Questo lavoro è stato supportato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft SFB688 (di A.G.).

Allevamento del mouse è stato approvato dalla Regierung Unterfranken, e tutte le analisi sono state effettuate in conformità con tutti i tedesco e Unione europea leggi e normative applicabili relative alla cura e utilizzo degli animali da laboratorio.
1. rivestimento di microtitolo piastre con integrina α4β1 per Ex Utero Allantois Explant cultura
<ol><li>Ricostituire l'integrina α4β1 murino liofilizzato a 200 µ g/mL in soluzione fisiologica sterile di tampone fosfato (PBS). Diluire a una concentrazione finale di 10 µ g/mL in pre-riscaldato (37 ° C) PBS. Pipettare 20 µ l/pozzetto di soluzione integrina α4β1 diluito nel numero necessario di pozzetti di una piastra microtiter (1 allantoide/pozzetto). Nota: Evitare la formazione di bolle d'aria quando rivestimento dei pozzetti di micropiastre.</li>
	<li>Incubare le piastre di microtitolazione per 60 min a 37 ° C mettendoli in un incubatore umidificato coltura del tessuto.</li>
	<li>Aspirare accuratamente il surnatante con una pipetta. Utilizzare aspirazione delicata e inclinare il piatto per evitare di toccare il fondo con la punta della pipetta. Lavare i pozzetti due volte aggiungendo 50 µ l di terreno di coltura pre-riscaldata (37 ° C) come di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM) e rimuovere il mezzo di lavaggio di aspirazione delicata.</li>
	<li>Passaggio critico: blocco siti di legame con l'aggiunta di 50 µ l/pozzetto di 0,1% (p/v) albumina di siero bovino (BSA) / DMEM ed incubare per 30 min a 37 ° C ≥ inserendo le piastre di microtitolazione in un'incubatrice umidificata tessuto coltura. Nota: Espianti Allantois possono allegare a varie superfici in presenza di siero. È quindi imperativo per bloccare i siti di legame non specifico, dopo la verniciatura i pozzetti con integrina e prima di aggiungere l'allantoide sezionati per explant cultura nel liquido contenente siero medio (Vedi punto 4.4).</li>
	<li>Tenere i pozzetti coattati la soluzione bloccante a 37 ° C fino a quando necessario al punto 4.4.</li>
</ol>2. utero dissezione da un Mouse incinta al Dpc 8
Nota: Ridurre i tassi di gravidanza falso positivo da peso guadagno discriminazione15.
<ol><li>Sacrificare il mouse di dislocazione cervicale. Disinfettare il cappotto nella zona addominale spruzzando con etanolo al 70% (v/v). Nota: Indossare guanti durante la manipolazione di topi. Eutanasia di dislocazione cervicale senza anestetici previene la contaminazione chimica dei allantois, che può interferire con allegato allantoide.</li>
	<li>Aprire la pelle dell'addome facendo una piccola incisione al midline con le forbici. Utilizzare le dita guantate per tenere la pelle sopra e sotto l'incisione e tirare la pelle verso il petto e la coda del mouse.</li>
	<li>Afferrare il peritoneo con la pinzetta. Con l'altra mano, fare un'incisione a forma di V da anteriore verso posteriore usando le forbici e spostare il tessuto via per esporre la cavità addominale. Utilizzare le pinze per spingere l'intestino da un lato al fine di ottenere l'accesso all'utero.</li>
	<li>Individuare i due corni uterini. Tenere il collo dell'utero (il segmento caudale) con il forcipe e tagliare i legamenti con forbice. Quindi scollegare entrambi i corni uterini da recidere ovidotti con le forbici.</li>
	<li>Utilizzare pinze per trasferire l'utero in un piatto di 10cm sterile contenente sterile, PBS a temperatura ambiente (TA). Rimuovere il tessuto adiposo, vasi e nervi che circondano i corni uterini con una pinzetta e/o forbici (Figura 1A).</li>
</ol>3. embrione dissezione
Nota: Eseguire la procedura seguente sotto uno stereomicroscopio dotato di una gamma di zoom 8:1.
<ol><li>Separare gli embrioni di taglio tra i siti di impianto con le forbici. Afferrare il rivestimento uterino muscolare dei germogli dell'utero con la pinzetta e tirare lo distingue per esporre la decidua (Figura 1B).</li>
