Gli autori si desidera ringraziare la Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir per il supporto finanziario per questo lavoro attraverso la 001UCV-231-2017 e 2018-231-001UCV concede.

1. preparazione del campione
<ol><li>Tagliare i campioni di materiale in dischi di diametro di 10 mm con un diametro di 10 mm punzone cilindrico. Nota: Materiali fragili possono essere ammorbiditi in opportuni solventi sterile per 1 h e poi tagliarle a dischi. Ad esempio, materiali idrofili come alginato di zinco sono stati testati seguendo questo protocollo e sono stati inumiditi in acqua in autoclave prima di tagliare loro al fine di evitare la rottura del campione. Tuttavia, altri materiali idrofobi quali poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) non è necessario alcun tipo di gonfiore precedente al fine di essere opportunamente tagliati.</li>
	<li>Asciugare i dischi di materiale campione a 60 ° C in un forno sottovuoto (< 10-2 Torr) per 24 h. Nota: Alcuni materiali potrebbero essere necessario un'ad alta temperatura di essiccazione. Tuttavia, è importante non arrivare ad una temperatura che termicamente potrebbe degradare il materiale.</li>
	<li>Misurare lo spessore di pellicola materiale con un calibro a corsoio digitale. Nota: Questo protocollo consiglia l'utilizzo di materiale film con spessori costanti e simili quando si confrontano l'attività antimicrobica di materiali diversi.</li>
	<li>Sterilizzare ogni campione mediante immersione in etanolo al 70% per 10 min e successive radiazioni ultraviolette (UV) per 1 h per ogni lato. Nota: Radiazioni UV possono essere eseguita ponendo ogni campione in una piastra Petri sterile all'interno di una cappa a flusso laminare con una lampada W 12.0 di radiazioni UV-C. Attenzione: I ricercatori dovrebbero non esporsi ai raggi UV, perché è mutageno.</li>
	<li>Eseguire i passaggi 1.1, 1.2, 1.3 e 1.4. con i dischi di materiale di controllo. Nota: Polietilene tereftalato (PET) o materiali non antimicrobico alternativi possono essere utilizzati come dischi di controllo nel metodo di diffusione e contatto. Inoltre, quando che caratterizzano nanocompositi o materiali trattati, il materiale di base deve essere utilizzato come materiale di controllo.</li>
</ol>2. consigliati microrganismi
Nota: Si consiglia l'utilizzo di 3 diversi microrganismi per studiare la capacità antimicrobica del materiale testato contro una vasta gamma di microrganismi.
<ol><li>Utilizzare colture pure di 3 microrganismi: i batteri Gram-positivi Staphylococcus aureus, i batteri gram-negativi Escherichia colie il lievito Candida albicans. Nota: Altre specie di microorganismo può essere testato anche con questo protocollo modificando le condizioni di incubazione, se necessario. Attenzione: Le misure di biosicurezza necessarie devono essere seguite in base al tipo di microrganismo impiegato in questo protocollo.</li>
	<li>Lavorare con materiale pre-sterile o in autoclave e utilizzare un bruciatore di Bunsen durante l'intero processo di manipolazione microbica o un armadio di sicurezza biologica (se necessario) per garantire condizioni asettiche. Nota: Condizioni di autoclave consigliati sono 121 ° C durante 15 min per coltura e 121 ° C durante 20 min per il materiale di lavoro e residui biologici.</li>
</ol>3. Test di diffusione del disco agar (metodo di diffusione)
Nota: Quando una liquida diffusione di composti antimicrobici potrebbe essere il principale meccanismo antimicrobico di materiali avanzati, il metodo di diffusione può fornire informazioni molto utili circa la capacità antimicrobica di questi materiali. Il disco di materiale si trova al centro della piastra di agar possa formano una zona di anello trasparente (halo) dove un'inibizione della crescita dei microrganismi si verifica dopo 24 h di cultura (Vedi Figura 1).
<ol><li>
Procedura di test di diffusione
	<ol>
<li>Preparare e autoclave tryptic soy agar (TSA) seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Versare il TSA Petri sterili in condizioni asettiche con un becco Bunsen o cappa a flusso laminare. Nota: Le piastre TSA devono essere 4 – 6 mm di spessore.</li>
		<li>Coltura di microrganismi diversi da sottoporre a aerobicamente per 18 – 24 h nei piatti Petri con TSA in un incubatore a 37 ° C.</li>
		<li>Preparare e il brodo di soia triptico di autoclave (TSB) seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Versarvi il TSB una provetta da centrifuga pre-sterilizzati 50 mL con una pipetta sierologica pre-sterilizzata in condizioni asettiche con un becco Bunsen o cappa a flusso laminare.</li>
		<li>Risospendere alcune colonie dal punto 3.1.3 in 25 mL di TSB contenute in una provetta sterile utilizzando un tampone di cotone sterile e vortex per 1 min ottenere una miscelazione uniforme.</li>
		<li>Regolare l'assorbanza (a 540 nm) della cultura con uno spettrofotometro per il numero adatto di unità formanti / mL Colonia (UFC): circa 1.5 x 108 UFC/mL per i batteri e da 1 x 106 a 5 x 106 CFU/mL per il lievito. Nota: I volumi di cultura e cuvette per misurare l'assorbanza devono essere selezionati secondo il tipo di spettrofotometro utilizzato.</li>
		<li>Vortice il brodo microbico per 5 secondi per migliorare la dispersione del microorganismo e brevemente immergere un tampone di cotone sterile in questa sospensione microbica. Rimuovere l'eccesso di liquido dal tampone premendolo contro la parete del tubo che contiene le impostazioni cultura.</li>
		<li>Striscia in modo uniforme la sospensione microbica brodo con il tampone di cotone sterile sulla superficie delle piastre TSA in 3 piani per coprire tutta la loro superficie con il microorganismo e lasciare asciugare per 5 min dopo l'inoculazione. Nota: Per rimuovere eventuali tracce di umidità, le piastre TSA devono trovarsi aperte in posizione invertita a 37 ° C per 10 – 15 min prima dell'inoculazione.</li>
		<li>Sterilizzare un paio di pinzette immergendole in un becher con etanolo al 96% e poi li fiammeggiante con un becco Bunsen o bruciatore ad alcool.</li>
		<li>Inserire i dischi di campione per essere testato e controllare il disco al centro delle piastre TSA utilizzando la coppia di pinzette sterili.</li>
		<li>Aerobicamente Incubare le piastre TSA in posizione invertita a 37 ° C per 24 h. Nota: Per evitare qualsiasi rischio di contaminazione, si consiglia di incubare le piastre TSA in posizione invertita. Tuttavia, se il disco di campione si stacca dalle piastre TSA, non eseguire questo passaggio in posizione invertita. In questo caso, si raccomanda di asciugare le piastre nella cappa a flusso laminare. Questa prova antimicrobica deve essere eseguita almeno in quadriplicate in giorni diversi per garantire la riproducibilità.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Il controllo della purezza e della concentrazione di sospensione microbica Nota: I passaggi seguenti sono necessari per verificare che la concentrazione microbica determinata con lo spettrofotometro nel passaggio 3.1.7 sia corretta e garantire che non c'era nessuna contaminazione microbica ambientale. Una contaminazione microbica ambientale possa essere facilmente individuata dalla comparsa di vari tipi di colonie microbiche dopo 24 h di cultura. Inoltre, nessuna contaminazione microbica del mezzo TSB durante la sua manipolazione nelle diluizioni seriali decimali deve essere garantita con una piastra di controllo TSB negativa.<ol>
<li>Dispensare il TSB sterile (preparata al punto 3.1.4) in microcentrifuga sterile utilizzando una micropipetta con punte in autoclave adatti in condizioni asettiche. Uno di loro sarà utilizzato come controllo negativo TSB.</li>
		<li>Effettuare diluizioni seriali decimali con la sospensione microbica brodo utilizzata nel passaggio 3.1.9 nelle provette microcentrifuga sterile contenente TSB.</li>
		<li>100 µ l di ciascuna diluizione su piastre TSA utilizzando una spatola Drigalski pre-sterilizzata o uno strumento alternativo di diffusione. Diffuse anche 100 μL del mezzo TSB senza microorganismo (preparata al punto 3.2.1) su una piastra TSA come una piastra di controllo TSB negativa.</li>
		<li>Aerobicamente Incubare le piastre TSA aerobicamente a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Contare il numero di colonie per controllare che i CFU/mL sono simili a quella determinata nel passaggio 3.1.7.</li>
		<li>Verifica che non c'è nessuna contaminazione microbica ambientale sulle piastre TSA con un solo tipo di colonie.</li>
		<li>Verifica che non c'è nessuna contaminazione microbica sulla piastra di controllo negativo di TSB non mostrando nessun colonie</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. la valutazione dell'attività antimicrobica su superfici di materiale (metodo di contatto)
 Nota: Quando la superficie di contatto potrebbe essere il principale meccanismo antimicrobico di alcuni materiali avanzati, il metodo di contatto può fornire informazioni molto utili circa la capacità antimicrobica di questi materiali. In questo metodo, i microrganismi sono collocati direttamente sulla superficie del materiale e la loro inibizione di crescita può essere determinato dopo un certo periodo di tempo.
<ol><li>
Procedura iniziale
	<ol>
<li>Preparare ed autoclave TSB seguendo le istruzioni del produttore.</li>
		<li>Versarvi il TSB una provetta da centrifuga pre-sterilizzati 50 mL con una pipetta sierologica pre-sterilizzata in condizioni asettiche con un becco Bunsen o cappa a flusso laminare.</li>
		<li>Coltura di microrganismi diversi da sottoporre a aerobicamente pernottamento nel tubo con TSB in un agitatore orbitale (140 giri/min) a 37 ° C.</li>
		<li>Diluire la cultura pernottamento in 20 mL di TSB in una provetta da centrifuga pre-sterilizzati 50 mL ad una concentrazione di circa 106 CFU/mL (determinato con uno spettrofotometro a 540 nm). Nota: I volumi di cultura e cuvette per misurare l'assorbanza devono essere selezionati secondo il tipo di spettrofotometro utilizzato.</li>
		<li>Eseguire diluizioni decimali seriali di questa cultura in microcentrifuga sterile contenente TSB. Sviluppa 100 µ l della coltura su piastre di TSA e viene quindi incubato aerobicamente a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Contare il numero di colonie per garantire una concentrazione di cellula iniziale di circa 1 x 106 CFU/mL</li>
		<li>Posto 4 dischi di controllo per la conta microbica dopo 24 h e 4 dischi di esempio di ogni tipo di materiali testati per la conta microbica dopo 24 h in separa dei pozzetti di una piastra a 48 pozzetti sterile.</li>
		<li>Dispensare 150 µ l della sospensione microbica su ciascuna superficie del disco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Microbica contando sul controllo e materiali testati (dopo 24 h)
	<ol>
<li>Dopo passo 4.1.6, aerobicamente Incubare i 4 dischi di campione restanti nella piastra 48 pozzetti a 37 ° C per 24 h. Nota: Questo tempo di incubazione di 24 ore può essere modificato al fine di studiare l'inibizione della crescita in tempi più brevi o più lunghi.</li>
		<li>Dopo 24 h di incubazione, 850 µ l di PBS sterile sulla superficie dei 4 dischi campione e mescolarlo con il 150 µ l della sospensione microbica.</li>
