Le procedure seguenti sono state approvate dal comitato di etica animale presso l'Università di Monash. Topi C57Bl6/J P3-6 neonato in buona salute non trattati sono stati utilizzati per generare i risultati rappresentativi.
1. enzimatica digestione
Nota: È importante considerare la sterilità quando isolamento e coltura di cellule primarie. Garantendo nel contempo che l'ambiente è come sterile come possibile, la dissezione iniziale e la raccolta del cervello murino può essere completati di fuori di una cappa a flusso laminare, con tutti i successivi passaggi eseguiti all'interno di una cappa a flusso laminare.
<ol><li>Utilizzando strumenti sterili, eutanasia il mouse di dislocazione cervicale, decapitare l'animale e risciacquare con etanolo al 100%. Utilizzando piccole forbici sterili, fare piccole incisioni lungo i lati destro e sinistro della testa. A questa età, la pelle si stacca facilmente. Usando le punte della pinzetta, far scorrere delicatamente il tessuto verso il rostro per esporre il cranio, compreso il Bregma.</li>
	<li>Inserire la punta delle forbici nell'apertura del canale spinale e fare un'incisione laterale per il canale uditivo. Fare un'incisione lungo la sutura sagittale di Bregma, puntando delicatamente la punta delle forbici verso l'alto per evitare di danneggiare il cervello. Inserire la punta delle forbici al Bregma e fare incisioni laterali ai lati destro e sinistro della testa lungo la sutura coronale.</li>
	<li>Usando il forcipe, togliere delicatamente il cranio per esporre il cervello. A tale scopo, afferrare i bordi del cranio esposti dall'incisione laterale e tirare delicatamente il cranio al lato. Il cranio deve staccarsi facilmente. Usando il forcipe curvo, delicatamente scoop sotto il cervello per rimuoverlo.</li>
	<li>Mettere il cervello in un contenitore sterile 5 mL, lavare 2 - 3 volte con wash ghiacciata media (di glucosio basso Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) completati con 1% di penicillina-streptomicina), diluitore da circa 5 mL per lavaggio, per rimuovere il sangue.</li>
	<li>In un cappuccio di flusso d'aria laminare, inserire il contenuto del contenitore da 5 mL in un piccolo piatto di petri (35 mm), che riposa sul ghiaccio. Usando un bisturi sterile o forbici sterili, rimuovere il cervelletto e bulbo olfattivo. Fare un midline taglio per separare i due emisferi.</li>
	<li>Con attenzione togliere lo strato meningeo con una pinzetta, facendo attenzione a non per danneggiare le cortecce. Identificare il livello meningeo come uno strato molto sottile di cellule con una tinta rossa sulla superficie del cervello, con visibili i vasi sanguigni. Mantenere il cervello freddo è essenziale per rimozione corretta meningi. Se si rompe lo strato meningeo, continuare staccando i frammenti strappati fino a quando viene completamente rimosso.</li>
	<li>Trasferire gli emisferi un nuovo piccolo piatto di petri (su ghiaccio) e riempirlo con lavaggio media. Tritare il cervello in piccoli pezzi con lama bisturi sterile/forbici. Nota: Dovrebbe trattarsi di ~ 1 mm2 dimensioni e dovrebbe prestare attenzione a non tagliarle in pezzi troppo piccoli, in quanto ciò potrebbe ridurre il rendimento.</li>
	<li>Aggiungere 100 µ l papaina (stock 17 U/mg) e 150 µ l della dnasi I in media ed incubare per 30 min a 37 ° C</li>
	<li>A seguito di digestione, triturare tessuto utilizzando una pipetta P1000. Se pezzi di tessuto sono troppo grandi per penetrare la pipetta, considerare l'utilizzo di una coppia o forbici sterili per allargare la punta della pipetta. Durante questo processo, fare attenzione a non introdurre bolle in media, in quanto ciò potrebbe ridurre la vitalità cellulare.</li>
</ol>2. mielina rimozione detriti
<ol><li>Sotto cappa a flusso laminare utilizzare attrezzature sterili, preparare una provetta conica da 50 mL con un colino di cella µm 100, per ogni cervello. Versare il contenuto del piatto petri, contenente i pezzi di medie e cervello di digest su un colino. Far passare i pezzi di cervello utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da 3 mL in un movimento di rettifica, finché non ci sarà nessun tessuto più visibile. A seguito di digestione, il tessuto cerebrale dovrebbe cadere a pezzi facilmente.</li>
	<li>Continuamente lavare il filtro con i media di lavaggio, di rabbocco del filtro cella in tutto questo processo. Questo si laverà attraverso qualsiasi cellule intrappolate nel colino. Nota: Questo dovrebbe essere fatto fino a quando c'è di circa ~ 15 mL nel tubo. Questo è per assicurare che il filtro è sufficientemente lavato attraverso e per massimizzare la quantità di cellule raccolte.</li>
	<li>
Centrifugare la sospensione unicellulare a 500 x g per 5 min a 4 ° C. Durante questo tempo, preparare il mezzo del gradiente di densità come descritto.
	<ol>
<li>Preparare il magazzino percoll isotonico (SIP), che è il mezzo di gradienti di densità utilizzato. Fare questo con l'aggiunta di 9:1 rapporto di medio gradiente di densità a 10x sterile Hanks soluzione salina bilanciata (HBSS).</li>
		<li>Preparare le sfumature come 30% SIP in DMEM e 70% SIP in 1 x HBSS. Ad esempio, per preparare 10 mL di 30% SIP, aggiungere 3 mL di SIP a 7 mL DMEM.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aspirare il supernatante dal provette coniche e risospendere il pellet cellulare con 8 mL di 30% SIP in DMEM. Trasferire il volume completo a un tubo conico di fresco 15ml.</li>
	<li>Alla base della soluzione SIP di 70%. A tale scopo, è possibile riempire una pipetta di trasferimento con 70% SIP e attentamente spingere attraverso la pipetta di trasferimento al fondo del tubo conico. Una volta che la punta è vicino al fondo, spingere delicatamente attraverso il contenuto della pipetta di trasferimento. Nota: Eseguire questa operazione lentamente per non disturbare l'interfaccia 30/70. Ci deve essere una chiara linea che separa i due strati.</li>
	<li>Centrifugare gli strati SIP, comprese le cellule, a 650 x g con freno 0 e 4, l'accelerazione per 25 min a temperatura ambiente. Nota: È essenziale per completare la rotazione con freno disinserito e consentire la centrifuga a venire lentamente una battuta d'arresto, come applicazione del freno perturbare l'interfase e ridurre drasticamente il prelievo di cellule tra gli strati SIP.</li>