	<li>Usando il forcipe, trasferire i germogli di utero in un nuovo piatto di 10 cm contenente sterile, RT PBS.</li>
	<li>Difficoltà decidua intorno l'embrione con le punte delle pinze.</li>
	<li>Praticare un'incisione sul lato anti-mesometrial della decidua con una pinzetta (Figura 1) e togliere la decidua con pinze per esporre l'embrione (Figura 1). Nota: Il Polo di mesometrial della decidua è altamente vascolarizzato e può essere maggiore alla sua base la parte anti-mesometrial, che contiene l'embrione e appare più pallido.</li>
	<li>Sezionare l'embrione con il forcipe (Figura 1E, F).</li>
	<li>Utilizzando un micro-cucchiaio, trasferire l'embrione in una goccia di PBS sterile contenuta in un piatto sterile cm 3,5.</li>
	<li>Trasferire l'embrione in una fresca goccia di PBS nello stesso piatto 3,5 cm utilizzando un micro-cucchiaio e sezionare l'embrione dal sacco vitellino usando il forcipe (Figura 1, H).</li>
	<li>Facoltativamente, se necessario (ad es., per la genotipizzazione mediante polymerase chain reaction), trasferire il sacco vitellino in una provetta sterile aspirando con ~ 5 µ l PBS in punta di una pipetta di grande orifizio 200 µ l. Conservare a-20 ° C. Nota: Tessuto materno (cioè, il sacco vitellino parietale tra cui membrana di Reichert e il cono di ectoplacental) che potrebbe contaminare la preparazione del sacco vitellino può portare a risultati erronei genotipizzazione. Rimozione di questi tessuti è più semplice prima della dissezione dell'embrione dal sacco vitellino.</li>
</ol>4. allantois dissezione e cultura Ex Utero su integrina α4β1 immobilizzato
<ol><li>Tagliare l'allantoide dal suo sito di inserimento basale all'estremità posteriore dell'embrione utilizzando una pinzetta (Figura 1 H).</li>
	<li>Facoltativamente, se è necessaria la messa in scena dello sviluppo, è possibile contare le coppie somite dell'embrione mediante ispezione visiva utilizzando un microscopio dotato di ottica di contrasto di fase e un 5 × e 10 × obiettivo. Nota: L'embrione può essere esteso con pinze per facilitare il conteggio del somite. Fusione e corio-allantoidea allegato si verificano tra E 8.0 e 9.0 E embrioni con coppie di ≥ 6 somite. Tornitura comincia negli embrioni con 6-8 coppie di somite.</li>
	<li>Dispensare 40 µ l/pozzetto di DMEM completati con 10% (v/v) di siero bovino fetale, L-Glutammina e antibiotici nel numero necessario di pozzetti di piastra prepatinato necessari (vedere sezione 1).</li>
	<li>Raccogliere l'allantoide galleggiante aspirando con ~ 5 µ l PBS in un grande orifizio della punta di una pipetta 200 µ l. Trasferire 1 allantoide/pozzetto.</li>
	<li>Incubare il allantoides inserendo le piastre di microtitolazione in un incubatore umidificato coltura tissutale (37 ° C, 5% CO2) per es., 6, 12 e 24 h. Al fine di evitare interferenze con allegato allantoide, non spostare le piastre di microtitolazione tra questi intervalli di tempo.</li>
	<li>In ogni punto del tempo, Punteggio allegato allantoide (ad es., nessun allantoide galleggiante e allegato; parzialmente o completamente annesso allantoide; completamente diffusione allantoide) utilizzando un microscopio dotato di fase contrasto o differenziale interferenze ottiche di contrasto e un × 5 o 10 × obiettivo (Figura 2). Nota: Gli esempi rappresentativi di recente isolate e completamente attaccato allantoides sono mostrati nella Figura 2. Ex utero, la punta distale del allantoides isolate da topi C57BL/6J wildtype attribuisce all'interno di 4-6 h (questo si riferisce a come parziale allegato della allantois), e allegato completo della allantois intero viene raggiunto entro ~ 12 h di cultura. Da 18-24 h, explant ha appiattito e assume una forma circolare (di cui per come completamente diffondere allantoide) con un plesso vascolare di CD31-positivo9,16.</li>
</ol>5. conferma la macchiatura della Allantois espiantati per il CD31 marcatore delle cellule endoteliali