		<li>Raccogliere la miscela di sospensione PBS/microbica e ogni disco dalla piastra 48 pozzetti e trasferirli in una provetta pre-sterilizzati da 10 mL.</li>
		<li>Vortice la miscela di sospensione PBS/microbica e ogni disco per 1 min, Sonicare esso a 50 Hz per 5 min e vortice ancora per 1 min assicurare che nessun microrganismi vitali rimangano aderì alla superficie del materiale.</li>
		<li>Eseguire diluizioni decimali seriali di ogni cultura lisati mediante in microcentrifuga sterile contenente TSB e diffondere 100 µ l della coltura su piastre di TSA e viene quindi incubato aerobicamente a 37 ° C per 24 h.</li>
		<li>Contare il numero di colonie, che sono il numero di microrganismi vitali su ogni superficie del disco campione e controllo. Esprimere questo numero di cellule vitali in (CFU/mL).</li>
		<li>Prendere una fotografia della coltura microbica finale per i dischi del campione e controllo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. antimicrobica Risultati analisi
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig1.jpg"> Figura 1: misure per la larghezza normalizzata dell'antimicrobico "halo". Questo pannello mostra il diametro della zona di inibizione (diz) e il diametro del disco (d). <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<ol><li>
Analisi dei risultati metodo di diffusione
	<ol>
<li>Misurare il diametro della zona di inibizione (diz) e il diametro del disco (d) (Vedi Figura 1) con un calibro a corsoio digitale. Nota: L'inibizione zona o antimicrobico "alone" è formata come conseguenza l'inibizione della crescita microbica prodotto dal disco materiale antimicrobico (Vedi Figura 1). È possibile osservare che c'è una zona trasparente anello vicino il campione rispetto al resto della piastra dove i microrganismi cresciuti correttamente (zona opaco).</li>
		<li>Determinare la larghezza normalizzata dell'antimicrobico "halo" (nwhalo) di ciascun disco applicando l'equazione (1). (1)<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq1.jpg">
</li>
		<li>Determinare la media e la deviazione standard della larghezza normalizzata dei valori nwhalo antimicrobica "alone" con 4 determinato di ciascun campione.</li>
		<li>Prendere una fotografia della coltura microbica finale con il disco di materiale. Nota: Il diametro della zona di inibizione (diz) e il diametro del disco (d) può anche essere misurate dalla fotografia scattata al punto 5.1.4 utilizzando una software di elaborazione di immagini adatta.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Metodo di contatto Risultati analisi
	<ol>
<li>Determinare il numero di microrganismi vitali recuperate secondo l'equazione (2). (2)<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq2.jpg"> Nota: Qui, N è il numero di microrganismi vitali recuperato per cm2 al provino; C è il conteggio di piatto; D è il fattore di diluizione; A è l'area della superficie del provino in cm2 determinato con il diametro del disco del campione.</li>
		<li>Determinare la perdita di attuabilità (LV) per riflettere l'inibizione della crescita delle cellule applicando l'equazione (3). (3)<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57710/57710eq3v3.jpg"> Nota: Qui, C è il numero medio di microrganismi vitali (N) in CFU/mL•cm2, recuperato agli esemplari di controllo dopo 24 h; S è il numero di microrganismi vitali (N) in CFU/mL•cm2, recuperato i campioni del test dopo 24 h.</li>
		<li>Determinare la media e la deviazione standard della perdita di attuabilità con 4 valori determinati LV(%) di ciascun campione.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Sydnor, E. R. M., Perl, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hospital+epidemiology+and+infection+control+in+acute-care+settings.">Hospital epidemiology and infection control in acute-care settings.</a> Clin Microbiol Rev. 24 (1), 141-173 (2011).</li><li>Chessa, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staphylococcus+aureus+and+Staphylococcus+epidermidis+Virulence+Strains+as+Causative+Agents+of+Persistent+Infections+in+Breast+Implants.">Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis Virulence Strains as Causative Agents of Persistent Infections in Breast Implants.</a> PLoS One. 11 (1), e0146668 (2016).</li><li>Pandey, H., Parashar, V., Parashar, R., Prakash, R., Ramteke, P. W., Pandey, A. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma-induced+polymerisation+of+hydrophilic+coatings+onto+macroporous+hydrophobic+scaffolds.">Plasma-induced polymerisation of hydrophilic coatings onto macroporous hydrophobic scaffolds.</a> Polymer (Guildf). 48 (7), 2071-2078 (2007).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Rault, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermal+analysis+of+water+in+reinforced+plasma-polymerised+poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels.">Thermal analysis of water in reinforced plasma-polymerised poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels.</a> Eur Polym J. 72, 523-534 (2015).</li><li>Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego-Ferrer, G., SuayAnt&#243;n, J., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+between+water+and+polymer+chains+in+poly(hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels.">Interaction between water and polymer chains in poly(hydroxyethyl acrylate) hydrogels.</a> Colloid Polym Sci. 279 (4), 323-330 (2001).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+crosslinking+on+porous+poly(methyl+methacrylate)+produced+by+phase+separation.">Effect of crosslinking on porous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation.</a> Colloid Polym Sci. 286 (2), 209-216 (2008).</li><li>Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Gallego Ferrer, G., Suay Ant&#243;n, J., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+poly+(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels.">Porous poly (2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels.</a> Polymer (Guildf). 42 (10), 4667-4674 (2001).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Monle&#243;n-Pradas, M., G&#243;mez-Ribelles, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macroporous+poly(methyl+methacrylate)+produced+by+phase+separation+during+polymerisation+in+solution.">Macroporous poly(methyl methacrylate) produced by phase separation during polymerisation in solution.</a> Colloid Polym Sci. 285 (7), 753-760 (2007).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Llorens-G&#225;mez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+mechanical+analysis+and+water+vapour+sorption+of+highly+porous+poly(methyl+methacrylate).">Dynamic mechanical analysis and water vapour sorption of highly porous poly(methyl methacrylate).</a> Polymer (Guildf). 125, 58-65 (2017).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Campillo-Fern&#225;ndez, A. J., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Monle&#243;n-Pradas, M., Gallego-Ferrer, G., Pissis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Porous+poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels+prepared+by+radical+polymerisation+with+methanol+as+diluent.">Porous poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels prepared by radical polymerisation with methanol as diluent.</a> Polymer (Guildf). 45 (26), 8949-8955 (2004).</li><li>Rodr&#237;guez-Hern&#225;ndez, J. C., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., G&#243;mez-Ribelles, J. L., Monle&#243;n-Pradas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+nanocomposite+scaffolds+with+ordered+cylindrical+orthogonal+pores.">Three-dimensional nanocomposite scaffolds with ordered cylindrical orthogonal pores.</a> J Biomed Mater Res - Part B: Appl Biomater. 84 (2), 541-549 (2008).</li><li>Br&#237;gido-Diego, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acrylic+scaffolds+with+interconnected+spherical+pores+and+controlled+hydrophilicity+for+tissue+engineering.">Acrylic scaffolds with interconnected spherical pores and controlled hydrophilicity for tissue engineering.</a> J Mater Sci Mater Med. 40 (18), 4881-4887 (2005).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Ruiz-Pividal, J. F., Llorens-G&#225;mez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+water+diffusion+and+compression+performance+of+crosslinked+alginate+with+a+minuscule+amount+of+graphene+oxide.">Enhancement of water diffusion and compression performance of crosslinked alginate with a minuscule amount of graphene oxide.</a> Sci Rep. 7, 11684 (2017).</li><li>Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+irregular+graphene+oxide+tubes+using+green+chemistry+and+their+potential+use+as+reinforcement+materials+for+biomedical+applications.">Synthesis of irregular graphene oxide tubes using green chemistry and their potential use as reinforcement materials for biomedical applications.</a> PLoS One. 12 (9), e0185235 (2017).</li><li>S&#225;nchez-Correa, F., Vidaurre-Agut, C., Serrano-Aroca, A., Campillo-Fern&#225;ndez, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly(2-hydroxyethyl+acrylate)+hydrogels+reinforced+with+graphene+oxide:+Remarkable+improvement+of+water+diffusion+and+mechanical+properties.">Poly(2-hydroxyethyl acrylate) hydrogels reinforced with graphene oxide: Remarkable improvement of water diffusion and mechanical properties.</a> J Appl Polym Sci. , (2018).</li><li>Serrano-Aroc, &. #. 1. 9. 3. ;., Iskandar, L., Deb, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+synthetic+routes+to+alginate-graphene+oxide+composite+hydrogels+with+enhanced+physical+properties+for+bioengineering+applications.">Green synthetic routes to alginate-graphene oxide composite hydrogels with enhanced physical properties for bioengineering applications.</a> Eur Polym J. 103, 198-206 (2018).</li><li>Llorens-G&#225;mez, M., Serrano-Aroca, &. #. 1. 9. 3. ;. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Low-Cost+Advanced+Hydrogels+of+Calcium+Alginate/Carbon+Nanofibers+with+Enhanced+Water+Diffusion+and+Compression+Properties.">Low-Cost Advanced Hydrogels of Calcium Alginate/Carbon Nanofibers with Enhanced Water Diffusion and Compression Properties.</a> Polymers (Basel). 10 (4), 405 (2018).</li><li>Bauer, A. W., Kirby, W. M. M., Sherris, J. C., Turck, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+susceptibility+testing+by+a+standardized+single+disk+method.">Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method.</a> A J Clin Pathol. 45, 493-496 (1966).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> ISO Specification 22196: measurement of antibacterial activity on plastics surfaces. , 584 (2007).</li><li>Taubes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+bacteria+fight+back.">The bacteria fight back.</a> Science. 321 (5887), 356-361 (2008).</li><li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=10+x+'20+progress--development+of+new+drugs+active+against+Gram-negative+bacilli:+an+update+from+the+infectious+diseases+society+of+America.">10 x '20 progress--development of new drugs active against Gram-negative bacilli: an update from the infectious diseases society of America.</a> Clinical Infectious Diseases. 56 (12), 1685-1694 (2013).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