	<li>Aspirare i detriti cellulari nella parte superiore del tubo e rimuovere circa 4 mL media dall'alto. Ciò faciliterà la rimozione delle cellule mononucleari nel passaggio seguente. Utilizzando una pipetta P1000, abbassare con cautela la punta della pipetta verso l'interfase. Isolare le cellule mononucleate dall'interfaccia di medio gradiente di densità di 30/70. Raccogliere circa 3 mL dall'interfaccia nuvoloso e trasferimento ad un nuovo tubo conico da 15 mL. In seguito, stemperate il composto con 9 mL di HBSS per facilitare la rimozione del mezzo di gradienti di densità.</li>
	<li>Centrifugare il interphase medio gradiente di densità diluito, contenente le cellule mononucleari a 500 x g per 5 min. aspirare il supernatante e risospendere con 1 mL di terreno di crescita (DMEM completati con 10% fetale bovino del siero e l'1% antibiotici). In seguito, macchia le cellule sedimento con trypan blue ed eseguire un conteggio delle cellule usando un emocitometro.</li>
</ol>3. ordinamento delle cellule attivate magnetica
Nota: Questi passaggi vengono modificati dal protocollo di costruttori.
<ol><li>Centrifugare le cellule mononucleari raccolte a 300 x g per 10 min a 4 ° C per rimuovere il mezzo di crescita, in quanto ciò interferirà con l'isolamento magnetico. Utilizzando lo stesso conteggio di cellule ottenuto da passo 2.8, risospendere a 1 x 108 nucleate cellule/mL in PBS (Ca+ + e Mg ++ libero) contenenti 2% FBS e 1 mM EDTA, all'interno di un intervallo di volume di 0,1-2,5 mL.</li>
	<li>Aggiungere il volume completo di cellule nucleate in PBS dal passaggio precedente in una provetta di polistirene fondo tondo fresco 5 mL (12 x 75 mm). Aggiungere 50 µ l di reagente etichettatura CD11b PE per 1 mL di campione. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce.</li>
	<li>Aggiungere 70 µ l di selezione cocktail (una combinazione di anticorpi monoclonali contro CD11b in PBS) per 1 mL di campione. Incubare a temperatura ambiente per 15 minuti al riparo dalla luce.</li>
	<li>Mescolare particelle magnetiche pipettando su e giù più di 5 volte. Aggiungere 50 µ l/mL al campione. Incubare a temperatura ambiente per 10 min al riparo dalla luce. Nota: Queste particelle quindi formano un complesso tetramerica con gli anticorpi e saranno ottenere collegate alla colonna magnetica.</li>
	<li>Se il volume totale della miscela delle cellule è inferiore a 2,5 mL, alto fino a questo volume con PBS (Ca+ + e Mg ++ libero) contenenti 2% FBS e 1 mM EDTA e Miscelare pipettando delicatamente 2 - 3 volte. Inserire il tubo (senza coperchio) il magnete e incubare a temperatura ambiente per 5 min.</li>
	<li>In un movimento continuo, completamente invertire il magnete contenente il tubo per 2-3 s, versando il sovranatante. Restituire il magnete in posizione verticale e rimuovere il tubo dal magnete. Preparare per lavare le cellule restanti fuori dalla colonna. Nota: Il surnatante contiene cellule non etichettate e indesiderate, che vengono rimossi capovolgendo la provetta mentre ancora nel magnete. Il tubo contiene l'allegato Cd11b+ cellule.</li>
	<li>Lavare le cellule ripetendo i punti 3.5 e 3.6 di altre due volte. Se il campione è maggiore di 1 mL, è consigliato un ulteriore ripetizione di passaggi 3.5 e 3.6.</li>
	<li>Risospendere le cellule in un mezzo di crescita desiderata. Sciacquare il fianco della nave collezione pure (ad es. un tubo da 15 mL) per raccogliere le cellule dai lati del tubo e massimizzare i rendimenti.</li>
</ol>4. Verifica della purezza di Microglia
Nota: La microglia primaria isolata da 3 L (n = 5 animali totali) sono stati verificati tramite cella attivata fluorescente ordinano (FACS) per determinare la purezza per i risultati rappresentativi.
<ol><li>Cellule di coltura in una beuta, T-25 nel terreno di coltura contenente 10% FBS durante la notte, semina ad una densità di 1-2 x 106 cellule per fiaschetta.</li>
	<li>Lavare le cellule in beute T-25 con PBS 3 x per 5 min rimuovere eventuali restanti supporti di crescita che potrebbero interferire con il trypsinization.</li>
	<li>Aggiungere 2 mL di tripsina 0,25% per staccare le cellule dai palloni. Assicurarsi che il volume della tripsina sia sufficiente a coprire l'intera superficie del pallone. In seguito agitando delicatamente del pallone per garantire una copertura uniforme di tripsina, incubare per 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Placare il processo di trypsinization con l'aggiunta di 2 mL di coltura contenente 10% FBS nel pallone.</li>
	<li>Raccogliere il surnatante contenente cellule tripsinizzate e centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C per raccogliere le cellule.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante contenente il terreno di coltura e la tripsina e risospendere il pellet in 500 μL FACS tampone. Eseguire il conteggio delle cellule usando del blu di trypan.</li>
	<li>Centrifugare a 500 g per 5 min a 4 ° C. Eseguire il blocco del recettore Fc aggiungendo 50 μL FACS buffer + blocco FcR 1 μL a 5 x 106 cellule. Incubare per 15 min a 4 ° C. Nota: Il blocco del recettore Fc è un passaggio fondamentale nella procedura di colorazione per impedire il legame non specifico delle immunoglobuline ai recettori Fc nelle popolazioni delle cellule immuni. Questo blocco non influisce l'associazione a valle di altri anticorpi.</li>
	<li>Termina il processo bloccante diluendo con buffer di FACS 500 μL. In seguito, centrifugare la miscela che contiene le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere in fresco 500 μL FACS tampone.</li>
	<li>Inserire la maggior parte delle cellule (per esempio se risospendere le cellule in 500 μL di tampone di FACS, uso 400 μL) in una provetta. Distribuire le celle rimanenti tra i tubi di controllo e fino a 100 µ l per provetta di controllo in cima (ad es. per 6 provette di controllo, messo 16.67 μL in ogni provetta di controllo e superiore con buffer di FACS 83.33 μL). Rendere i gruppi (controllo tubi in grassetto) come Immacolata, single macchiato (CD45, CD11b), singolo live/dead macchia, protocolli e provette.</li>
