Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle interazioni ospite-patogeno come quali sono le caratteristiche uniche delle cellule infette produttivamente, quali cofattori ospiti consentono ai virus di stabilire un'infezione produttiva e come indirizzare queste cellule negli interventi terapeutici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce misure quantitative sia per le proteine che per l'mRNA all'interno di singole cellule, e la maggior parte dei reagenti sono disponibili in commercio. A dimostrare la procedura di smistamento delle cellule sarà Matthew Creegan, un tecnico senior del nucleo di citometria a flusso nel laboratorio del dottor Michael Eller.
Per iniziare, in una workstation di biologia molecolare pre-PCR designata, preparare il mix di test combinando 96 test di espressione genica in un tubo libero di RNasi, DNasi assicurandosi di aggiungere ogni saggio a una concentrazione finale di 180 nanomolari di primer avanti e indietro. Aggiungere il tampone di sospensione del DNA per ottenere l'appropriata diluizione della miscela di test. Per ogni array di chip 96 per 96 previsto, pipettare sei microlitri di ogni saggio in un pozzo designato di una piastra PCR da 96 po ', quindi sigillare la piastra con un adesivo.
Per iniziare la colorazione superficiale di cellule vitali, in un armadietto di biosicurezza della coltura tissutale, preparare prima i campioni di compensazione e un mix principale di cocktail di anticorpi fluorescenti come delineato nel protocollo di testo. Scongelare le cellule crioconservate in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per due minuti. Successivamente, aggiungere da 5 a due millilitri della sospensione cellulare a un tubo da 15 millilitri contenente 12 millilitri di PBS.
Centrifugare a 500 G per tre minuti a 25 gradi Celsius, quindi aspirare il PBS e rimospendare il pellet in tre millilitri di PBS fresco. Trasferire questa miscela in un tubo di polistirolo a cinque millilitri. Centrifuga ancora una volta a 500 G per tre minuti a 25 gradi Celsius.
Aspirare il supernatante, lasciando circa 10 microlitri pbs residui. Successivamente, ha rimospenso fino a 20 milioni di cellule lavate in 80 microlitri di cocktail di anticorpi. Incubare per 20 minuti a 25 gradi Celsius mentre è protetto dalla luce.
Successivamente, aggiungere tre millilitri di PBS. Centrifuga a 500 G per tre minuti e aspira il supernatante. Rimorsi completamente le cellule in 300-500 microlitri di PBS.
Filtrare questa soluzione tubazione attraverso un tappo filtrante a celle in nylon da 35 micrometri. quindi tenere le cellule sul ghiaccio e protette dalla luce fino all'ordinamento. Di nuovo nella workstation pre-PCR, preparare prima il mix di reazione RT preAMP in un singolo tubo sterile privo di RNasi, DNasi come delineato nel protocollo di testo.
Utilizzando una pipetta multicanale, erogare 10 microlitri di questa miscela di reazione nel numero desiderato di 96 piastre di raccolta di ordinamento PCR ben. Sigillare la piastra con pellicola adesiva e quindi posizionare la piastra su un blocco di alluminio pre-refrigerato da 96 po '. Successivamente, stabilire lo schema di smistamento delle celle e preparare lo smistatore di celle citometriche del flusso come descritto nel protocollo di testo.
Immettere le impostazioni dello strumento appropriate per specificare il numero e il sottoinsieme di celle da ordinare in ogni pozzo. Rimuovere la guarnizione adesiva, quindi FACS ordinare le celle nelle piastre di raccolta PCR preparate da 96 po '. Rigillare la piastra con pellicola adesiva fresca.
Vortice immediatamente la piastra richiacrato e quindi centrifugare a 2000 G per un minuto a quattro gradi Celsius. Termociclo la piastra in una macchina PCR con coperchio preriscaldato a 50 gradi Celsius per 15 minuti seguita da 95 gradi Celsius per due minuti. Infine, termociclo per 18 cicli di 95 gradi Celsius per 15 secondi e 60 gradi Celsius per quattro minuti, quindi in una workstation post-PCR, trasferire cinque microlitri di cDNA in 20 microlitri di tampone di sospensione del DNA in una nuova piastra PCR da 96 po '.
Per iniziare, preparare la piastra di dosaggio qPCR pipettando quattro microlitri di reagente di carico del saggio in ogni pozzo. Successivamente, trasferire quattro microlitri di ogni saggio dalla piastra di dosaggio 2X alla piastra qPCR. Mantenere la piastra di dosaggio qPCR a quattro gradi Celsius.
Erogare i fluidi della linea di controllo dalle siringhe di adescamento nelle due valvole di aspirazione del chip. Rimuovere la plastica protettiva da sotto la piastra. Posizionare il chip su un controller IFC con il lato dentellato nella posizione A1, quindi selezionare ed eseguire lo script principale.
Per ogni chip microfluidico, mescolare 50 microlitri del reagente di caricamento del campione con 500 microlitri di mix master PCR per preparare il mix di reazione in tempo reale. I microlitri Pipette 4.4 di questa reazione si mescolano in ogni pozzo di una nuova piastra PCR da 96 po 'ora designata come piastra campione. Successivamente, pipetta 3,6 microlitri del cDNA precedentemente diluito in ogni pozzo della piastra del campione.
Successivamente, trasferire cinque microlitri dalla piastra di dosaggio al pozzo corrispondente sul lato dentellato del chip. Trasferire cinque microlitri dalla piastra del campione nel pozzo corrispondente sull'altro lato del chip. Inserire il chip caricato nel controller IFC ed eseguire lo script di combinazione di carico.
Successivamente, trasferire il chip sulla piattaforma BioMark e impostare lo strumento come descritto nel protocollo di testo, quindi salvare il file di esecuzione del chip in una cartella designata. Al termine dell'esecuzione del chip, aprire il software di analisi PCR in tempo reale e quindi selezionare il file, aprire, per aprire il chiprun. bml.
Nell'angolo in alto a sinistra della finestra del software, individuare il riepilogo dell'explorer dei chip e dell'esecuzione del chip. In Riepilogo esecuzione chip fare clic sulla configurazione del rilevatore. In attività fare clic su nuovo e selezionare il tipo di contenitore SBS plate e il formato contenitore SBS 96.
Fare clic sul pulsante con i puntini di sospensione accanto alla mappatura, quindi selezionare M96-Assay-SBS96.dsp. Fare clic sulle visualizzazioni analisi. Nella scheda qPCR in attività selezionare correzione di base per la derivata lineare e il metodo di soglia CT per i rilevatori utente.
Nella scheda Soglie CT selezionare la casella inizializza con auto e quindi fare clic sul pulsante analizza. Nel quadrante superiore destro delle visualizzazioni analisi fare clic sulla seconda scheda, tabella dei risultati. Dal menu a discesa, selezionare la visualizzazione mappa termica e verrà visualizzata la mappa termica con i dati.
Sotto la mappa termica, fare clic su soglia e grafico di registro. Regolare manualmente le soglie CT per ogni rivelatore facendo clic su saggi, rappresentati da colonne sulla mappa termica, e trascinando la soglia se necessario per intersecare le curve di amplificazione nella fase esponenziale. Al termine, fare clic su analizza.
Esportare quindi i dati qPCR come file CSV. Trasferire i dati qPCR dal computer BioMark al desktop. Importare i dati in un foglio di calcolo o in un software di analisi statistica e mappare i risultati in base alle posizioni di campionamento e dosaggio sul chip.
Creare una nuova colonna e utilizzare una formula condizionale per organizzare le cellule in gruppi basati sull'espressione di geni virali. In analisi, selezionare fit Y per X e tracciare l'espressione genica rispetto al gruppo. Successivamente, utilizzare FlowJo versione nove per aprire i file FCS dall'ordinamento FACS corrispondente a una piastra di pozzo 96.
Con il nome del file evidenziato, selezionare piattaforma, gate del numero di evento e creare gate di ordinamento indicizzati. Le singole celle appariranno visualizzate per riga. Evidenziare tutte le 96 celle e quindi selezionare l'area di lavoro, esportare, selezionare tutti i piani compensati.
In Dati selezionare file FCS, fare clic su Esporta e selezionare una cartella designata. Trascinare i nuovi file FCS per le singole celle in una nuova area di lavoro FlowJo. Evidenziare tutte le celle e fare clic su aggiungi statistiche, rappresentate dal pulsante sigma, dalla media e da tutti i parametri di fluorescenza.
Aprire l'editor di tabelle, quindi evidenziare tutti i piani della prima cella e trascinarli nella finestra dell'editor della tabella. In questa finestra fare clic su Crea e visualizza tabella. Successivamente, copiare e produrre in un software statistico copiando o facendo clic sul pulsante salva e avvia applicazione.
Unire i dati FACS a cella singola con i dati qPCR in JMP in base al numero di targa e alla posizione del pozzo. Infine, eseguire analisi grafiche e statistiche sui dati combinati. In questo studio, la quantificazione delle proteine di superficie a singola cellula per citometria a flusso multi-parametro è integrata con l'espressione quantitativa di mRNA a singola cellula da RTqPCR altamente multiplexato.
Qui è mostrata l'espressione genica virale quantitativa a singola cellula dalle cellule T positive cd4 di Rhesus macaque ordinate dalla FACS. Tat/rev positivo N di cellule negative esprimono meno copie di tat/rev RNA rispetto alla N delle cellule positive in verde scuro che è coerente con una fase precoce dell'infezione prima della stabilizzazione e un'esportazione nucleare di RNA virale parzialmente spliced. Un'alta abbondanza di Gag-RNA non scontento in tat/rev positivo N di cellule positive è coerente con l'infezione produttiva in fase avanzata durante la quale l'abbondante RNA genomico viene espresso e confezionato in virioni in erba.
Questo grafico trivariato che mostra il gene virale a singola cellula, il gene ospite e l'espressione proteica della superficie ospite mostra che l'espressione proteica di superficie CD4 e CD3 è diminuita in cellule tat/rev positive mostrate in verde anche se le trascrizioni CD4 e CD3 sono sostenute. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre giorni. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una valutazione prototrascrizionale a singola cellula mirata per affrontare le domande relative ai geni e alle proteine espressi in modo differenziato nelle cellule infettate viralmente.