L'attività antimicrobica dei nuovi materiali avanzati possa essere analizzato dal presente protocollo facile da seguire che consiste di 2 procedure complementari basate su 2 metodi esistenti: la diffusione del disco di agar test38 e l'attività antimicrobica misurata su superfici del materiale secondo la ISO 22196: 2007 norma39.
In questo campo di ricerca, molte delle prove antimicrobiche segnalate nella letteratura sono altamente dipendenti dal dosaggio. Pertanto, è molto importante avere precise e coerenti protocolli in luogo attraverso laboratori. Questo articolo è un passo in quella direzione. Inoltre, esso potrebbe essere molto utile per molti ricercatori che sono meno esperti in questo campo e richiedono approfondite, passo dopo passo le procedure da seguire per ottenere risultati accurati.
Questo protocollo può essere usato con molti tipi di materiali tagliati in forme di disco del diametro di 10 mm. Materiali fragili possono essere gonfiati in un solvente adatto per 1 h rendere più facile il processo di taglio. Così, materiali idrofili quali alginati possono essere idratate in acqua distillata in autoclave. Altri solventi, quali etanolo, chetone, diclorometano e possono essere impiegati a gonfiarsi materiali idrofobi per 1 h prima di tagliarli. Tuttavia, non è necessario che alcuni materiali come poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) essere gonfio e possono essere tagliate direttamente. Dopo di che, è molto importante asciugare i dischi di materiale campione in un forno sottovuoto e sterilizzare ogni esemplare con etanolo e raggi UV per 1 h per evitare qualsiasi rischio di contaminazione.
Questo protocollo raccomanda TSA e TSB come terreni di coltura e l'uso di colture pure di 3 microrganismi per raggiungere un'ampia gamma di microrganismi: i batteri Gram-positivi Staphylococcus aureus, i batteri gram-negativi Escherichia coli, e il lievito Candida albicans. Tuttavia, media alternativi di cultura e altri microrganismi che hanno bisogno di condizioni di incubazione diversi potrebbero essere usati anche con questo protocollo. A volte, solo 1 microorganismo è testato per avere un'idea iniziale dell'attività antimicrobica di un nuovo materiale.
I materiali mostrando forte attività antimicrobica contro i consigliati 3 diversi tipi di microrganismi devono essere testati anche contro gli agenti patogeni antibiotico-resistenti come meticillina-resistente Staphylococcus epidermidis (MRSE), che sono stati utilizzati con successo con questo protocollo. Altri importanti microrganismi farmaco-resistenti che sono causa di molta preoccupazione sono i gram-positivi meticillino-resistente Staphylococcus aureus (MRSA) e vancomicina-resistenti enterococchi (VRE) e il gram-negativi Pseudomonas aeruginosa40,41.
Inibizione di biofilm e l'attività antimicrobica dei materiali contro altri tipi di microrganismi come virus e parassiti non possono essere testati con questo protocollo. Tuttavia, questo protocollo fornisce un punto di partenza molto utile per uno studio antimicrobico di un nuovo materiale avanzato.
Nel test di diffusione disco antimicrobico agar, un passaggio critico si verifica quando il disco campione deve essere posto al centro della piastra perché alcuni materiali piegare appena contatto con i media di agar. In questo caso, è consigliabile utilizzare una coppia sterile di pinzette per spiegare accuratamente il campione. D'altra parte, nel metodo di contatto, è fondamentale per il controllo di lavare e dischi di campione molto bene con PBS pipettando li quattro volte seguita da una vigorosa agitazione e sonicazione per non garantire che nessun microrganismi vitali rimangono aderiti al materiale superficie.
Questo video protocollo può essere utilizzato in molte applicazioni di bioingegneria, quali ingegneria dei bioprocessi, ingegneria tissutale, controllata di farmaci, materiali da imballaggio, trattamento delle acque reflue e l'agricoltura, che utilizzare biomateriali con un altamente capacità antimicrobica desiderabile.
I risultati ottenuti con questo protocollo sono qualitativi (le immagini) e quantitativa (la larghezza normalizzata di antibatterico "halo" e la perdita di attuabilità) con una buona analisi della sua riproducibilità (media ± deviazione standard). Quando si confrontano diversi materiali, questi valori medi ottenuti con l'analisi di risultati metodo di diffusione e contatto devono essere analizzati da One-way ANOVA, seguita da analisi post hoc, della Turchia, al fine di studiare se essi sono, statisticamente, significativamente differenti (p < 0,01).