	<li>Appallottolare le celle in tutte le provette mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Macchia le cellule nel tubo con 1 anticorpo μL a 100 μL FACS di tampone per 5 x 106 cellule. Incubare per 20 min a 4 ° C. Nota: Utilizzare 50 μL anticorpo cocktail se meno di 2 x 106 cellule vengono utilizzate.</li>
	<li>Lavare le cellule con buffer di FACS 500 μL. Centrifugare le cellule a 500 x g per 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>Risospendere le cellule in buffer di FACS 300 μL. Nota: Utilizzare ~ 100 μl se il conteggio delle cellule è minore di 2 x 106.</li>
	<li>Utilizzando l'analisi di citometria a flusso, quantificare le cellule che sono CD45basso e positivo per la macchiatura di CD11b. Questa percentuale corrisponde alla microglia primaria isolata.</li>
</ol>5. la macchiatura di Immunohistochemical di Microglia primaria
<ol><li>Le cellule in una piastra a 96 pozzetti ad una densità di 1 x 105 celle del piatto con il mezzo di crescita e incubare per una notte.</li>
	<li>Eliminare il surnatante e lavare 3 volte con PBS.</li>
	<li>Fissare le cellule con paraformaldeide al 4% in PBS per 15 min. Rimuovi il PFA con una pipetta P1000, quindi lavare 3 volte con PBS + 0.1% Triton-X.</li>
	<li>Blocco per legame non specifico con albumina di siero bovino di 3% per 1 h a temperatura ambiente.</li>
	<li>Incubare con coniglio Iba-1 (1: 100) per 24 h a 4 ° C. In seguito, è necessario rimuovere la miscela di anticorpo primario e lavare 3 volte con PBS.</li>
	<li>Incubare con secondario coniugato GFP anti-coniglio (1: 200) per 1 h a temperatura ambiente. In seguito, è necessario rimuovere la miscela di anticorpo secondario e lavare 3 volte con PBS.</li>
	<li>Montare diapositive con una fluorescente montaggio medio e catturare le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza.</li>
</ol>6. quantificazione delle Microglia utilizzando il pHrodo Assay
Nota: Il dosaggio di pHrodo consente per l'identificazione dei livelli di fagocitosi in cellule coltivate. Al momento l'assorbimento tramite endocitosi, internalizzazione nell'ambiente più acido aumenta i livelli di fluorescenza dei coniugati bioparticle. Livelli di fluorescenza possono quindi essere quantificati da FACS. I passaggi seguenti vengono modificati dal protocollo di costruttori.
<ol><li>Cultura le cellule in una beuta, T-25 in medium della crescita durante la notte, semina ad una densità di 1-2 x 106 cellule per fiaschetta. Lavare le cellule in boccette di T-25 con PBS 3 volte per 5 min.</li>
	<li>Staccare le cellule usando tripsina di 0,25% di 2 mL. Incubare per 5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Placare il processo tripsinizzazione aggiungendo 2 mL di coltura contenente 10% FBS nel pallone.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 500 x g per 5 min a 4 ° C per agglomerare le cellule.</li>
	<li>Rimuovere il supernatante e risospendere il pellet contenente la microglia primaria nel terreno di coltura a 106 cellule/mL. Nota: In alternativa, piastra di celle in una piastra a 96 pozzetti con almeno un giorno prima e mirare 1x105 cellule vitali per pozzetto il giorno il test deve essere eseguito.</li>
	<li>Celle di piastra in piastra a 96 pozzetti a 1 x 105 cellule/pozzetto, 100 μL per pozzetto. Piastra controlli e pozzi sperimentali in triplice copia e lasciare un pozzetto vuoto al controllo positivo per una sottrazione di sfondo del controllo no-cella.</li>
	<li>Aggiungere 100 μL di crescita media dei pozzetti lasciati vuoti per sottrazione sfondo no-cella. Nota: Come qualsiasi altro in vitro test, controlli appropriati sono vitali per la precisione delle letture. A fianco la no-cella controllo (lettura di base), includono anche il controllo negativo ben (coniugato pHrodo aggiunto, ma posti su ghiaccio).</li>
	<li>Coprire la piastra e incubare per 1 h in un'incubatrice con 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Preparare pozzi sperimentali aggiungendo stimolante e trattamento. Aggiungere comandi del veicolo (solo per i mezzi di sviluppo) a pozzetti non trattati. Nota: Lipopolysaccharide 1 µ g/mL [stimolante] e delle cellule epiteliali umane Amnios (hAEC)-media condizionati [trattamento] sono stati usati per generare i risultati rappresentativi.</li>
	<li>Scongelare una fiala di colorante coniugati, aggiungere vortice e brevemente 2 mL di tampone per l'assorbimento. Trasferire il contenuto del tubo in un tubo di vetro pulito e Sonicare per 5 min, per garantire che le particelle sono disperse uniformemente.</li>
	<li>Aspirare il terreno di coltura da pozzi di micropiastre e sostituire rapidamente con 100 μL della sospensione di tintura. Coprire e incubare a 37 ° C per 1 h. Nota: Ricordarsi di macchiare i tubi di controllo pure.</li>
	<li>Utilizzando l'analisi di citometria a flusso, quantificare cellule macchiatura positiva per le perle di coniugati pHrodo e presentare come una percentuale (del genitore) di attivamente phagocytosing microglia.</li>
</ol>7. quantificazione di Microglia apoptosi dopo insulto infiammatorio
<ol><li>Ripetere i passaggi 1-7 nella sezione "Verifica della purezza di microglia".</li>
	<li>Inserire la maggior parte delle cellule (per esempio se risospese le cellule in 500 μL di tampone di FACS, uso 400 μL) in una provetta. Distribuire le celle rimanenti tra i tubi di controllo e top fino a 100 µ l per provetta di controllo (ad es. per provette di controllo 6, messo 16.67 μL in ogni provetta di controllo e superiore con buffer di FACS 83.33 μL). Gruppi (controllo tubi in grassetto): non macchiate, singole macchie (AnnexinV, ioduro di propidio), singolo live/dead mordente, protocolli, provette.</li>
	<li>Appallottolare le celle in tutte le provette mediante centrifugazione a 500 x g per 5 min.</li>
	<li>Incubare con 1 μL anticorpo/100 μL FACS buffer/5 x 106 cellule per 20 min a 4 ° C. Nota: Utilizzare 50 μL se meno di 2 x 106 cellule.</li>
	<li>Lavare le cellule con l'aggiunta di 500 μL FACS buffer e centrifugare a 500 g per 5 min.</li>
	<li>Risospendere il pellet cellulare nel buffer di FACS 300 μL. Nota: ~ 100 μL se il conteggio delle cellule è minore di 2 x 106.</li>
	<li>Quantificare le celle all'interno di ogni quadrante (Q1: necrotico, Q2: tardo apoptotico, Q3: vitali, Q4: apoptotica precoce).</li>
</ol>