<ol><li>Aspirare il terreno di coltura di espianti di diffusione completamente e fissare le cellule con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di paraformaldeide 4% (p/v) / PBS. Nota: Paraformaldeide è tossico. Indossare guanti e occhiali di sicurezza per evitare il contatto dell'occhio e della pelle.</li>
	<li>Incubare per 10 min a RT, quindi aspirare il supernatante. Lavare tre volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.</li>
	<li>Permeabilize le cellule e bloccare i siti di legame non specifico aggiungendo 40 µ l/pozzetto di 0.1% (v/v) del siero di capra normale Triton X-100/0.1% (w/v) BSA/10% (v/v) in PBS per 30 min a RT. Wash due volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata. Nota: Il protocollo può essere sospesa durante la notte a questo punto.</li>
	<li>Macchia le cellule con l'aggiunta di 20 µ l/pozzetto di anticorpi anti-CD31 primario diluito 01:50 in 0,1% (p/v) BSA/PBS durante la notte a 4 ° C. Lavare tre volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.</li>
	<li>Rilevare gli anticorpi primari legati con l'aggiunta di 20 µ l/pozzetto di fluorescente-etichetta secondaria capra gli anticorpi anti-ratto diluito 1: 200 in 0,1% (p/v) BSA/PBS per 1h a RT. Protect di microtitolo dalla luce avvolgendo in carta stagnola o inserendo in una camera oscura. Lavare tre volte con l'aggiunta di 40 µ l/pozzetto di PBS e togliere la soluzione di lavaggio di aspirazione delicata.</li>
	<li>Incorporare le cellule con l'aggiunta di 20 µ l/pozzetto di mezzo di montaggio. Incubare per ~ 1h a RT fino a quando il mezzo di montaggio ha solidificato. Conservare le piastre di microtitolazione a temperatura ambiente o a 4 ° C, al riparo dalla luce.</li>
	<li>Immagine del plesso vascolare della allantois espianti sotto un microscopio a fluorescenza dotato di un × 5 o 10 × obiettivo e filtri di fluorescenza adatto. Nota: Immagini rappresentative del plesso vascolare CD31-positivi di un allantoide completamente diffusione sono mostrati nella Figura 3. Altri marcatori per il plesso vascolare, quali gli anticorpi diretti contro Flk-1, Flt, Tie-1 o Tie-2 può essere utilizzato come ben16.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rossant, J., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Placental+development:+lessons+from+mouse+mutants.">Placental development: lessons from mouse mutants.</a> Nat Rev Genet. 2 (7), 538-548 (2001).</li><li>Segerer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+essential+developmental+function+for+murine+phosphoglycolate+phosphatase+in+safeguarding+cell+proliferation.">An essential developmental function for murine phosphoglycolate phosphatase in safeguarding cell proliferation.</a> Sci Rep. 6, 35160 (2016).</li><li>Kane, S. V., Acquah, L. 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M., Temkin, R., Gifford, S., McHugh, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Study+of+the+murine+allantois+by+allantoic+explants.">Study of the murine allantois by allantoic explants.</a> Dev Biol. 233 (2), 347-364 (2001).</li><li>Hou, W., Sarikaya, D. P., Jerome-Majewska, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+culture+of+pre-placental+tissues+reveals+that+the+allantois+is+required+for+maintained+expression+of+Gcm1+and+Tpbpalpha.">Ex vivo culture of pre-placental tissues reveals that the allantois is required for maintained expression of Gcm1 and Tpbpalpha.</a> Placenta. 47, 12-23 (2016).</li><li>Zeigler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+allantois+and+chorion,+when+isolated+before+circulation+or+chorio-allantoic+fusion,+have+hematopoietic+potential.">The allantois and chorion, when isolated before circulation or chorio-allantoic fusion, have hematopoietic potential.</a> Development. 133 (21), 4183-4192 (2006).</li><li>Zaidel-Bar, R., Itzkovitz, S., Ma'ayan, A., Iyengar, R., Geiger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+atlas+of+the+integrin+adhesome.">Functional atlas of the integrin adhesome.</a> Nature cell biology. 9 (8), 858-867 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla a rivelare.