Fallimento dell'impianto è spesso una conseguenza di infezioni microbiche che si verificano nonostante la profilassi antimicrobica e condizioni di lavoro asettico. Questo problema è causando costi sanitari molto elevati ed è angosciante tra pazienti1. Importanti batteri come Staphylococcus aureus sono attualmente considerati molto pericolosi agenti patogeni nelle infezioni nosocomial connesse con cateteri e altri impianti medici e sono i principali contaminanti di strumenti medici2. Di conseguenza, lo sviluppo di nuove strategie antimicrobiche è urgente per usi sia giornalieri che medicali.
Agenti antimicrobici includono antibiotici3, composti di ammonio quaternario4, ioni/ossidi metallici5e peptidi antimicrobici (amp)6. Gli antibiotici sono gradualmente sempre meno efficienti a causa della resistenza batterica7, che è in aumento a causa di un uso eccessivo di antibiotici8. Composti di ammonio quaternario sono solo molto efficienti per un uso a breve termine a causa della resistenza microbica9. Gli ioni/ossidi metallici sono stati a lungo utilizzati come agenti antimicrobici molto efficaci e sono utilizzati in molti prodotti commerciali comuni tra cui bende, filtri per l'acqua, vernici, ecc.10,11,12. Tuttavia, è stato dimostrato che questi tipi di composti possono essere tossici per alcuni tipi di cellule di mammifero13.
Amplificatori Visualizza eccellente antimicrobico e immunomodulatori proprietà14,15, e batteri sembrano trovare molto difficile sviluppare una resistenza contro di loro16. Tuttavia, il processo per produrre puro AMPs è costoso; di conseguenza, una produzione su larga scala non è praticabile. Quindi, strategie per contrastare i problemi nella produzione di amplificatori sono stati sviluppati (ad es., piccolo molecolare antibatterico peptoid imita17, peptoids18, α-peptidi19 e β-peptidi20). Polypeptoids e si è conclusa in metacrilato polipeptidi sono stati sintetizzati per rivestimenti antimicrobici e antivegetativa21.
Lo sviluppo di nuovi agenti antimicrobici quali materiali avanzati in puro o la forma ibrida, in grado di prevenire e curare le infezioni multidrug-resistente, è sempre più necessario. Una vasta gamma di nuovi materiali avanzati per molti campi di bioingegneria come tessuto e ingegneria di bioprocess sono stati sviluppati con proprietà chimiche e fisiche migliorate negli ultimi decenni attraverso diversi metodi: polimerizzazione al plasma innesto un substrato idrofobo22,23,24, sartoria di reticolazione densità25,26, polimerizzazione in soluzione27,28,29 , 30, porogen dissoluzione31,32e dall'incorporazione di nanomateriali quali grafene ossido (GO)33,34,35,36 e carbonio nanofibre (CNFs)37.
Lo studio della capacità antimicrobica di questi nuovi materiali potrebbe aumentare in modo esponenziale il loro potenziale applicabilità di Bioingegneria e ha, pertanto, diventano essenziale. Vi presentiamo un protocollo facile da seguire per quantificare l'attività antimicrobica di tali nuovi materiali avanzati. Qui, dopo la preparazione del campione, sono seguiti due metodi complementari: il primo si basa su agar diffusione test disco38 (metodo di diffusione) e la seconda si basa sulla norma ISO 22196: 200739 per misurare l'attività antimicrobica su superfici del materiale (metodo di contatto).