<ol>
	<li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances+(Report).">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances (Report).</a> Lancet Neurology. 8 (1), 110 (2009).</li><li>Saliba, E., Henrot, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammatory+Mediators+and+Neonatal+Brain+Damage.">Inflammatory Mediators and Neonatal Brain Damage.</a> Biology of the Neonate. 79 (3-4), 224-227 (2001).</li><li>Uwe-Karsten, H., Helmut, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia:+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain.">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nature Neuroscience. 10 (11), 1387 (2007).</li><li>Cherry, J. D., Olschowka, J. A., O'Banion, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroinflammation+and+M2+microglia:+the+good,+the+bad,+and+the+inflamed.">Neuroinflammation and M2 microglia: the good, the bad, and the inflamed.</a> Journal of neuroinflammation. 11, 98 (2014).</li><li>Michell-Robinson, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+microglia+in+brain+development,+tissue+maintenance+and+repair.">Roles of microglia in brain development, tissue maintenance and repair.</a> Brain. 138 (5), 1138-1159 (2015).</li><li>Guohua, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophage+polarization+dynamics+in+white+matter+after+traumatic+brain+injury.">Microglia/macrophage polarization dynamics in white matter after traumatic brain injury.</a> Journal of Cerebral Blood Flow &amp; Metabolism. 33 (12), 1864 (2013).</li><li>Neumann, H., Kotter, M. R., Franklin, R. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Debris+clearance+by+microglia:+an+essential+link+between+degeneration+and+regeneration.">Debris clearance by microglia: an essential link between degeneration and regeneration.</a> Brain. 132 (2), 288-295 (2009).</li><li>Veronique, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=M2+microglia+and+macrophages+drive+oligodendrocyte+differentiation+during+CNS+remyelination.">M2 microglia and macrophages drive oligodendrocyte differentiation during CNS remyelination.</a> Nature Neuroscience. 16 (9), 1211 (2013).</li><li>Hu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia/macrophage+polarization+dynamics+reveal+novel+mechanism+of+injury+expansion+after+focal+cerebral+ischemia.">Microglia/macrophage polarization dynamics reveal novel mechanism of injury expansion after focal cerebral ischemia.</a> Stroke. 43 (11), 3063 (2012).</li><li>Kigerl, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+distinct+macrophage+subsets+with+divergent+effects+causing+either+neurotoxicity+or+regeneration+in+the+injured+mouse+spinal+cord.">Identification of two distinct macrophage subsets with divergent effects causing either neurotoxicity or regeneration in the injured mouse spinal cord.</a> The Journal of Neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29 (43), 13435 (2009).</li><li>Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+&#945;7+nicotinic+acetylcholine+receptors+drive+a+phospholipase+C/IP3+pathway+and+modulate+the+cell+activation+toward+a+neuroprotective+role.">Microglial &#945;7 nicotinic acetylcholine receptors drive a phospholipase C/IP3 pathway and modulate the cell activation toward a neuroprotective role.</a> Journal of neuroscience research. 83, (2006).</li><li>Bedi, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+multipotent+adult+progenitor+cell+therapy+attenuates+activated+microglial/macrophage+response+and+improves+spatial+learning+after+traumatic+brain+injury.">Intravenous multipotent adult progenitor cell therapy attenuates activated microglial/macrophage response and improves spatial learning after traumatic brain injury.</a> Stem cells translational medicine. 2, (2013).</li><li>Tran, T. A., McCoy, M. K., Sporn, M. B., Tansey, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+synthetic+triterpenoid+CDDO-methyl+ester+modulates+microglial+activities,+inhibits+TNF+production,+and+provides+dopaminergic+neuroprotection.">The synthetic triterpenoid CDDO-methyl ester modulates microglial activities, inhibits TNF production, and provides dopaminergic neuroprotection.</a> Journal of neuroinflammation. 5, 14 (2008).</li><li>Gr&#252;tzkau, A., Radbruch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+but+mighty:+How+the+MACS&#174;-technology+based+on+nanosized+superparamagnetic+particles+has+helped+to+analyze+the+immune+system+within+the+last+20+years.">Small but mighty: How the MACS&#174;-technology based on nanosized superparamagnetic particles has helped to analyze the immune system within the last 20 years.</a> Cytometry Part A. 77A (7), 643-647 (2010).</li><li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain.">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> Journal of Neuroinflammation. 9, 147-147 (2012).</li><li>Holt, L. M., Olsen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Applications+of+Magnetic+Cell+Sorting+to+Analyze+Cell-Type+Specific+Gene+and+Protein+Expression+in+the+Central+Nervous+System.">Novel Applications of Magnetic Cell Sorting to Analyze Cell-Type Specific Gene and Protein Expression in the Central Nervous System.</a> PLOS ONE. 11 (2), e0150290 (2016).</li><li>Leaw, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+amnion+epithelial+cells+rescue+cell+death+via+immunomodulation+of+microglia+in+a+mouse+model+of+perinatal+brain+injury.">Human amnion epithelial cells rescue cell death via immunomodulation of microglia in a mouse model of perinatal brain injury.</a> Stem cell research &amp; therapy. 8 (1), 46 (2017).</li><li>Moujalled, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TDP-43+mutations+causing+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+altered+expression+of+RNA-binding+protein+hnRNP+K+and+affect+the+Nrf2+antioxidant+pathway.">TDP-43 mutations causing amyotrophic lateral sclerosis are associated with altered expression of RNA-binding protein hnRNP K and affect the Nrf2 antioxidant pathway.</a> Human Molecular Genetics. 26 (9), 1732-1746 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