In presenza di siero, che è una fonte ricca di molecole pro-adesiva della matrice extracellulare quali fibronectina, allantoide espianti verranno prontamente collegato a vari in plastica, vetro o filtro superfici9,16. Così, se lo scopo del test eseguito è quello di studiare in particolare l'effetto di una modificazione genetica o qualsiasi altro trattamento allegato allantoide per immobilizzato α4β1, è fondamentale per bloccare i siti di legame non specific...

La placenta è indispensabile per la crescita embrionale e sviluppo nell'ambiente uterino. Esso costituisce l'interfaccia per ossigeno, metabolita e scambio di nutrienti tra la circolazione fetale e materna e anche funzioni come un organo endocrino e immunologico. Qualsiasi insulto endogena o esogena che altera lo sviluppo placenta può portare a ritardo di sviluppo intrauterino, perdita fetale o complicazioni di gravidanza, sia in topi ed in esseri umani1. Mentre il numero di mutazioni mirate del mouse che causano fisiologia placenta anormale continua ad aumentare di2, con 219 genotipi attualmente elencati nel sito Web del Mouse Genome Informatics (MGI) (http://www.informatics.jax.org/vocab/ mp_ontology / MP:0010038), molti di questi fenotipi non sono ben compresi da un punto di vista meccanicistico. Oltre alle alterazioni genetiche, anticorpi monoclonali, farmaci, tossine, agenti patogeni, metaboliti in eccesso o vari agenti ambientali possono influenzare lo sviluppo della placenta e funzione3,4,5 , 6 , 7. ancora, semplice in vitro dosaggi che modello passaggi critici nello sviluppo della placenta sono scarse.
Murino sviluppo placenta è iniziato nella prima metà, quando l'allantoide (il precursore dello sviluppo del cordone ombelicale) emerge dalla parte posteriore dell'embrione come un germoglio che cresce verso il corion8. Chorioadhesive cellule nello strato esterno del germoglio allantoico mediano l'allegato e la diffusione della allantois sulla superficie del corion (corio-allantoidea "fusione"). Il corion successivamente piega in villi in cui il sistema vascolare della allantois cresce per formare il labirinto, lo strato interno placenta, dove le sostanze nutrienti e l'ossigeno vengono scambiati tra sangue materno strettamente giustapposti sinusoidi e vasi embrionali9 ,10.
L'attaccamento della allantois al corion è il passo iniziale e fondamentale nella formazione del labirinto, e difetti di questo processo sono tra le cause più comuni di mortalità embrionale in midgestation1. Anche se un numero di mutanti del topo con stato descritto dove chorioallantoic allegato non riesce a verificarsi10, e il database MGI attualmente elenca 108 mutanti del topo che sono caratterizzati dalla fusione di corio-allantoidea anormale (http:// www.Informatics.Jax.org/Vocab/mp_ontology/MP:0002824), l'interazione intercellulare tra vascolare delle cellule adesione molecule-1 (VCAM-1, espressa il mesoderma allantoico) e integrina α4β1 (espressa su corionico mesotelio, che è derivato da mesoderm extraembryonic) sembra essere indispensabile per chorioallantoic allegato e fusione11,12,13. La macchiatura di Immunohistochemical di embrioni di selvaggio-tipo intero-monta ha dimostrato che VCAM-1 è espresso all'interno di due terzi distali del gambo allantoico al giorno circa embrionale (E) 7.513 (1-4 fase somite), e che la sua espressione rimane elevato durante il collegamento corio-allantoidea e - fusion11,12. Fallimento di allantoico attaccamento al corion viene in genere rilevata dalle analisi istologiche dei germogli di utero. Tuttavia, allantoide dimensioni sono fisiologicamente altamente variabile in mezzo e anche all'interno di cucciolate della stessa fase inerente allo sviluppo14e allantois possibile collegare solo il corion quando ha raggiunto una dimensione sufficiente per rendere il contatto fisico. Riflettendo questa variabilità naturale, corio-allantoidea allegato si svolge qualche tempo tra ~ E 8.0 e 9.0 E nell'uteroe una valutazione statisticamente affidabile di questo processo dall'istologia dipende pertanto l'analisi di un gran numero di conceptuses per ottenere abbastanza campioni presso lo stadio di sviluppo appropriato.
Qui, descriviamo un metodo per valutare allantoico allegato ex utero che è meno dipendente dalle dimensioni allantoide. Dimostriamo la dissezione di embrioni di topo e loro allantoides dalla uterina di topi incinta ~ 8 giorni post coitum del (dpc; dpc 0,5 indica il rilevamento di un plug vaginale), e la successiva cultura di allantoide espianti su α4β1 immobilizzato integrine. Questo metodo consente una valutazione rapida e funzionale l'allegato e diffondendo il comportamento degli espianti di allantoide multipli in parallelo e in diversi momenti successivi. Il protocollo può essere utilizzato per schermare per gli effetti di vari fattori ambientali, farmaci o mutazioni mirate su allantoide allegato ex vivo.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6J wildtype mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Stock No:&amp;nbsp;000664</td><td></td></tr><tr><td>70 % (v/v) Ethanol</td><td>VWR International</td><td>930031006</td><td></td></tr><tr><td>Standard pattern forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td>Forceps used to open the abdominal cavity.</td></tr><tr><td>Micro dissecting forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11254-20</td><td>Dumont # 5 medical biology forcepts with fine, sharp tip.