<table><tbody><tr><td>Cylindrical punch&amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td>10 mm diameter</td></tr><tr><td>Petri dishes</td><td>soria genlab</td><td>P101</td><td>90 mm diameter, sterile</td></tr><tr><td>Tryptic soy agar (TSA)</td><td>Liofilchem</td><td>610052</td><td>Dehydrated medium 500 g (powder)</td></tr><tr><td>Tryptic soy broth (TSB)</td><td>Liofilchem</td><td>610053</td><td>Dehydrated medium 500 g (powder)</td></tr><tr><td>Sterile cotton swab</td><td>EUTOTUBO</td><td>300200</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge tubes</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>429900</td><td>50 mL, sterile</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>VWR</td><td>83813360</td><td>Absolute ethanol</td></tr><tr><td>Sterile 48-wells plate</td><td>COSTAR</td><td>3548</td><td>Flat bottom with lid, tissue culture treated, non-pyrogenic, polystyrene</td></tr><tr><td>A pair of tweezers</td><td>BRAUN</td><td>24612036</td><td>Toothless</td></tr><tr><td>Sterile phosphate buffered saline (PBS).</td><td>VWR</td><td>E404-100TAPBS</td><td></td></tr><tr><td>Vaccum oven with a connected vacuum pump</td><td>JP Selecta, SA</td><td>5900620</td><td></td></tr><tr><td>Laminar flow hood</td><td>TELSTAR Technologies, SL</td><td>TELSTAR AH-100</td><td>12.0 W lamp of UV-C radiation</td></tr><tr><td>Class II Biological safety cabinet</td><td>LABOGENE</td><td>MARS 1200</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>ASTEC CO, LTD</td><td>SCA-165DR</td><td></td></tr><tr><td>Vortex mixer</td><td>Biosan</td><td>V-1 Plus</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Macherey-Nagel, Germany</td><td>Nanocolor UV/VIS II</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen burner</td><td>JP Selecta, SA</td><td>7001539</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol burner</td><td>VIDRA FOC, SA</td><td>1658/20</td><td>In case sterilisation is necessary to be performed inside class II biological safety cabinet</td></tr><tr><td>Orbital shaker</td><td>sartorius stedim</td><td>8864845</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>SELECTA</td><td>3000617</td><td>50/60 Hz</td></tr><tr><td>Digital calliper</td><td>ACHA</td><td>17-260</td><td>0-150 mm</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>Fisherbrand</td><td>13-678-11</td><td>25 mL, sterile</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>VWR</td><td>612-4950</td><td>5 mL, sterile</td></tr><tr><td>Serological pipette</td><td>VWR</td><td>612-5541</td><td>10 mL, sterile</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>FA10005P</td><td>Pipetman L P200L, plastic 20-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette</td><td>GILSON</td><td>F123602</td><td>Pipetman P1000, 200-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette&amp;nbsp;</td><td>GILSON</td><td>FA10016</td><td>Pipetman L P12X300L, 20-300 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette tips</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-200-960</td><td>2-200 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Micropipette tips</td><td>LABBOX</td><td>TIBP-1K0-480</td><td>100-1000 &amp;micro;L</td></tr><tr><td>Pre-sterilized tube&amp;nbsp;</td><td>INSULAB</td><td>301402</td><td>10 mL&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Photo camera</td><td>Canon EOS 5D</td><td></td><td>Any camera with high resolution can also be utilized</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus&lt;/em&gt;</td><td></td><td>&amp;nbsp;strain V329</td><td>Cucarella et al. &lt;em&gt;J Bacteriol&lt;/em&gt; &lt;strong&gt;183 (9)&lt;/strong&gt;,&amp;nbsp; 2888&amp;ndash;2896 (2001)</td></tr><tr><td>Gram-negative bacteria &lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 101</td><td></td></tr><tr><td>Yeast &lt;em&gt;Candida albicans&lt;/em&gt;</td><td>Colecci&amp;oacute;n Espa&amp;ntilde;ola de Cultivos Tipo CECT</td><td>CECT 1394</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge tubes&amp;nbsp;</td><td>DASLAB</td><td>175508</td><td>1,5 mL</td></tr><tr><td>Autoclave</td><td>JP Selecta, SA</td><td>4002136</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer-cuvettes</td><td>UVAT Bio CB</td><td>F-0902-02</td><td>4,5 mL</td></tr><tr><td>Drigalski spatula</td><td>LABBOX</td><td>SPRP-L05-1K0</td><td>Sterile, disposable&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>glass balls (2 mm diameter)</td><td>Hecht Karl</td><td>1401/2</td><td>Autoclavable, alternative device to the Drigalski spatula</td></tr><tr><td>Autoclave bags</td><td>DELTALAB</td><td>200318</td><td>To sterilize microbiological residues or contaminated material</td></tr><tr><td>Electronic pipette filling device</td><td>JetPip</td><td>JET BIOFIL</td><td></td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-100-010</td><td>100 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-250-010</td><td>250 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-500-010</td><td>500 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Laboratory bottle with ISO thread, graduated, borosilicate 3.3</td><td>LABBOX</td><td>SBG3-1K0-010</td><td>1000 mL, for autoclaving culture media</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>DENIA</td><td>2278000000</td><td></td></tr><tr><td>Indicator tape for sterilization</td><td>LABBOX</td><td>STAP-A55-001</td><td>Self-adhesive tape with impregnated paper turning to colour when exposed to sterilization process.</td></tr><tr><td>Universal test tube rack</td><td>LABBOX</td><td>MTSP-001-001</td><td>To hold centrifuge tubes</td></tr><tr><td>Microcentrifuge tube rack</td><td>VWR</td><td>211-0210</td><td>To hold microcentrifuge tubes</td></tr><tr><td>Sterile loop</td><td>ACEFE S.A.</td><td>100140055</td><td>10 &amp;micro;L of capacity for microbial culture&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M1</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 1&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M2</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material M3</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type3</td></tr><tr><td>Material M4</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Material type 4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Material C</td><td>Universidad Cat&amp;oacute;lica de Valencia San Vicente M&amp;aacute;rtir (UCV)</td><td></td><td>Control material</td></tr></tbody></table>

antimicrobial characterization of advanced materials for bioengineering applications

Lo sviluppo di nuovi materiali avanzati con proprietà migliorate sta diventando sempre più importante in una vasta gamma di applicazioni di bioingegneria. Così, molti nuovi biomateriali sono stati progettati per simulare ambienti specifici richiesti per applicazioni biomediche quali ingegneria tissutale e somministrazione controllata. Lo sviluppo di materiali con proprietà migliorate per l'immobilizzazione di cellule o di enzimi è anche un argomento di ricerca corrente in ingegneria dei bioprocessi. Tuttavia, una delle proprietà più desiderabile di un materiale in queste applicazioni è la capacità antimicrobica per evitare eventuali infezioni indesiderate. Per questo, vi presentiamo facile da seguire protocolli per la caratterizzazione antimicrobica dei materiali basata (i) il test di diffusione disco agar (metodo di diffusione) e (ii) la norma ISO 22196: 2007 per misurare l'attività antimicrobica su superfici di materiale (contatto Metodo). Questo protocollo deve essere eseguito usando batteri Gram-positivi e Gram-negativi e lieviti per coprire un'ampia gamma di microrganismi. Ad esempio, 4 materiali con diversa natura chimica sono testati seguendo questo protocollo contro lo Staphylococcus aureus, Escherichia colie Candida albicans. I risultati di questi test mostrano attività non antimicrobico per il primo materiale e aumentando l'attività antibatterica contro i batteri Gram-positivi e Gram-negativi per gli altri 3 materiali. Tuttavia, nessuno dei 4 materiali sono in grado di inibire la crescita di Candida albicans.