Microglia hanno la capacità di essere sia pro - e anti-infiammatori, alterato da stimoli di ambiente. Studi precedenti hanno dimostrato che la modulazione dell'attivazione di microglia può conferire neuroprotezione. Loro capacità di fornire protezione ai neuroni e riparare lesioni richiede ulteriori ricerche per favorire la comprensione corrente di queste cellule complesse. Così, l'isolamento di elevata purezza primaria microglia è una tecnica importante ed utile. Si tratta di un metodo relativamente rapido per otte...

Danni acquisiti durante il periodo perinatale da infiammazione, ipossia-ischemia ed emorragia possono avere una serie di conseguenze a lungo termine. La patofisiologia complessa di lesione cerebrale perinatale è teorizzata per coinvolgere l'infiammazione e ischemia con conseguente morte neuronale ed assonale1. La risposta immunitaria innata svolge un ruolo importante nella cascata di eventi che portano a lesioni2.
Microglia, le cellule immunitarie residente all'interno del sistema nervoso centrale (CNS), sono i primi soccorritori a lesioni3. Le microglia sono tipi di cella in plastica con la capacità di essere sia protettiva o tossiche, dipende l' ambiente4. Essi sono coinvolti nella chemiotassi, fagocitosi, presentazione dell'antigene e produzione di citochine e di specie reattive dell'ossigeno4,5. Senescenti microglia costantemente l'ambiente di indagine e vengono attivati dalla presenza di una sostanza straniera o nocivo4. Attivazione conduce ad una risposta pro-infiammatoria, critica in CNS protezione4. Queste microglia "pro-infiammatorie" fenotipo M1 sono principalmente coinvolti nella presentazione dell'antigene e la morte di agenti patogeni4. Nonostante il ruolo cruciale della risposta infiammatoria nella neuroprotezione, infiammazione incontrollata o prolungata può essere nocivo e portare a danno di un neurone4. Tuttavia, quando esposti a determinati stimoli ambientali, le microglia possono esibire un fenotipo anti-infiammatorio. Queste microglia M2 pro-riparativi hanno un ruolo critico nella guarigione delle ferite e la riparazione6, rilasciando una serie di citochine e altri mediatori solubili che downregulate l'infiammazione, aumentare la fagocitosi e promuovere la ripristino4, 7. i ruoli di microglia sono diversi e comprendono guida differenziazione del oligodendrocyte durante re-mielinizzazione8, proteggere i neuroni durante lo svuotamento di ossigeno e glucosio nel tratto modelli9 e promuovere neuriti in ferita del midollo spinale modelli10.
Lo studio di queste cellule gliale rappresenta un aspetto importante nel comprendere e manipolare la risposta al neuroinflammation. Il protocollo descritto consente ulteriore indagine il potenziale terapeutico della modulazione di microglia in malattie neuroinfiammatorie.
La modulazione dell'attivazione microglial verso un ruolo neuroprotettivo è stata osservata in una gamma di circostanze11,12,13. Così, migliorando la comprensione corrente e ulteriormente studiando la modulazione dell'attivazione microglial è critica, che richiedono l'uso di vari modelli tra cui sia in vitro che in vivo. Studi in vitro rappresentano uno strumento importante a causa della loro maggiore efficienza, basso costo e capacità di indagare su una popolazione di cellule isolate.
Ci sono una serie di protocolli descritti nella letteratura per l'isolamento di microglia dal cervello murino, la sfida di produrre in modo efficiente un campione ad alto rendimento con elevata purezza e buona redditività. Metodi comunemente usati di isolamento della microglia primaria sono separazione magnetica e scuotendo prolungata delle colture miste gliale. Attraverso l'esperienza personale, è stato trovato che c'era un alto grado di detriti cellulari che hanno ostruito la colonna magnetica. Così, è stato utilizzato il seguente protocollo, che incorpora un passo di centrifugazione su gradiente di densità iniziale seguito da separazione magnetica CD11b. Il protocollo descritto di seguito è stato ottimizzato per produrre un campione altamente puro in quantità sufficiente. È vantaggioso grazie alla sua elevata purezza e il breve periodo di tempo — uno può eseguire le analisi entro 2 giorni senza dover fare cultura per 2-3 settimane. Questo protocollo potenzialmente può essere adattato per l'isolamento di astrociti di murini.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="929">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DMEM, low glucose, pyruvate</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:344px;">11885084</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Antibiotic-Antimycotic (100X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15240062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">DNaseI grade II from bovine pancreas</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>10104159001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Papain from papaya latex, buffered aqeuous solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3125-100mg</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>16140071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Percoll</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-0891-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (1X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175-103</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Hank&#39;s Balanced Salt Solution (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14185052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Mouse CD11b Positive Selection Kit</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18770</td>
			<td>EasySep magnet variant</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep magnet</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>18000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">EasySep Buffer</td>
			<td>StemCell Technologies</td>
			<td>20144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Dulbecco&#39;s Phosphate buffered saline</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14040182</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Trypsin (2.5%) (10X)</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15090-046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block&#8482;)</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553141</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Falcon 5mL Round Bottom High Clarity PP Test Tube, with Snap Cap, Sterile</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">175cm&#178; Angled Neck Cell Culture Flask with Vent Cap</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Lipopolysaccharides from Escherichia coli O127:B8</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>L5024</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">96 Well TC-Treated Microplates size 96 wells, clear, polystyrene, round bottom</td>
			<td>Corning</td>
			<td>CLS3799</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Paraformaldehyde (powder, 95%)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Triton-X</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">Rabbit Anti-Iba1</td>
			<td>Wako</td>
			<td>01919741&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Goat Anti-Rabbit IgG H&#38;L (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab150077</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">FACS Antibodies</td>
			<td style="width:133px;">Company</td>
			<td style="width:344px;">Catalog Number</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">V450,Rat,Anti-Mouse,CD45,30-F11,RUO</td>
			<td style="width:133px;">BD Biosciences</td>
			<td>560501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">PerCP-Cy5.5 CD11b&#160;</td>
			<td>eBiosciences</td>
			<td>45-0112-82</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:285px;">ZombieNIR</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>423105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">pHrodo Red E. coli BioParticles Conjugate</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>P35361</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Annexin.V_FITC</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:285px;">Propodium Iodide solution</td>
			<td>Miltenyi Biotech</td>
			<td>130-093-233</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