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Fine scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>14094-11</td><td>Straight blades.</td></tr><tr><td>Spring scissors&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>15012-12</td><td>Noyes spring scissors with 14 mm blades for the dissection of uterus buds.</td></tr><tr><td>Microspoon</td><td>Carl Roth</td><td>AT18.1</td><td>5 mm Spoon diameter.</td></tr><tr><td>Microtiter plates</td><td>ibidi</td><td>81501</td><td>We use uncoated, sterile angiogenesis slides (internal volume 50 &amp;micro;L) with a hydrophobic surface that is not tissue-culture treated to reduce non-&amp;#945;4&amp;#946;1-mediated binding to plastic.</td></tr><tr><td>10 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150350</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>3.5 cm dish</td><td>Nunc</td><td>150288</td><td>Sterile tissue culture dishes.</td></tr><tr><td>Large orifice pipette tips&amp;nbsp;</td><td>Biozym</td><td>VT0140X</td><td>Low binding pipette tips, 200 &amp;micro;L.</td></tr><tr><td>&amp;#945;4&amp;#946;1 integrin</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>6054-A4</td><td>Murine &amp;#945;4&amp;#946;1 integrin recombinantly expressed and purified from a Chinese hamster ovary cell line.</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>Without Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; and Mg&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt;.</td></tr><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-03600</td><td>The formulation contains 4.5 g/L glucose, 110 mg/L sodium pyruvate and 3.7 g/L NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt; but no L-glutamine, which is added separately.</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin</td><td>Gibco (ThermoFisher Scientific)</td><td>15140-122</td><td>100 x (10,000 U/mL Penicillin and 10,000 &amp;micro;g/mL streptomycin) stock solution.&amp;nbsp;Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-80100</td><td>100 x (200 mM) Stock solution. Prepare and store aliquots at -20 &amp;deg;C to avoid freeze/thaw.</td></tr><tr><td>Fetal bovine serum&amp;nbsp;</td><td>Biochrom</td><td>S 0115</td><td>We use heat-inactivated FBS (heated to 56 &amp;deg;C for 30 min with mixing to inactivate complement).</td></tr><tr><td>Bovine serum albumin (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>We use protease- and fatty acid-free albumin. Prepare a 0.1 % (w/v) solution in DMEM. Sterile filter the solution through a disposable cell culture filter with a 0.22 &amp;micro;m pore size and low protein-binding membrane, and store aliquots at -20 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-Formaldehyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.2</td><td>To make a formaldehyde solution in PBS, weigh &lt;em&gt;para&lt;/em&gt;-formaldehyde powder in a ventilated hood, and add it to PBS preheated to ca. 60 &amp;deg;C in a beaker on a stir plate. Add 1 N NaOH dropwise until solution clears. Let solution cool to room temperature, and filter through 0.22 mm filter syringe. Adjust pH with diluted HCl to ca. 6.9, and adjust to final volume with PBS. We aliquot and freeze the solution, but it can also be stored at 4 &amp;deg;C for approximately four weeks.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td>Use wide-orifice pipette tips to handle undiluted Triton X-100.</td></tr><tr><td>Normal goat serum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td>To block non-specific binding of antibodies in immunofluorescence analyses.</td></tr><tr><td>&amp;#945;-CD31 Antibodies</td><td>BD Biosciences</td><td>550274</td><td>Purified rat anti-mouse monoclonal antibodies, clone MEC 13.3.</td></tr><tr><td>Secondary goat anti-rat antibodies</td><td>Thermo Fisher</td><td>A-11006</td><td>Goat anti-rat IgG (heavy and light chains), cross-adsorbed, fluorescently labeled with Alexa Fluor 488. Other fluorescent labels are also possible.</td></tr><tr><td>Mowiol 4-88</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81381</td><td>Mounting medium for cytochemistry. MW ~31,000</td></tr><tr><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Leitz</td><td>Labovert&amp;nbsp;</td><td>Inverted phase contrast microscope equipped with a 4 x and 10 x objective for somite pair counting. Other phase contrast microscopes (such as those that are routinely used in tissue culture) are also suitable.&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>M80</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td>Stereomicroscope with 8 : 1 zoom range (yielding a magnification between 7.5 x and 60 x) for embryo and allantois dissection.</td></tr><tr><td>DM4000B</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM4000B</td><td>Microscope system for histology with LED illumination. We use HCX PL FLUOTAR 5 x/0.15 and HC PL FLUOTAR 10 x/0.30 objectives. Other microscopes equipped phase contrast and fluorescence optics can be used to score allantois attachment.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Digital camera</td><td>JVC</td><td>KY-F75U</td><td>3-CCD digital capture camera attached to the DM4000B LED microscope. We use Diskus software (Hilgers) to operate both the microscope and the camera.</td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Leica Microsystems</td><td>SP5</td><td>Confocal microscope for higher-resolution imaging of endothelia in the vascular plexus of allantois explants. Immunofluorescence images were taken with a 40 x objective.</td></tr></tbody></table>

dissection and explant culture of murine allantois for the in vitro analysis of allantoic attachment

La placenta è essenziale per la crescita e lo sviluppo degli embrioni dei mammiferi. Per questo motivo, numerose alterazioni genetiche e probabili insulti anche ambientali che disturbano lo sviluppo della placenta o funzione possono causare perdita iniziale di gravidanza nei topi e nell'uomo. Tuttavia, mancano semplice in vitro test per lo screening per i potenziali effetti sulla formazione della placenta. Qui, ci concentriamo sulla modellazione il primo e fondamentale passo nella formazione della placenta, che consiste dell'attaccamento del allantois di chorion. Descriviamo un metodo per valutare rapidamente l'attaccamento degli espianti allantoico su integrina α4β1 immobilizzato, che funge da un substrato chorio-mimetici. Questo approccio in vitro consente una valutazione qualitativa dell'allegato e diffondendo il comportamento di più allantoide espianti in diversi momenti consecutivi. Il protocollo può essere utilizzato per studiare l'effetto di mutazioni mirate del mouse, droghe o vari fattori ambientali che sono stati collegati alle complicanze della gravidanza o perdita fetale su allantoide allegato ex vivo.

Questo protocollo descrive un metodo per isolare ed explant allantoides murino ex vivoe la valutazione qualitativa dell'allantoide attaccamento di integrina α4β1, un processo critico durante in vivo chorioallantoic fusione di dettagli. I risultati rappresentativi mostrati in Figura 1A–H illustrano i passaggi successivi di isolamento allantoide a partire dall'utero incinto. Tessuti materni che circondano ...

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Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

Descriviamo un test in vitro per allegato corio-allantoidea di modello, il primo passo nella formazione della placenta. Il protocollo dimostra la cultura dissezione ed espianto di murino allantoides su integrina α4β1 immobilizzato. Allegato allantoide viene valutato microscopicamente a intervalli di tempo predeterminati.

Dissezione e cultura Explant della Allantois murino per l'analisi In Vitro di allantoico allegato

The placenta is essential for the growth and development of mammalian embryos. For this reason, numerous genetic alterations and likely also environmental ...

dissection-explant-culture-murine-allantois-for-vitro-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

Dissection and Explant Culture of Murine Allantois for the In Vitro Analysis of Allantoic Attachment

7.8K Views.  University of Würzburg. Descriviamo un test in vitro per allegato corio-allantoidea di modello, il primo passo nella formazione della placenta. Il protocollo dimostra la cultura dissezione ed espianto di murino allantoides su integrina α4β1 immobilizzato. Allegato allantoide viene valutato microscopicamente a intervalli di tempo predeterminati.

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Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

Usando In Vivo e del tessuto e delle cellule Explant approcci per studiare la morfogenesi e la patogenesi dell'Aorta embrionale e perinatale

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Application of Aorta-gonad-mesonephros Explant Culture System in Developmental Hematopoiesis

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine development of the embryo. Although genetic data from knockout (KO) mice are convincing, it is not realistic to generate KO mice for all genes as needed. In addition, performing in vivo rescue experiments to consolidate the data obtained from KO mice is not convenient. To overcome these limitations, the Aorta-Gonad-Mesonephros (AGM) explant culture was developed as an appropriate system to study hematopoietic stem cell (HSC) development. Especially for rescue experiments, it can be used to recover the impaired hematopoiesis in KO mice. By adding the appropriate chemicals into the medium, the impaired signaling can be reactivated or up-regulated pathways can be inhibited. With the use of this method, many experiments can be performed to identify the critical regulators of HSC development, including HSC related gene expression at mRNA and protein levels, colony formation ability, and reconstitution capacity. This series of experiments would be helpful in defining the underlying mechanisms essential for HSC development in mammals.

This protocol describes using cultured Aorta-Gonad-Mesonephros for expression analyses, colony-forming units in the culture and spleen, and long-term reconstitution to determine the effect of regulatory factors and signaling pathways on hematopoietic stem cell development. This has been demonstrated as an effective system for studying hematopoietic stem cell biology and function.

Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo

The limitation of using mouse embryos for hematopoiesis studies is the added inconvenience in operations, which is largely due to the intrauterine ...

Isolation of Leukocytes from the Murine Tissues at the Maternal-Fetal Interface

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing fetus. This tolerance is initiated during coitus, established during fecundation and implantation, and maintained throughout pregnancy. Active cellular and molecular mediators of maternal-fetal tolerance are enriched at the site of contact between fetal and maternal tissues, known as the maternal-fetal interface, which includes the placenta and the uterine and decidual tissues. This interface is comprised of stromal cells and infiltrating leukocytes, and their abundance and phenotypic characteristics change over the course of pregnancy. Infiltrating leukocytes at the maternal-fetal interface include neutrophils, macrophages, dendritic cells, mast cells, T cells, B cells, NK cells, and NKT cells that together create the local micro-environment that sustains pregnancy. An imbalance among these cells or any inappropriate alteration in their phenotypes is considered a mechanism of disease in pregnancy. Therefore, the study of leukocytes that infiltrate the maternal-fetal interface is essential in order to elucidate the immune mechanisms that lead to pregnancy-related complications. Described herein is a protocol that uses a combination of gentle mechanical dissociation followed by a robust enzymatic disaggregation with a proteolytic and collagenolytic enzymatic cocktail to isolate the infiltrating leukocytes from the murine tissues at the maternal-fetal interface. This protocol allows for the isolation of high numbers of viable leukocytes (&#62;70%) with sufficiently conserved antigenic and functional properties. Isolated leukocytes can then be analyzed by several techniques, including immunophenotyping, cell sorting, imaging, immunoblotting, mRNA expression, cell culture, and in vitro functional assays such as mixed leukocyte reactions, proliferation, or cytotoxicity assays.

Described herein is a protocol to isolate and analyze the infiltrating leukocytes of tissues at the maternal-fetal interface (uterus, decidua, and placenta) of mice. This protocol maintains the integrity of most cell surface markers and yields enough viable cells for downstream applications including flow cytometry analysis.