Questo protocollo è stato impiegato, ad esempio, per testare la capacità antimicrobica dei 4 materiali con diversa natura chimica contro i 3 consigliato microrganismi: Staphylococcus aureus, Escherichia colie Candida albicans . I risultati dei test di diffusione disco agar (metodo di diffusione) ha esibito l'attività non antimicrobico per il primo materiale (M1) come avvenuto nel disco di controllo (C, immagine non mostrato) e aumentando l'attività antibatterica contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi batteri per gli altri materiali di 3 M2, M3 e M4 (Vedi Figura 2).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig2.jpg"> Figura 2: risultati del metodo di diffusione antimicrobica. Questo pannello mostra il metodo di diffusione antimicrobica per i 4 materiale (M1, M2, M3 e M4) dischi (diametro 10 mm x 1 mm di spessore) contro s. aureus ed Escherichia coli dopo 24 h di incubazione. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La figura 3 Mostra le diverse larghezze normalizzate dell'antimicrobico "halo" (nwhalo), per i materiali differenti esempio M1, M2, M3 e M4 contro i batteri Gram-positivi e Gram-negativi, calcolata con l'equazione (1). Tuttavia, nessuno dei 4 materiali erano in grado di inibire la crescita del lievito Candida albicans (immagini non mostrate).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2.jpg"> Figura 3: risultati di diffusione antimicrobica "halo". Questo pannello mostra il normalizzato "halo" (nwhalo) per ogni materiale (M1, M2, M3 e M4) disco (diametro 10 mm x 1 mm di spessore) contro s. aureus ed Escherichia coli dopo 24 h di incubazione. Le differenze sono statisticamente significative (p < 0,01). Tuttavia, esempio M1 hanno esibito alcuna attività antimicrobica. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig3v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
I risultati del metodo di contatto anche esposto non antimicrobico attività per il primo materiale (M1), come avvenuto nel controllo disco (C) e la crescente attività antibatterica contro Gram-positivi e batteri gram-negativi per gli altri 3 materiali (Vedi Figura 4).
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3.jpg"> Figura 4: antimicrobica contattare risultati metodo. Questo pannello mostra le piastre rispettivi 90 mm 4 materiale (M1, M2, M3 e M4) superficie attività antimicrobica dell'analisi di secondo la ISO 22196: 2007 dopo 24 h di incubazione per S. aureus ed Escherichia coli (fattore di diluizione di 10-4). C è i batteri vitali ha recuperati dal disco di controllo dopo 24 h di incubazione. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig4v3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
La perdita di attuabilità (%) è stata determinata dall'equazione (2) e (3) come indicato nel presente protocollo (Vedi Figura 5).
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2.jpg"> Figura 5: perdita di attuabilità di metodo di contatto. Questo pannello mostra la perdita di attuabilità (%) per M1, M2, M3 e M4 contro lo Staphylococcus aureus ed Escherichia coli sulla superficie del materiale. M1 campione non esposto alcuna attività antimicrobica. <a href="/files/ftp_upload/57710/57710fig5v2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Tuttavia, nessuno dei 4 materiali erano in grado di inibire la crescita del lievito Candida albicans dal metodo di contatto sia (immagini non mostrati). Di conseguenza, 3 di questi 4 materiali avanzati hanno mostrato risultati positivi antimicrobiche contro batteri Gram-positivi e Gram-negativi e quindi potrebbe essere molto utile per molte applicazioni di Bioingegneria con requisiti di alta attività antibatterica. Tuttavia, nessuno dei 4 materiali erano in grado di inibire la crescita del lievito.

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Antimicrobial Characterization of Advanced Materials for Bioengineering Applications

Vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione antimicrobica dei materiali avanzati. Qui, l'attività antimicrobica su superfici di materiale viene misurata dai due metodi che si completano a vicenda: uno si basa su test di diffusione del disco di agar, e l'altra è una procedura standard in base alla norma ISO 22196: 2007.

Antimicrobica caratterizzazione di materiali avanzati per applicazioni di Bioingegneria

The development of new advanced materials with enhanced properties is becoming more and more important in a wide range of bioengineering applications. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

21.9K Views.  Universidad Católica de Valencia San Vicente Mártir. Vi presentiamo un protocollo per la caratterizzazione antimicrobica dei materiali avanzati. Qui, l'attività antimicrobica su superfici di materiale viene misurata dai due metodi che si completano a vicenda: uno si basa su test di diffusione del disco di agar, e l'altra è una procedura standard in base alla norma ISO 22196: 2007.

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High-throughput Identification of Bacteria Repellent Polymers for Medical Devices

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as contributing to antimicrobial resistance. One possible avenue for the reduction of device-associated infections is the identification of bacteria-repellent polymer coatings for these devices, which would prevent bacterial binding at the initial attachment step. A method for the identification of such repellent polymers, based on the parallel screening of hundreds of polymers using a microarray, is described here. This high-throughput method resulted in the identification of a range of promising polymers that resisted binding of various clinically relevant bacterial species individually and also as multi-species communities. One polymer, PA13 (poly(methylmethacrylate-co-dimethylacrylamide)), demonstrated significant reduction in attachment of a number of hospital isolates when coated onto two commercially available central venous catheters. The method described could be applied to identify polymers for a wide range of applications in which modification of bacterial attachment is important.

A high-throughput microarray method for the identification of polymers which reduce bacterial surface binding on medical devices is described.

High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici

Medical devices are often associated with hospital-acquired infections, which place enormous strain on patients and the healthcare system as well as ...

Ricerca

Bioingegneria

Biomimetic Materials to Characterize Bacteria-host Interactions

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The biochemical and functional characterization of adhesins mediating these initial bacteria-host interactions is often compromised by the presence of other bacterial factors, such as cell wall components or secreted molecules, which interfere with the analysis. This protocol describes the production and use of biomimetic materials, consisting of pure recombinant adhesins chemically coupled to commercially available, functionalized polystyrene beads, which have been used successfully to dissect the biochemical and functional interactions between individual bacterial adhesins and host cell receptors. Protocols for different coupling chemistries, allowing directional immobilization of recombinant adhesins on polymer scaffolds, and for assessment of the coupling efficiency of the resulting &#8220;bacteriomimetic&#8221; materials are also discussed. We further describe how these materials can be used as a tool to inhibit pathogen mediated cytotoxicity and discuss scope, limitations and further applications of this approach in studying bacterial - host interactions.

Bacterial attachment to host cells is a key step during host colonization and infection. This protocol describes the generation of polymer-coupled recombinant adhesins as biomimetic materials which allow analysis of the contribution of individual adhesins to these processes, independent of other bacterial factors.