characterization and isolation of mouse primary microglia by density gradient centrifugation

Microglia, le cellule immunitarie residente nel cervello, sono i primi soccorritori per infiammazione o lesioni nel sistema nervoso centrale. La ricerca recente ha rivelato microglia di essere dinamico, capace di assumere fenotipi sia pro-infiammatorie e anti-infiammatori. Sia M1 (pro-infiammatori) e M2 (pro-riparativa) fenotipi giocare un ruolo importante in condizioni neuroinfiammatorie come lesione cerebrale perinatale e mostre differenti funzioni in risposta a determinati stimoli ambientali. La modulazione dell'attivazione microglial è stata notata per conferire neuroprotezione suggerendo le microglia possono avere potenziale terapeutico nella ferita di cervello. Tuttavia, più ricerca è necessaria per comprendere meglio il ruolo della microglia nella malattia, e questo protocollo che facilita. Il protocollo descritto sotto combina un processo di centrifugazione su gradiente di densità per ridurre i detriti cellulari, con separazione magnetica, produrre un campione altamente puro di cellule microgliali primario che può essere utilizzato per la sperimentazione in vitro , senza la bisogno per 2-3 settimane di coltura. Inoltre, le operazioni di caratterizzazione resa solida funzionale dei dati sulla microglia, aiutando gli studi per migliorare la nostra comprensione della polarizzazione e l'innesco di queste cellule, che ha forti implicazioni nel campo della medicina rigenerativa.

Utilizzando i metodi descritti qui, puri popolazioni di microglia possono essere isolati e possono essere pronti per la caratterizzazione utilizzando in vitro e analisi al FACS. Per cominciare, fino a 18 animali possono essere utilizzati per abbattimento, con un rendimento atteso di circa 450.000-600.000 cellule microglial. È fondamentale per confermare la purezza delle cellule isolate, e per farlo in quanto l'analisi Citofluorimetrica è stata eseguita dalla macchiatura per due...

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Characterization and Isolation of Mouse Primary Microglia by Density Gradient Centrifugation

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

Microglia, the resident immune cells in the brain, are the first responders to inflammation or injury in the central nervous system. Recent research has ...

characterization-isolation-mouse-primary-microglia-density-gradient

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

19.1K Views.  Hudson Institute of Medical Research. Un protocollo per l'isolamento di microglia primaria dal cervello murino è presentato. Questa tecnica aiuta a promuovere la comprensione corrente di condizioni neurologiche. Centrifugazione in gradiente di densità e separazione magnetica sono combinati per produrre sufficiente resa di un campione altamente puro. Inoltre, abbiamo delineare i passaggi per la caratterizzazione di microglia.

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Preparation of Synaptoneurosomes from Mouse Cortex using a Discontinuous Percoll-Sucrose Density Gradient

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that break away from axon terminals when the cortical tissue is homogenized. The SNs retain pre- and postsynaptic characteristics, which makes them useful in the study of synaptic transmission. They retain the molecular machinery used in neuronal signaling and are capable of uptake, storage, and release of neurotransmitters.
The production and isolation of active SNs can be problematic using medias like Ficoll, which can be cytotoxic and require extended centrifugation due to high density, and filtration and centrifugation methods, which can result in low activity due to mechanical damage of the SNs. However, the use of discontinuous Percoll-sucrose density gradients to isolate SNs provides a rapid method to produce good yields of translationally active SNs. The Percoll-sucrose gradient method is quick and gentle as it employs isotonic conditions, has fewer and shorter centrifugation spins and avoids centrifugation steps that pellet SNs and cause mechanical damage.

A method to prepare translationally active, intact synaptoneurosomes (SNs) from mouse brain cortex is described. The method uses a discontinuous Percoll-sucrose density gradient allowing for the quick preparation of active SNs.

Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

Synaptoneurosomes (SNs) are obtained after homogenization and fractionation of mouse brain cortex. They are resealed vesicles or isolated terminals that ...

Ricerca

Neuroscienze

Preparation of Synaptic Plasma Membrane and Postsynaptic Density Proteins Using a Discontinuous Sucrose Gradient

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in the late 1960&#8217;s, proteins associated with the synaptic plasma membrane can be isolated by ultracentrifugation on a sucrose density gradient. Once synaptic membranes are isolated, the macromolecular complex known as the post-synaptic density can be subsequently isolated due to its detergent insolubility. The techniques used to isolate synaptic plasma membranes and post-synaptic density proteins remain essentially the same after 40 years, and are widely used in current neuroscience research. This article details the fractionation of proteins associated with the synaptic plasma membrane and post-synaptic density using a discontinuous sucrose gradient. Resulting protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

This article details the enrichment of proteins associated with the synaptic plasma membrane by ultracentrifugation on a discontinuous sucrose gradient. The subsequent preparation of post-synaptic density proteins is also described. Protein preparations are suitable for western blotting or 2D DIGE analysis.

