restraint that circumvents this problem by preventing any movement of the brain while still allowing metabolic measurements from the analyzer&#39;s two solid-state sensor probes. Oxygen consumption and extracellular acidification rates are reproducible and sensitive to a treatment with metabolic inhibitors. With a minor optimization, this protocol can be adapted for use with any whole tissue and/or model system, provided that the sample size does not exceed the chamber generated by the restraint. While basal metabolic measurements and an analysis after a treatment with mitochondrial inhibitors are described within this protocol, countless experimental conditions, such as energy source preference and rearing environment, could be interrogated.

Metabolic Analysis of Drosophila melanogaster Larval and Adult Brains

We present a protocol for measuring oxygen consumption and extracellular acidification in Drosophila melanogaster larval and adult brains. A metabolic analyzer is utilized with an adapted and optimized protocol. Micro-tissue restraints are a critical component of this protocol and were designed and created specifically for their use in this analysis.

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

This protocol describes a method for measuring the metabolism in Drosophila melanogaster larval and adult brains. Quantifying metabolism in whole organs ...

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. Although fruit flies provide obvious experimental advantages, research on neurodegenerative diseases has mostly relied on traditional techniques, including genetic interaction, histology, immunofluorescence, and protein biochemistry. These techniques are effective for mechanistic, hypothesis-driven studies, which lead to a detailed understanding of the role of single genes in well-defined biological problems. However, neurodegenerative diseases are highly complex and affect multiple cellular organelles and processes over time. The advent of new technologies and the omics age provides a unique opportunity to understand the global cellular perturbations underlying complex diseases. Flexible model organisms such as Drosophila are ideal for adapting these new technologies because of their strong annotation and high tractability. One challenge with these small animals, though, is the purification of enough informational molecules (DNA, mRNA, protein, metabolites) from highly relevant tissues such as fly brains. Other challenges consist of collecting large numbers of flies for experimental replicates (critical for statistical robustness) and developing consistent procedures for the purification of high-quality biological material. Here, we describe the procedures for collecting thousands of fly heads and the extraction of transcripts and metabolites to understand how global changes in gene expression and metabolism contribute to neurodegenerative diseases. These procedures are easily scalable and can be applied to the study of proteomic and epigenomic contributions to disease.

Purification of Transcripts and Metabolites from Drosophila Heads

We describe here the procedures for the extraction and purification of mRNA and metabolites from Drosophila heads. We are applying these techniques to better understand the cellular perturbations underlying neuronal degeneration. These methodologies can be easily scaled and adapted for other "omic" projects.

Purificazione di Trascrizioni e metaboliti<em&gt; Drosophila</em&gt; Teste

For the last decade, we have tried to understand the molecular and cellular mechanisms of neuronal degeneration using Drosophila as a model organism. ...

Biologia

Monitoraggio del trasporto dei metaboliti cerebrali in Drosophila utilizzando i sensori FRET

Visualizing Monocarboxylates and Other Relevant Metabolites in the Ex Vivo Drosophila Larval Brain Using Genetically Encoded Sensors

The high energy requirements of brains due to electrical activity are one of their most distinguishing features. These requirements are met by the production of ATP from glucose and its metabolites, such as the monocarboxylates lactate and pyruvate. It is still unclear how this process is regulated or who the key players are, particularly in Drosophila.
Using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors, we present a simple method for measuring the transport of monocarboxylates and glucose in glial cells and neurons in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation. The protocol describes how to dissect and adhere a larval brain expressing one of the sensors to a glass coverslip. 
We present the results of an entire experiment in which lactate transport was measured in larval brains by knocking down previously identified monocarboxylate transporters in glial cells. Furthermore, we demonstrate how to rapidly increase neuronal activity and track metabolite changes in the active brain. The described method, which provides all necessary information, can be used to analyze other Drosophila living tissues.

Autore in primo piano: Progressi nella ricerca sul metabolismo energetico cerebrale utilizzando il modello di Drosophila

Here we present a protocol to visualize the transport of monocarboxylates, glucose, and ATP in glial cells and neurons using genetically encoded F&#246;rster resonance energy transfer-based sensors in an ex-vivo Drosophila larval brain preparation.

Visualizzazione dei monocarbossilati e di altri metaboliti rilevanti nel cervello larvale ex vivo di Drosophila utilizzando sensori geneticamente codificati

Preparazione di campioni larvale della drosofila per spettrometria della cromatografia-massa del Gas (GC-MS)-base di metabolomica

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Preparazione di mitocondriali arricchiti frazioni per l'analisi metabolica in

Preparazione su media scala di

Dissezione dei muscoli di volo di Drosophila melanogaster per gli approcci Omics

Appetitivo apprendimento associativo olfattiva in

Preparare lo sviluppo di tessuto periferico olfattivo per molecolare e l'analisi di Immunohistochemical in Drosophila

An Affordable and Efficient "Homemade" Platform for Drosophila Behavioral Studies, and an Accompanying Protocol for Larval Mitochondrial Respirometry

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

Analisi metabolica di Drosophila melanogaster Larval e cervello adulto

Purificazione di Trascrizioni e metaboliti

Visualizzazione dei monocarbossilati e di altri metaboliti rilevanti nel cervello larvale ex vivo di Drosophila utilizzando sensori geneticamente codificati