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Bacterial attachment to host cells is one of the earliest events during bacterial colonization of host tissues and thus a key step during infection. The ...

Immunologia e infezioni

Qualitative and Quantitative Assays for Detection and Characterization of Protein Antimicrobials

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods to screen for target enzymes prior to investing greater research effort and resources. The goal of this protocol is to demonstrate two complementary assays for conducting these initial evaluations. The microslide diffusion assay provides an initial or simple detection screen to enable the qualitative and rapid assessment of proteolytic activity against an array of both viable and heat-killed bacterial target substrates. As a counterpart, the increased sensitivity and reproducibility of the dye-release assay provides a quantitative platform for evaluating and comparing environmental influences affecting the hydrolytic activity of protein antimicrobials. The ability to label specific heat-killed cell culture substrates with Remazol brilliant blue R dye expands this capability to tailor the dye-release assay to characterize enzymatic activity of interest.

Here, we present protocols to rapidly screen and characterize enzymes for antimicrobial activity. The microslide diffusion assay and the dye-release assay utilize target bacterial substrates for qualitative and quantitative enzymatic activity evaluation.

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine ​​antimicrobici

Initial evaluations of large microbial libraries for potential producers of novel antimicrobial proteins require both qualitative and quantitative methods ...

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority of laboratory work is conducted with planktonic cells. Here, we describe a peg plate biofilm assay as performed with Staphylococcus aureus. Bacterial biofilms are grown on pegs attached to a 96-well microtiter plate lid, washed through gentle submersion in buffer, and placed in a drug challenge plate. After subsequent incubation they are again washed and moved to a final recovery plate, in which the fluorescent dye resazurin serves as a viability indicator. This assay offers greatly increased ease-of-use, reliability, and reproducibility, as well as a wealth of data when conducted as a kinetic read. Moreover, this assay can be adapted to a medium-throughput drug screening approach by which an endpoint fluorescent readout is taken instead, offering a path for drug discovery efforts.

Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay

Most bacterial infections produce a biofilm. By virtue of their environment, biofilm associated bacteria are often phenotypically drug resistant. Novel antibacterial molecules that kill bacteria in biofilms are thus a high priority. We establish an assay to quickly screen for antimicrobial compounds that are effective at eradicating biofilms.

Targeting biofilm Associated<em&gt; Staphylococcus aureus</em&gt; Uso resazurina base Assay farmaco-sensibilità

Most pathogenic bacteria are able to form biofilms during infection, but due to the difficulty of manipulating and assessing biofilms, the vast majority ...

A Platform of Anti-biofilm Assays Suited to the Exploration of Natural Compound Libraries

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of antibiotic-tolerant infections. Biofilms have displayed an exceptionally high tolerance for chemotherapy, which is thought to be multifactorial. For instance, the matrix provides a physical barrier that decreases the penetration of antibiotics into the biofilm. Also, cells within the biofilms are phenotypically diverse. Likely, biofilm resilience arises from a combination of these and other, yet unknown, mechanisms. All of the currently existing antibiotics have been developed against single-cells (planktonic) bacteria. Therefore, so far, a very limited repertoire of molecules exists that can selectively act on mature biofilms. This situation has driven a progressive paradigm shift in drug discovery, in which searching for anti-biofilms has been urged to occupy a more prominent place. An additional challenge is that there are a very limited number of standardized methods for biofilm research, especially those that can be used for large-throughput screening of chemical libraries. Here, an experimental anti-biofilm platform for chemical screening is presented. It uses three assays to measure biofilm viability (with resazurin staining), total biomass (with crystal violet staining), and biofilm matrix (using a wheat germ agglutinin, WGA-fluorescence-based staining of the poly-N-acetyl-glucosamine, PNAG, fraction). All the assays were developed using Staphylococcus aureus as the model bacteria. Examples of how the platform can be used for primary screening as well as for functional characterization of identified anti-biofilm hits are presented. This experimental sequence further allows for the classification of the hits based upon the measured end-points. It also provides information on their mode of action, especially on long-term versus short-term chemotherapeutic effects. Thus, it is very advantageous for the quick identification of high-quality hit compounds that can serve as starting points for various biomedical applications.

Biofilm infections show high tolerance towards chemotherapy. No single assay captures the complexity of biofilms. Instead, complementary assays are needed. We present a screening platform (developed for S. aureus) that combines assays for viability, biomass, and biofilm matrix. It allows anti-biofilm drug discovery, including the assessment of long-term chemotherapeutic effects.

Una piattaforma di test anti-biofilm Adatto per l&#39;esplorazione del Biblioteche composto naturale

Biofilms are regarded as one of the most challenging topics of modern biomedicine, and they are potentially responsible for over 80% of ...

Synthesis of Multi-walled Carbon Nanotubes Modified with Silver Nanoparticles and Evaluation of Their Antibacterial Activities and Cytotoxic Properties

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver MWCNTs were prepared by the reductive deposition of silver from an aqueous solution of AgNO3 on the oxidized MWCNTs. Given the unique color of the CNTs, it was not possible to apply them to the minimum inhibitory concentration or mitochondrial toxicity assays to evaluate the toxicity and antibacterial properties, since they would interfere with the assays. The inhibition zone and minimum bactericidal concentration for the Ag-MWCNTs were measured and Live/Dead and Trypan Blue assays were used to measure the toxicity and antibacterial properties without interfering with the color of the CNTs.

In this study, antimicrobial nanomaterials were synthesized by acidic oxidation of multiwalled carbon nanotubes and subsequent reductive deposition of silver nanoparticles. Antimicrobial activity and cytotoxicity tests were performed with the as-prepared nanomaterials.

Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

In this study, multi-walled carbon nanotubes (MWCNTs) were treated with an aqueous sulfuric acid solution to form an oxygen-based functional group. Silver ...

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been explored previously in clinical and environmental settings and in consumable food products. However, a lack of consistency in the experimental methods and materials used has culminated in conflicting results, even amongst studies of the same nanostructure types and bacterial species. For researchers who wish to employ nanostructures as an additive or coating in a product design, these conflicting data limit their utilization in clinical settings. 
To confront this dilemma, in this article, we present four different methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, and discuss their applicability in different scenarios. Adapting consistent methods is expected to lead to reproducible data that can be compared across studies and implemented for different nanostructure types and microbial species. We introduce two methods to determine the antimicrobial activities of nanoparticles and two methods for the antimicrobial activities of nanostructured surfaces. 
For nanoparticles, the direct co-culture method can be used to determine the minimum inhibitory and minimum bactericidal concentrations of nanoparticles, and the direct exposure culture method can be used to assess real-time bacteriostatic versus bactericidal activity resulting from nanoparticle exposure. For nanostructured surfaces, the direct culture method is used to determine the viability of bacteria indirectly and directly in contact with nanostructured surfaces, and the focused-contact exposure method is used to examine antimicrobial activity on a specific area of a nanostructured surface. We discuss key experimental variables to consider for in vitro study design when determining the antimicrobial properties of nanoparticles and nanostructured surfaces. All these methods are relatively low cost, employ techniques that are relatively easy to master and repeatable for consistency, and are applicable to a broad range of nanostructure types and microbial species.

Evaluation of Antimicrobial Activities of Nanoparticles and Nanostructured Surfaces In Vitro

We introduce four methods to evaluate the antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces using in vitro techniques. These methods can be adapted to study the interactions of different nanoparticles and nanostructured surfaces with a broad range of microbial species.

Valutazione delle attività antimicrobiche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate in vitro

The antimicrobial activities of nanoparticles and nanostructured surfaces, such as silver, zinc oxide, titanium dioxide, and magnesium oxide, have been ...

Generation of Greater Bacterial Biofilm Biomass using PCR-Plate Deep Well Microplate Devices

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are frequently used to cultivate bacterial biofilms for rapid antimicrobial susceptibility testing to calculate minimal biofilm eradication concentration (MBEC) values. Standard biofilm devices consist of polystyrene pegged-lids fitted to 96-well microplates and are ideal for measuring biofilm biomass and MBEC values, but these devices are limited by available peg surface area for biomass accumulation and cost. Here, we outline a protocol to use self-assembled polypropylene 96-well deep well PCR-plate pegged-lid device to grow Escherichia coli BW25113 and Pseudomonas aeruginosa PAO1 biofilms. A comparison of 24-hour biofilms formed on standard and deep well devices by each species using crystal violet biomass staining and MBEC determination assays are described. The larger surface area of deep well devices expectedly increased overall biofilm formation by both species 2-4-fold. P. aeruginosa formed significantly greater biomass/mm2 on deep well pegs as compared to the standard device. E. coli had greater biomass/mm2 on standard polystyrene devices as compared the deep well device. Biofilm eradication assays with disinfectants such as sodium hypochlorite (bleach) or benzalkonium chloride (BZK) showed that both compounds could eliminate E. coli and P. aeruginosa biofilms from both devices but at different MBEC values. BZK biofilm eradication resulted in variable E. coli MBEC values between devices, however, bleach demonstrated reproducible MBEC values for both species and devices. This study provides a high throughput deep well method for growing larger quantities of biofilms on polypropylene devices for downstream studies requiring higher amounts of static biofilm.

This protocol presents methodology to perform biofilm growth and biomass measurements using self-assembled deep well PCR-plate devices for high-throughput 96-well pegged lid static biofilm screening.

Generazione di biomassa di biofilm batterico maggiore utilizzando dispositivi a micropiastra profonda a piastra PCR

Bacterial biofilms are difficult to eradicate from surfaces using conventional antimicrobial interventions. High-throughput 96-well microplate methods are ...

<meta charset="utf8"></head><body>Nanocompositi antibatterici di ossido di grafene/rame per batteri resistenti

Fabrication of Antibacterial Graphene Oxide/Copper Nanocomposites

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to antibiotics. Developing&#160;antimicrobial agents that can replace existing antibiotics is essential because antibiotic-resistant bacteria have resistance mechanisms for all current antibiotics and can promote nosocomial infections. To address this challenge, in this study, we propose graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as antibacterial materials that can replace the existing antibiotics. GO/Cu nanocomposites are characterized by transmission electron microscopy and scanning electron microscopy. They show that copper (Cu) nanoparticles are well-grown on the graphene oxide sheets. Additionally, a microdilution broth method is used to confirm the efficacy of the antimicrobial substance against methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa), which are frequently implicated in nosocomial infections. Specifically, 99.8% of MRSA and 84.7% of P. aeruginosa are eliminated by 500 &#181;g/mL of GO/Cu nanocomposites. Metal nanocomposites can eradicate antibiotic-resistant bacteria by releasing ions, forming reactive oxygen species, and physically damaging the bacteria. This study demonstrates the potential of antibacterial GO/Cu nanocomposites in eradicating antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Nanocompositi metallici per eliminare i batteri resistenti agli antibiotici

Herein, we introduce graphene oxide/copper (GO/Cu) nanocomposites as an antibacterial nanomaterial. The antibacterial effectiveness of the GO/Cu nanocomposites was evaluated against both antibiotic-resistant gram-positive and gram-negative bacteria.

Fabbricazione di nanocompositi antibatterici di ossido di grafene/rame

Antibiotics are currently the most used antibacterial treatment for killing bacteria. However, bacteria develop resistance when continually overexposed to ...

<meta charset="utf8"></head><body> Sintesi di nanoparticelle di ossido di zinco e analisi dei suoi effetti antibatterici

Preparation of Zinc Oxide Nanoparticles and the Evaluation of their Antibacterial Effects

Nosocomial bacterial infections have become increasingly challenging due to their inherent resistance to antibiotics. The emergence of multidrug-resistant bacterial strains in hospitals has been attributed to the extensive and varied use of antibiotics, further exacerbating the problem of antibiotic resistance. Metal nanomaterials have been widely studied as an alternative solution for eradicating antibiotic-resistant bacterial cells. Metallic nanoparticles attack bacterial cells through various mechanisms, such as the release of antibacterial ions, generation of reactive oxygen species, or physical disruption, against which bacteria cannot develop resistance. Among the actively researched antimicrobial metal nanoparticles, zinc oxide nanoparticles, which are FDA-approved, are known for their biocompatibility and antibacterial properties. In this study, we focused on successfully developing a precipitation method for synthesizing zinc oxide nanoparticles, analyzing the properties of these nanoparticles, and conducting antimicrobial tests. Zinc oxide nanoparticles were characterized using transmission electron microscopy (TEM), dynamic light scattering (DLS), ultraviolet/visible spectroscopy, and X-ray diffraction (XRD). Antibacterial tests were conducted using the broth microdilution test with the multidrug-resistant strains of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa. This study demonstrated the potential of zinc oxide nanoparticles in inhibiting the proliferation of antibiotic-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Autore in primo piano: Esplorare gli effetti antibatterici delle nanoparticelle di ossido di zinco nel superamento della resistenza agli antibiotici

In this study, zinc oxide nanoparticles were synthesized using a precipitation method. The antibacterial effect of the synthesized particles was tested against multidrug-resistant methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Pseudomonas aeruginosa bacterial strains.

Preparazione di nanoparticelle di ossido di zinco e valutazione dei loro effetti antibatterici

Nosocomial bacterial infections have become increasingly challenging due to their inherent resistance to antibiotics. The emergence of multidrug-resistant ...

Antimicrobica caratterizzazione di materiali avanzati per applicazioni di Bioingegneria

Riepilogo

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Capitoli in questo video

High-throughput identificazione di batteri Polimeri repellente per dispositivi medici

I materiali biomimetici per caratterizzare le interazioni batteri-ospite

Saggi qualitativi e quantitativi per il rilevamento e la caratterizzazione di proteine antimicrobici

Targeting biofilm Associated

Una piattaforma di test anti-biofilm Adatto per l'esplorazione del Biblioteche composto naturale

Sintesi di nanotubi di carbonio Multi-parete modificati con nanoparticelle di argento e valutazione dell'attività antibatterica e proprietà citotossiche

Valutazione delle attività antimicrobiche di nanoparticelle e superfici nanostrutturate in vitro

Generazione di biomassa di biofilm batterico maggiore utilizzando dispositivi a micropiastra profonda a piastra PCR

Fabbricazione di nanocompositi antibatterici di ossido di grafene/rame

Preparazione di nanoparticelle di ossido di zinco e valutazione dei loro effetti antibatterici

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