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine ​​densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo

Neuronal subcellular fractionation techniques allow the quantification of proteins that are trafficked to and from the synapse. As originally described in ...

Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility in genetic and chemical manipulation of individual cells or defined networks. Such ease of manipulation is simpler in the reduced culture system when compared to the intact brain tissue. While many methods for the isolation and growth of these primary neurons exist, each has its own limitations. This protocol describes a method for culturing low-density and high-purity rodent embryonic hippocampal neurons on glass coverslips, which are then suspended over a monolayer of glial cells. This &#39;sandwich culture&#39; allows for exclusive long-term growth of a population of neurons while allowing for trophic support from the underlying glial monolayer. When neurons are of sufficient age or maturity level, the neuron coverslips can be flipped-out of the glial dish and used in imaging or functional assays. Neurons grown by this method typically survive for several weeks and develop extensive arbors, synaptic connections, and network properties.

This article describes the protocol for culturing low-density primary hippocampal neurons growing on glass coverslips inverted over a glial monolayer. The neuron and glial layers are separated by paraffin wax beads. The neurons grown by this method are suitable for high-resolution optical imaging and functional assays.

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

The ability to probe the structure and physiology of individual nerve cells in culture is crucial to the study of neurobiology, and allows for flexibility ...

Rapid and Refined CD11b Magnetic Isolation of Primary Microglia with Enhanced Purity and Versatility

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. Microglia are mesodermal cells that function similarly to macrophages in surveying inflammatory stress. The classical (M1-type) and alternative (M2-type) activations of macrophages have also been extended to microglia in an effort to better understand the underlying interplay these phenotypes have in neuroinflammatory conditions such as Parkinson&#39;s, Alzheimer&#39;s, and Huntington&#39;s Diseases. In vitro experimentation utilizing primary microglia offers rapid and reliable results that may be extended to the in vivo environment. Although this is a clear advantage over in vivo experimentation, isolating microglia while achieving adequate yields of optimal purity has been a challenge. Common methods currently in use either suffer from low recovery, low purity, or both. Herein, we demonstrate a refinement of the column-free CD11b magnetic separation method that achieves a high cell recovery and enhanced purity in half the amount of time. We propose this optimized method as a highly useful model of primary microglial isolation for the purposes of studying neuroinflammation and neurodegeneration.

Here, we present a protocol to isolate microglia from postnatal mouse pups (day 1) for in vitro experimentation. This improvised method of isolation generates both high yield and purity, a significant advantage over alternate methods that allows broad range experimentation for the purposes of elucidating microglial biology.

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Microglia are the primary responders to central nervous system insults; however, much remains unknown about their role in regulating neuroinflammation. ...

Isolation and RNA Extraction of Neurons, Macrophages and Microglia from Larval Zebrafish Brains

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is important to isolate these cells without changing their gene expression profile. The zebrafish model provides a large number of transgenic fish lines in which specific cell types are labelled; for example neurons in the NBT:DsRed line or macrophages/microglia in the mpeg1:eGFP line. Furthermore, antibodies have been developed to stain specific cells, such as microglia with the 4C4 antibody.
Here, we describe the isolation of neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains. Central to this protocol is the avoidance of an enzymatic tissue digestion at 37 &#176;C, which could modify cellular profiles. Instead a mechanical system of tissue homogenization at 4 &#176;C is used. This protocol entails homogenization of brains into cell suspension, their immuno-staining and the isolation of neurons, macrophages and microglia by FACS. Afterwards, we extracted RNA from those cells and evaluated their quality/quantity. We managed to obtain RNA of high quality (RNA Integrity Number (RIN) &#62; 7) to perform qPCR on macrophages/microglia and neurons, and transcriptomic analysis on microglia. This approach enables a better characterization of these cells, as well as a clearer understanding about their role in development and pathologies.

We present a protocol to isolate neurons, macrophages and microglia from larval zebrafish brains under physiological and pathological conditions. Upon isolation, RNA is extracted from these cells to analyze their gene expression profile. This protocol allows for the collection of high-quality RNA for performing downstream analysis like qPCR and transcriptomics.

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

To gain a detailed understanding of the role of different CNS cells during development or the establishment and progression of brain pathologies, it is ...

Rapid and Specific Immunomagnetic Isolation of Mouse Primary Oligodendrocytes

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of oligodendroglia as well as the biology of demyelinating diseases such as multiple sclerosis and Pelizaeus-Merzbacher-like disease (PMLD). Here, we present a simple and efficient selection method for the immunomagnetic isolation of stage three O4+ preoligodendrocytes cells from neonatal mice pups. Since immature OL constitute more than 80% of the rodent-brain white matter at postnatal day 7 (P7) this isolation method not only ensures high cellular yield, but also the specific isolation of OLs already committed to the oligodendroglial lineage, decreasing the possibility of isolating contaminating cells such as astrocytes and other cells from the mouse brain. This method is a modification of the techniques reported previously, and provides oligodendrocyte preparation purity above 80% in about 4 h.

We describe the immunomagnetic isolation of primary mouse oligodendrocytes, which allows the rapid and specific isolation of the cells for in vitro culture.

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

The efficient and robust isolation and culture of primary oligodendrocytes (OLs) is a valuable tool for the in vitro study of the development of ...

Magnetic Isolation of Microglial Cells from Neonate Mouse for Primary Cell Cultures

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. Microglia can adopt a large spectrum of activation phenotypes. Moreover, microglia that endorse pro-inflammatory phenotype is associated with both neurodevelopmental and neurodegenerative disorders. In vitro studies are widely used in research to evaluate potential therapeutic strategies in specific cell types. In this context studying microglial activation and neuroinflammation in vitro using primary microglial cultures is more relevant than microglial cell lines or stem-cell-derived microglia. However, the use of some primary cultures might suffer from a lack of reproducibility. This protocol proposes a reproducible and relevant method of magnetically isolating microglia from neonate pups. Microglial activation using several stimuli after 4 h and 24 h by mRNA expression quantification and a Cy3-bead phagocytic assay is demonstrated here. The current work is expected to provide an easily reproducible technique for isolating physiologically relevant microglia from juvenile developmental stages.