L&#39;isolamento dei leucociti di tessuti murini all&#39;interfaccia materno-fetale

Immune tolerance in pregnancy requires that the immune system of the mother undergoes distinctive changes in order to accept and nurture the developing ...

Immunologia e infezioni

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the complexities of the organoid growth characteristics carry significant caveats for the investigator. Specifically, the growth patterns of each individual organoid are highly variable and create a heterogeneous population of epithelial cells in culture. With such caveats, common tissue culture practices cannot be simply applied to the organoid system due to the complexity of the cellular structure. Counting and plating based solely on cell number, which is common for individually separated cells, such as cell lines, is not a reliable method for organoids unless some normalization technique is applied. Normalizing to total protein content is made complex due to the resident protein matrix. These characteristics in terms of cell number, shape and cell type should be taken into consideration when evaluating secreted contents from the organoid mass. This protocol has been generated to outline a simple procedure to culture and treat small intestinal organoids with microbial pathogens and pathogen associated molecular patterns (PAMPs). It also emphasizes the normalization techniques that should be applied when protein analysis are conducted after such a challenge.

The Ex Vivo Culture and Pattern Recognition Receptor Stimulation of Mouse Intestinal Organoids

Here, a protocol to harvest, maintain, and treat mouse small intestinal organoids with pathogen associated molecular patterns (PAMPs) and Listeria monocytogenes is described, as well as emphasis on gene expression and proper normalization techniques for protein.

Il<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Cultura e Pattern Recognition recettore stimolazione del mouse intestinale organoidi

Primary intestinal organoids are a valuable model system that has the potential to significantly impact the field of mucosal immunology. However, the ...

Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is imperative to design experiments using human cells and tissues. An advantage of organ culture is maintenance of three-dimensional (3D) structural organization and extracellular matrix. The goal of the method described here is successful establishment of ex vivo human gestational tissue organ cultures and their healthy culture maintenance for 72-96 hr. The protocol details the immediate processing of research-consented, placental and decidual specimens fresh from the operating suite. These are abundant specimens that would otherwise be discarded. Detailed instructions on the sterile collection of these samples, including morphologic details on how to select appropriate tissues to establish 3D organ cultures, is provided. Placental villous and decidual tissues are microdissected into 2-3 mm3 pieces and placed separately on matrix-lined transwell filters and cultured for several days. Villous and decidual organ cultures are well suited for the study of human host-pathogen interaction. As compared to other model organisms, these human cultures are particularly advantageous to examine mechanism of infection for pathogens that demonstrate variable patterns of host specificity. As an example, we demonstrate infection of placental and decidual organ cultures with the clinically relevant, facultative intracellular bacterial pathogen Listeria monocytogenes.

A simple method to establish primary human placental (villous) and decidual organ cultures is described. Villous and decidual organ cultures are invaluable tools for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface. Infection with the facultative intracellular bacterium Listeria monocytogenes is demonstrated.

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all&#39;interfaccia materno-fetale

The placenta shows a large degree of interspecies anatomic variability. To best understand biology and pathophysiology of the human placenta, it is ...

Microdissection and Dissociation of the Murine Oviduct: Individual Segment Identification and Single Cell Isolation

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental treatments. However, because of their small body size, some structures, such as the oviduct with a diameter of 200-400 &#956;m, have proven to be relatively difficult to study except by immunohistochemistry. Recently, immunohistochemical studies have uncovered more complex differences in oviduct segments than were previously recognized; thus, the oviduct is divided into four functional segments with different ratios of seven distinct epithelial cell types. The different embryological origins and ratios of the epithelial cell types likely make the four functional regions differentially susceptible to disease. For example, precursor lesions to serous intraepithelial carcinomas arise from the infundibulum in mouse models and from the corresponding fimbrial region in the human fallopian tube. The protocol described here details a method for microdissection to subdivide the oviduct in such a way to yield a sufficient amount and purity of RNA necessary for downstream analysis such as reverse transcription-quantitative PCR (RT-qPCR) and RNA sequencing (RNAseq). Also described is a mostly non-enzymatic tissue dissociation method appropriate for flow cytometry or single cell RNAseq analysis of fully differentiated oviductal cells. The methods described will facilitate further research utilizing the murine oviduct in the field of reproduction, fertility, cancer, and immunology.

A method for microdissection of the mouse oviduct that allows collection of the individual segments while maintaining RNA integrity is presented. In addition, non-enzymatic oviductal cell dissociation procedure is described. The methods are appropriate for subsequent gene and protein analysis of the functionally different oviductal segments and dissociated oviductal cells.

Microdissezione e dissociazione dell'ovidotto murino: identificazione del segmento individuale e isolamento di singole cellule

Mouse model systems are unmatched for the analysis of disease processes because of their genetic manipulability and the low cost of experimental ...

An Explant Assay for Assessing Cellular Behavior of the Cranial Mesenchyme

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the neural tube in a process known as neurulation. During neurulation, morphogenesis of the mesenchyme that underlies the neural plate is believed to drive neural fold elevation. The cranial mesenchyme is comprised of the paraxial mesoderm and neural crest cells. The cells of the cranial mesenchyme form a pourous meshwork composed of stellate shaped cells and intermingling extracellular matrix (ECM) strands that support the neural folds. During neurulation, the cranial mesenchyme undergoes stereotypical rearrangements resulting in its expansion and these movements are believed to provide a driving force for neural fold elevation. However, the pathways and cellular behaviors that drive cranial mesenchyme morphogenesis remain poorly studied. Interactions between the ECM and the cells of the cranial mesenchyme underly these cell behaviors. Here we describe a simple ex vivo explant assay devised to characterize the behaviors of these cells. This assay is amendable to pharmacological manipulations to dissect the signaling pathways involved and live imaging analyses to further characterize the behavior of these cells. We present a representative experiment demonstrating the utility of this assay in characterizing the migratory properties of the cranial mesenchyme on a variety of ECM components.

The cranial mesenchyme undergoes dramatic morphogenic movements that likely provides a driving force for elevation of the neural folds1,2. Here we describe a simple ex vivo explant assay to characterize the cellular behaviors of the cranial mesenchyme during neurulation. This assay has numerous applications including being amenable to pharmacological manipulations and live imaging analyses.

Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

The central nervous system is derived from the neural plate that undergoes a series of complex morphogenetic movements resulting in formation of the ...

Biologia

Co-Culture of Murine Small Intestine Epithelial Organoids with Innate Lymphoid Cells

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate balance of mucosal homeostasis. These 3D, multi-cellular systems offer a reductionist model for addressing multi-factorial diseases and resolving technical difficulties that arise when studying rare cell types such as tissue-resident innate lymphoid cells (ILCs). This article describes a murine system that combines small intestine organoids and small intestine lamina propria derived helper-like type-1 ILCs (ILC1s), which can be readily extended to other ILC or immune populations. ILCs are a tissue-resident population that is particularly enriched in the mucosa, where they promote homeostasis and rapidly respond to damage or infection. Organoid co-cultures with ILCs have already begun shedding light on new epithelial-immune signaling modules in the gut, revealing how different ILC subsets impact intestinal epithelial barrier integrity and regeneration. This protocol will enable further investigations into reciprocal interactions between epithelial and immune cells, which hold the potential to provide new insights into the mechanisms of mucosal homeostasis and inflammation.

This protocol offers detailed instructions for establishing murine small intestine organoids, isolating type-1 innate lymphoid cells from the murine small intestine lamina propria, and establishing 3-dimensional (3D) co-cultures between both cell types to study bi-directional interactions between intestinal epithelial cells and type-1 innate lymphoid cells.

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Complex co-cultures of organoids with immune cells provide a versatile tool for interrogating the bi-directional interactions that underpin the delicate ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per<em&gt; Ex Vivo</em&gt; La manipolazione delle vie di segnalazione e tridimensionale Imaging in diretta di Sviluppo del villo

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

Establishing Villous and Decidual Organ Cultures as Ex Vivo Models of Human Maternal-Fetal Interface

Source: Rizzuto, G. A., et al. <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/54237">Human Placental and Decidual Organ Cultures to Study Infections at the Maternal-fetal Interface.</a> J. Vis. Exp. (2016).
This video demonstrates the establishment of primary human placental villous and decidual organ cultures in ex vivo conditions. These models are well-suited for studying pathogenesis at the human maternal-fetal interface.

Definizione di colture di organi villosi e deciduali come modelli ex vivo di interfaccia materno-fetale umana

All procedures involving human participants have been performed in compliance with the institutional, national, and international guidelines for human ...

Dissezione e cultura Explant della Allantois murino per l'analisi In Vitro di allantoico allegato

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Usando In Vivo e del tessuto e delle cellule Explant approcci per studiare la morfogenesi e la patogenesi dell'Aorta embrionale e perinatale

Applicazione del sistema di coltura Explant Aorta-gonade-Mesonefro nell'ematopoiesi inerente allo sviluppo

L'isolamento dei leucociti di tessuti murini all'interfaccia materno-fetale

Il

Culture placentare e deciduale organo umano allo Studio infezioni all'interfaccia materno-fetale

Microdissezione e dissociazione dell'ovidotto murino: identificazione del segmento individuale e isolamento di singole cellule

Un test per la valutazione dei comportamenti Espianto cellulare del Mesenchima cranio

Co-coltura di organoidi epiteliali murini dell'intestino tenue con cellule linfoidi innate

Mouse fetale Whole Intestino Sistema Cultura per

Definizione di colture di organi villosi e deciduali come modelli ex vivo di interfaccia materno-fetale umana