Primary microglia cultures are commonly used to evaluate new anti-inflammatory molecules. The present protocol describes a reproducible and relevant method to magnetically isolate microglia from neonate pups.

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Microglia, as brain resident macrophages, are fundamental to several functions, including response to environmental stress and brain homeostasis. ...

Primary Cultures of Rat Astrocytes and Microglia and Their Use in the Study of Amyotrophic Lateral Sclerosis

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to use these cells for the purpose of studying the pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis (ALS) in the rat hSOD1G93A model. First, the protocol shows how to isolate and culture astrocytes and microglia from postnatal rat cortices, and then how to characterize and test these cultures for purity by immunocytochemistry using the glial fibrillary acidic protein (GFAP) marker of astrocytes and the ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1) microglial marker. In the next stage, methods are described for dye-loading (calcium-sensitive Fluo 4-AM) of cultured cells and the recordings of Ca2+ changes in video imaging experiments on live cells.
The examples of video recordings consist of: (1) cases of Ca2+ imaging of cultured astrocytes acutely exposed to immunoglobulin G (IgG) isolated from ALS patients, showing a characteristic and specific response compared to the response to ATP as demonstrated in the same experiment. Examples also show a more pronounced transient rise in intracellular calcium concentration evoked by ALS IgG in hSOD1G93A astrocytes compared to non-transgenic controls; (2) Ca2+ imaging of cultured astrocytes during a depletion of calcium stores by thapsigargin (Thg), a non-competitive inhibitor of the endoplasmic reticulum Ca2+ ATPase, followed by store-operated calcium entry elicited by the addition of calcium in the recording solution, which demonstrates the difference between Ca2+ store operation in hSOD1G93A and in non-transgenic astrocytes; (3) Ca2+ imaging of the cultured microglia showing predominantly a lack of response to ALS IgG, whereas ATP application elicited a Ca2+ change. This paper also emphasizes possible caveats and cautions regarding critical cell density and purity of cultures, choosing the correct concentration of the Ca2+ dye and dye-loading techniques.

We present here a protocol on how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from rat cortices for time-lapse video imaging of intracellular Ca2+ for research on pathophysiology of amyotrophic lateral sclerosis in the hSOD1G93A rat model.

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

This protocol demonstrates how to prepare primary cultures of glial cells, astrocytes, and microglia from the cortices of Sprague Dawley rats and how to ...

Isolation of Mouse Primary Microglia by Magnetic-Activated Cell Sorting in Animal Models of Demyelination

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). Microglia can be divided into resting state and activated state and can rapidly change state in response to the microenvironment of the brain. Microglia will be activated under different pathological conditions and exhibit different phenotypes. In addition, there are many different subgroups of activated microglia and great heterogeneity between different subgroups. The heterogeneity mainly depends on the molecular specificity of microglia. Studies have revealed that microglia will be activated and play an important role in the pathological process of inflammatory demyelination. To better understand the characteristics of microglia in inflammatory demyelinating diseases such as multiple sclerosis and neuromyelitis optica spectrum disorder, we propose a perilesional primary microglial sorting protocol. This protocol utilizes columnar magnetic-activated cell sorting (MACS) to obtain highly purified primary microglia and preserve the molecular characteristics of microglia to investigate the potential effects of microglia in inflammatory demyelinating diseases.

Here, we present a protocol to isolate and purify primary microglia in animal models of demyelinating diseases, utilizing columnar magnetic-activated cell sorting.

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Microglia, the resident innate immune cells in the brain, are the primary responders to inflammation or injury in the central nervous system (CNS). ...

Isolation, Culture, and Characterization of Primary Schwann Cells, Keratinocytes, and Fibroblasts from Human Foreskin

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid enzymatic dissociation of skin. Primary keratinocytes, fibroblasts, and Schwann cells are all harvested from the human newborn foreskin, which is available following standard of care procedures. The removed skin is disinfected, and the subcutaneous fat and muscle are removed using a scalpel. The method consists of enzymatic and mechanical separation of epidermal and dermal layers, followed by additional enzymatic digestion to obtain single-cell suspensions from each of these skin layers. Finally, single cells are grown in appropriate cell culture media following standard cell culture protocols to maintain growth and viability over weeks. Together, this simple protocol allows isolation, culturing, and characterization of all three cell types from a single piece of skin for in vitro evaluation of skin-nerve models. Additionally, these cells can be used together in co-cultures to gauge their effects on each other and their responses to in vitro trauma in the form of scratches performed robotically in the culture associated with wound healing.

The study of wound healing associated with musculoskeletal injury often requires the assessment of in vitro interactions between Schwann cells (SCs), keratinocytes, and fibroblasts. This protocol describes the isolation, culturing, and characterization of these primary cells from the human foreskin.

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

This protocol describes isolation methods, culturing conditions, and characterization of human primary cells with high yield and viability using rapid ...

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

Caratterizzazione e isolamento di Mouse Microglia primaria di centrifugazione in gradiente di densità

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Preparazione di Synaptoneurosomes da mouse Cortex con un discontinuo di Percoll-Saccarosio gradiente di densità

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine ​​densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo

A bassa densità primaria ippocampale Cultura Neuron

Rapid e raffinato CD11b isolamento magnetico di primaria microglia con purezza migliorata e versatilità

Isolamento e l'estrazione di RNA dei neuroni, macrofagi e Microglia da cervelli di Zebrafish larvale

Rapido e specifico immunomagnetica isolamento degli oligodendrociti primario del Mouse

Isolamento magnetico di cellule microgliali da topo neonato per colture cellulari primarie

Colture primarie di astrociti e microglia di ratto e loro utilizzo nello studio della sclerosi laterale amiotrofica

Isolamento di microglia primarie di topo mediante smistamento cellulare ad attivazione magnetica in modelli animali di demielinizzazione

Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule primarie di Schwann, cheratinociti e fibroblasti dal prepuzio umano

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo