Ringraziamo Ye Zhang per l&#39;aiuto con le tracce del campione e Tin Ki Tsang per l&#39;aiuto con le immagini. Questo lavoro è stato sostenuto da un premio di premio della Fondazione Ray Thomas Edwards e da una sovvenzione di NIH (R01DC015519) ai contributi di C.-YS e NIH (R01DC009597 e R01DK092640) a JWW

1. Preparazione dell&#39;hardware per la registrazione a4 <ol><li> Utilizzare uno strumento per estrarre pipette per preparare elettrodi con capillari in vetro di alluminosilicato (OD 1,0 mm, ID 0,64 mm). Spingere leggermente la punta dell&#39;elettrodo di riferimento con una coppia di pinze fine per facilitare l&#39;inserimento nel clypeus della mosca ( cioè una piastra arrotondata nella parte anteriore della testa di mosca, sopra le bocche). NOTA: 7 giorni di WT maschi (Berlino) sono stati utilizzati in questo studio. Utilizzare la soluzione salina AHL 14 come elettrolita per entrambi gli elettrodi. </li><li> Preparare 1 L di AHL miscelando 900 ml di acqua distillata con 6,312 g di NaCl, 0,373 g di KCl, 0,337 g di NaHCO 3, 0,1120 g di NaH 2 PO 4, 1.892 g di trealosio ּ 2 H 2 O, 3.423 g di saccarosio, 1,192 g di HEPES e 8,2 ml di 1 M MgCl 2 . Usando l&#39;acqua distillata, portare il volume totale fino a 1 L. Portare il pH a 7,4 utilizzando 1 N NaOH e sterilizzare la soluzione con unSistema filtrante a vuoto. Per la conservazione a lungo termine, conservare le aliquote AHL a 4 ° C. NOTA: Le consegne costanti dell&#39;acido palmitoleico sono contingenti all&#39;uniformità tra le cartucce. È fondamentale che ogni cartuccia sia assemblata in modo riproducibile. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio, rimuovere 0.9 centimetri dalla punta di una punta di pipetta da 200 μL per creare la prima sezione della cartuccia, di 4.1 cm; Fare riferimento alle dimensioni dettagliate nella Figura 1A . Utilizzare un&#39;altra pipetta da 200 μl e rimuovere 1,7 cm e 1,5 cm dalla punta e dalla base rispettivamente per creare la seconda sezione della cartuccia, di 1,8 cm ( figura 1A ). Utilizzare un righello per garantire la riproducibilità. </li><li> Utilizzare un ⅛ &quot;perforatore per tagliare i dischi dalla carta filtrante. </li><li> Utilizzare la pinza per posizionare un disco di carta filtrante alla punta della seconda sezione della cartuccia. Verificare visivamente che c&#39;è una apertura nella punta della cartuccia attraverso la quale l&#39;aria può passare. </li><li> Fissare insieme le sezioni della prima e del secondo cartuccia, come mostrato nella Figura 1A . Angolare la seconda sezione della cartuccia verso il basso per facilitare lo spostamento quadrato alla preparazione ( Figura 1B ). </li><li> Collegare la cartuccia con il tubo di mandata odore, montato su un micromanipolatore. NOTA: Questo disegno consente di spostare la cartuccia verso l&#39;esterno per facilitare lo scambio ( Figura 1C ). </li><li> Impostare il flusso d&#39;aria costante umidificato a 2 L / min in un controllore di massa e portare l&#39;odorante a 500 mL / min in un altro controllore di massa. </li><li> Utilizzando il software (vedere la tabella dei materiali ), programmare la procedura per amministrare un soffio di odore da 500 ms. </li></ol> 2. Preparazione di Soluzioni Odoranti Acido Palmitoleico per la Consegna NOTA: OR47b ORN risponde sia all&#39;acido palmitoleico cis che al trans . Poiché l&#39;acido palmitoleico è instabile a RT, le scorte sono conservate a -20 ° C e utilizzate entro un mese dall&#39;apertura. L&#39;etanolo è il solvente di scelta per l&#39;acido palmitoleico. <ol><li> Utilizzare un miscelatore vortex per mescolare accuratamente 10 μL di stock di acido cis- o trans- palmitoleico o di diluizioni con 90 μl di etanolo al 100% per le diluizioni seriali dieci volte in microtubi da 1,7 ml. Preparare quotidianamente le diluizioni di acido palmitoleico fresco prima di esperimenti e utilizzare entro un giorno. NOTA: Per gli odoranti che non sono solubili in etanolo, si raccomanda una fiala di vetro per la preparazione delle diluizioni di odori con altri tipi di solventi organici. </li><li> Utilizzando una micropipetta P10, applicare 5 μL di soluzioni di acido cis- palmitoleico delle diluizioni desiderate alla carta filtrante in ciascuna corrispondente cartuccia. NOTA: Il dosaggio più alto (10 -1 ) contiene 450 μg del composto. Per le soluzioni di acido trans- palmitoleico, applicare invece 4,5 μL in modo che il dosaggio più alto (10 -1 ) contiene anche 450 μg di tLui composto. </li><li> Per evaporare completamente il solvente, posizionare le cartucce di acido palmitoleico in un essiccatore a vuoto per 1 h a RT e 7.59 mmHg di pressione. NOTA: Le cartucce possono essere utilizzate fino a 4 ore a RT. </li></ol> 3. Preparazione di Drosophila per il pronto accesso alla at4 Sensilla per le registrazioni elettrofisiologiche in vivo NOTA: Le mosche WT (Berlino) vengono allevate in campione di cereali standard a 25 ° C in un ciclo chiaro e scuro di 12:12. In seguito all&#39;eclosione, le mosche sono separate da sesso in gruppi di dieci, per cui sono alloggiati in gruppo fino a 7 d di età. OR47b ORN in entrambi le mosche maschili e femminili rispondono all&#39;acido palmitoleico. Per semplicità, solo le mosche maschili vengono esaminate nell&#39;attuale studio. <ol><li> Assemblare uno scivolo a mosca: su una lastra di vetro, posizionare una copertura in vetro (18 x 18 mm 2 ) su una piccola quantità di argilla modellante, formando un angolo di 3 ° con il vetrino in vetro. Posizionare il nastro su entrambi i lati sull&#39;internoDge della coverlip e sull&#39;area della diapositiva immediatamente sotto. Sostituire con nastro fresco per ogni giorno di registrazione ( Figura 2A ). </li><li> Usare un aspirapolvere mosso 15 per raccogliere la mosca di interesse nel tubo e quindi inserire una punta pipetta da 200 μl sopra l&#39;estremità del tubo. Spingere contemporaneamente il tubo in avanti mentre soffia l&#39;aria nel tubo per spingere la mosca alla fine della punta della pipetta. Utilizzare una lama di rasoio per tagliare appena sotto il corpo della mosca e 2 lunghezze di testa sopra la mosca. </li><li> Tampone il fondo della punta della pipetta con l&#39;argilla di modellazione, spingendo la mosca verso l&#39;alto fino a esporre sia l&#39;antenna che il clypeus ( Figura 2B ). Per evitare l&#39;uccisione della mosca, aggiungere solo l&#39;argilla sufficiente per esporre le antenne e arista, in quanto ciò impedisce l&#39;addome del mosca da schiacciare. Inoltre, aggiungete argilla lentamente e delicatamente per evitare ogni improvvise costrizione. Confermare che la mosca sia viva controllando l&#39;antennaO il movimento di proboscide. </li><li> Utilizzare pinze per manovrare la punta pipetta che ospita la mosca. Orientare la testa in modo che il clypeus sia rivolto a destra dell&#39;osservatore. Regolare la preparazione lungo la copertura con le pinze fine fino a quando il lato laterale dell&#39;antenna non si trova sulla superficie del coperchio ( Figura 2B ). </li><li> Posizionare l&#39;asta di supporto sull&#39;arista per fissare l&#39;antenna al nastro biadesivo per evitare il movimento ( Figura 2B ). NOTA: L&#39;asta di supporto viene tirato da un capillare di vetro borosilicato con un puller di pipetta e tenuto in posizione con l&#39;argilla di modellazione ( Figura 2A ). </li><li> Posizionare la preparazione sullo stadio dell&#39;impianto ( figura 2C ). Usando il microscopio, confermare che i tricolori sono visibili lungo il bordo distale-laterale del terzo segmento dell&#39;antenna. NOTA: Idealmente, la sensilla dovrebbe essere chiaramente distinta sullo sfondo, che semplifica la loro<html> Identificazione e facilita la registrazione ( Figura 3 ). In questa preparazione, la maggior parte della sensibilità trichoide accessibile è del tipo at4. </li><li> Conservare la preparazione in un flusso d&#39;aria costante umidificato (2 l / min) erogato tramite un tubo di mandata separato da una distanza di circa 2 cm dalla preparazione ( figura 4 ), come descritto in precedenza 2 , 15 . </li></ol> 4. Registrazione di at4 attività di Sensillum da OR47b ORN nei trichoidi at4 in risposta all&#39;acido di Palmitoleic <ol><li> Inserire l&#39;elettrodo di riferimento nel clypeus ( Figura 3A ). Per evitare danni ai tessuti, assicurarsi che l&#39;elettrodo sia inserito appena sotto la superficie, dove può contattare l&#39;emolimfia sotto la cuticola, con un movimento rapido e liscio. </li><li> Abbassare l&#39;elettrodo di registrazione lentamente quando entra nello stesso piano di vista del sensibile bersaglio (= &quot;Xfig&quot;&gt; Figura 3B). Registra sotto una lente obiettivo 50X. NOTA: La tagliente trichoidale duro richiede l&#39;inserimento dell&#39;elettrodo di registrazione nella base sensibile, la cui zona più ampia fornisce un bersaglio più ampio che riduce la probabilità che l&#39;elettrodo sia deviato ( figura 3B , inset). </li><li> Prima di applicare stimoli di odore ad un sensillum, osservare i seguenti criteri di selezione; Ogni trichoide che non riesce a soddisfare questi standard dovrebbe essere respinto e un altro sensilismo scelto invece. <ol><li> Osservare un elevato rapporto segnale-rumore (per esempio, vedere la figura 3C ). </li><li> Osservare i picchi identificabili da neuroni at4A e at4C ( Figura 3C ). NOTA: Da notare, l&#39;ampiezza del picco at4B appare molto simile a at4A 10 e non può essere identificata facilmente senza stimolazione odore. </li><li> Osserva che il tasso di tiro basale dei neuroni at4A èIntorno o inferiore a 20 Hz. NOTA: Questo criterio è specifico per at4A poiché il tasso di tiro basale per il neurone è superiore a quello degli ORNs basiconic 2 . Un fuoco basale molto più elevato indica che i neuroni possono essere stati danneggiati durante l&#39;inserimento dell&#39;elettrodo. </li></ol></li><li> Collegare la cartuccia al tubo di mandata odorante. Inizia con il controllo del solvente e poi gli odoranti, dalle concentrazioni basse e alte. Utilizzare il micromanipulatore per manovrare la cartuccia verso la preparazione mentre si punta la cartuccia in modo esatto alla testa del prep. Verificare visivamente che la cartuccia è punta direttamente all&#39;antenna ( figura 4 ) a pochi millimetri di distanza. NOTA: L&#39;obiettivo è orientare l&#39;apertura della cartuccia direttamente all&#39;antenna e posizionarla in prossimità del tessuto bersaglio. </li><li> Assicurarsi che la cartuccia odorante sia separata dall&#39;elettrodo di registrazione a destra da 1 a 2 mm e dal fly preP scivolare sotto di circa 1 mm. NOTA: Nell&#39;impostazione descritta qui, la cartuccia odorante è strettamente confinata con l&#39;elettrodo di registrazione, l&#39;elettrodo di riferimento e lo scorrimento fly-prep ( Figura 4 ). NOTA: prestare attenzione alla distanza tra la cartuccia e gli elettrodi di registrazione / riferimento. Si consiglia una distanza di circa 4 mm 1 . Il contatto involontario può terminare il segnale e rompere la punta dell&#39;elettrodo di registrazione, danneggiando il neurone corrente e complicando ulteriori registrazioni. NOTA: Si consideri la distanza che separa la cartuccia e la diapositiva del fly-prep. Toccare la copertura può anche disattivare l&#39;elettrodo di registrazione per interrompere la registrazione. </li><li> Premere &quot;Record&quot; nel software di acquisizione dati per avviare la registrazione. NOTA: per ogni registrazione a 10 s, un singolo impulso di odore da 500 ms viene inviato direttamente all&#39;antenna, come descritto nel passaggio 1.9. </li><li> Dopo l&#39;applicazione odorante,Tirare accuratamente la cartuccia prima di sostituirla con una cartuccia della concentrazione più prossima. Continuare fino a raggiungere l&#39;intero intervallo di dosaggio. NOTA: Si raccomanda di registrare un solo OR47b ORN da ogni volo per evitare eventuali effetti di adattamento. </li><li> Sciacquare accuratamente l&#39;elettrodo di registrazione con acqua distillata dopo aver terminato la registrazione per il giorno. </li><li> Analizzare e tracciare i dati utilizzando software di analisi offline disponibili in commercio. </li></ol>

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Gli autori non hanno niente da rivelare.

Qui abbiamo descritto una procedura con la quale le risposte di Or47b ORNs all&#39;acido palmitoleico possono essere indotti e registrati in modo robusto. Abbiamo modificato un metodo convenzionale per la distribuzione di odori a lunga distanza 2 , 7 , 10 per risolvere il problema della mancanza di erogazione di feromoni. Abbiamo affrontato il problema della bassa volatilità odorante consegnando il composto tramite cartucce od...

<html> Gli ORN di Drosophila rispondono ad un vasto numero di odoranti, con lunghezze lunghe di catene di carbonio e vari gruppi funzionali, inclusi esteri, alcoli, chetoni, lattoni, aldeidi, terpeni, acidi organici, ammine, composti di zolfo, eterocicli e aromi 2 , 3 . Gli odoranti variati nelle loro caratteristiche fisico-chimiche possono avere volatilità notevolmente diverse, indicati dalla pressione del vapore del composto. In particolare, gli odoranti biologicamente rilevanti per Drosophila melanogaster differiscono tremendamente nella loro volatilità. Ad esempio, i ORN di Ir92a rispondono ad ammoniaca 4 , altamente volatile, con una pressione di vapore di 6.432 mmHg a 20 ° C. Al contrario, Or67d ORN risponde a un feromone maschio, cis- Vaccenil acetato ( c VA) 5 , 6 , la cui pressione vapore è di 43 mmHg a 20 ° C. Ove_content &quot;&gt; Studiare la risposta olfattiva agli odoranti a bassa volatilità è particolarmente impegnativa con i metodi convenzionali di erogazione, in cui gli odoranti vengono consegnati attraverso un flusso d&#39;aria di supporto su una distanza relativamente lunga ( cioè diversi centimetri), in quanto tali le risposte olfattive riportate Ad un determinato odorante a bassa volatilità può variare notevolmente, a seconda della progettazione del sistema di erogazione. Ad esempio, la risposta riportata di Or67d ORN ad un&#39;elevata dose di c VA va da ~ 40 7 -&gt; 200 picchi / s 6 Inoltre, l&#39;inefficace consegna di c VA con metodi di consegna convenzionali è probabilmente attribuita a risultati falsi negativi, portando all&#39;interpretazione che c VA di per sé non è sufficiente ad attivare OR67d ORNs 8. Questa interpretazione fu successivamente contestata da un altro studio che utilizza un Metodo di erogazione di odore a distanza ravvicinata 9. È quindi imperaPer sviluppare un sistema di erogazione robusto per la presentazione efficace di odoranti a bassa volatilità. Recentemente, abbiamo identificato diversi acidi grassi cuticolari a catena lunga come ligandi per Or47b ORNs. Sono alloggiati nel tipo 4 Antennal Trichoid Sensillum (at4). Fra gli odoranti di acido grasso a lunga catena, abbiamo scoperto che l&#39;acido palmitoleico funziona come un feromone afrodisiaco che promuove il corteggiamento maschile attivando Or47b ORNs 1 . Tuttavia, in un altro studio che utilizza un metodo di consegna convenzionale di odore, è stato dimostrato che la laurate di metile provocava risposte da OR47b ORN, mentre l&#39;acido palmitoleico non ha generato risposta se viene presentata dalla stessa distanza 10 . Rispetto a c VA, gli acidi grassi a catena lunga sono ancora meno volatili, con pressioni di vapore inferiori a 0,001 mmHg a 25 ° C 11 . La volatilità intrinsecamente bassa di odoranti di acido grasso a catena lunga, che impedisce un&#39;efficace presentazione all&#39;antenna viaSistemi di consegna convenzionali, probabilmente rappresentavano i risultati falsi negativi 10 . Questa incoerenza evidenzia l&#39;inadeguatezza dei sistemi convenzionali di erogazione in presenza di odoranti a bassa volatilità. È stato dimostrato in precedenza che l&#39;efficace erogazione di odori cuticolari di mosca richiede una stretta vicinanza tra l&#39;origine dell&#39;odore e il tessuto bersaglio 6 . Pertanto, per caratterizzare in modo completo gli effetti dei feromoni biologicamente attivi, imitando la distanza da cui sono probabilmente incontrati dalle mosche di frutta nella natura 12 , 13 , abbiamo convenuto che la distanza minima deve essere accordata ad alta priorità nella nostra procedura. Il nostro metodo offre ulteriori vantaggi, compresa la compatibilità con le righe e le tecniche di elettrofisiologia standard. Le impostazioni preliminari di rigature richiedono una modifica minima per ospitare questo protocollo e la maggior parte dei passaggi SSR richiedono solo piccole regolazioni. QuestoRende la nostra tecnica facilmente accessibile ai ricercatori esperti in SSR. Inoltre, la nostra tecnica consente la presentazione di odoranti a bassa volatilità con instabilità e offset, correlando la distribuzione dello stimolo con la risposta neuronale. Infine, il layout hardware facilita gli scambi rapidi tra le cartucce odoranti, accelerando la raccolta dei dati su un intervallo di dosaggio desiderato. Iniziamo esaminando la preparazione di elettrodi di riferimento e di registrazione, soluzione adulti Hemolymph-Like (AHL), cartucce di erogazione odoranti e il corrispondente olfattometro. Discuteremo poi la preparazione delle soluzioni odoranti dell&#39;acido palmitoleico, seguita dalla preparazione della mosca per la registrazione. Continuiamo a considerare i criteri per la selezione di un sensitivo trichoide per registrare e esaminare più approfonditamente il posizionamento della cartuccia odorante prima di presentare i dati rappresentativi acquisiti utilizzando questo metodo. Infine, concludiamo esplorando le applicazioni utili di questa tecnicaUe, alcuni problemi incontrati e le loro soluzioni.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Prep Setup &amp;amp; Miscellaneous Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette Puller Instrument&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>P97</td><td>Pipette Puller</td></tr><tr><td>Borosilicate Glass Capillaries</td><td>World Precision Instruments&lt;br/&gt; Sarasota FL USA</td><td>1B100F-4</td><td>to make holding rods</td></tr><tr><td>Aluminosilicate Glass Capillaries&amp;nbsp;</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>AF100-64-10</td><td>to make electrodes</td></tr><tr><td>Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific&lt;br/&gt; Pittsburgh PA USA</td><td>12-550-143</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Permanent Double Sided Tape</td><td>Scotch&lt;br/&gt; St. Paul MN USA</td><td>NA</td><td>for fly-prep station</td></tr><tr><td>Upright microscope</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>BX51</td><td>for recording rig</td></tr><tr><td>Plastalina modeling clay</td><td>Van Aken&lt;br/&gt; North Charleston SC USA</td><td>B0019QZMQQ</td><td>for prep station and to stablize the holding rod</td></tr><tr><td>Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Unit with SFCA Membrane, 0.45 mm</td><td>Nalgene&lt;br/&gt; Rochester NY USA</td><td>#156-4045</td><td>to sterilize AHL solution</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Cartridge Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L pipette tip&amp;nbsp;</td><td>VWR&lt;br/&gt; Radnor PA USA</td><td>53508-810</td><td>to make odor cartridges and fly prep</td></tr><tr><td>Filter Paper</td><td>Whatman&lt;br/&gt; Maidstone Kent UK</td><td>740-E</td><td>to make odor cartridges&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Vacuum Desiccator&amp;nbsp;</td><td>Cole-Parmer&lt;br/&gt; Vernon Hills IL USA</td><td>VX-06514-30</td><td>to vaporize ethanol solvent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Odorant Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cis-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#10009871 (CAS # 373-49-9)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>trans-palmitoleic acid</td><td>Cayman Chemical&lt;br/&gt; Ann Arbor MI USA</td><td>#9001798 (CAS # 10030-73-6)</td><td>Or47b odorant</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Spectrum Chemical MFG.&amp;nbsp;&lt;br/&gt; New Brunswick NJ USA</td><td>E1028-500MLGL</td><td>to dilute palmitoleic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Rig Setup Materials&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odorant Cartridge Micromanipulator</td><td>Siskiyou&lt;br/&gt; Grants Pass OR USA</td><td>MX130R</td><td>to position the olfactometer</td></tr><tr><td>Flow Vision software&amp;nbsp;</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>FLOWVISIONSC</td><td>software to control flow rate</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-2SLPM-D</td><td>to control the flow rate for humidified air</td></tr><tr><td>Mass Controller</td><td>Alicat&lt;br/&gt; Tuscon AZ USA</td><td>MC-500SCCM-D</td><td>to control the flow rate for odor stimulation</td></tr><tr><td>Clampex</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>Data acquisition software</td></tr><tr><td>Air delivery tube</td><td>Ace Glass&lt;br/&gt; Vineland NJ USA</td><td>8802-936&amp;nbsp;</td><td>to deliver humidified air</td></tr><tr><td>50X objective lens&amp;nbsp;</td><td>Olympus&lt;br/&gt; Shinjuku Tokyo Japan</td><td>LMPLFL50X</td><td>recording rig</td></tr><tr><td>Clampfit 10</td><td>Molecular Devices&lt;br/&gt; Sunnyvale CA USA</td><td>Ver. 10.4</td><td>software for spike analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Igor Pro 6</td><td>WaveMetrics&lt;br/&gt; Lake Oswego OR USA</td><td>Ver. 6.37</td><td>software for data analysis&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Audio Monitor</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXB-AUDIS-08B</td><td>Aurally reports individual spikes</td></tr><tr><td>Extracellular Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>NPIEXT-02F</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Valve Controller</td><td>Warner Instruments&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>VC-8</td><td>to control the opening of the valve for odor stimulation</td></tr><tr><td>Recording Electrode Micromanipulator</td><td>Sutter Instruments&lt;br/&gt; Novato CA USA</td><td>MP-285</td><td>to position recording electrode</td></tr><tr><td>Headstage Amplifier</td><td>ALA Scientific Instruments&lt;br/&gt; Farmingdale NY USA</td><td>EQ-16.0008</td><td>to increase the amplitude of electrical signals</td></tr><tr><td>Oscilloscope</td><td>Tektronix&lt;br/&gt; Beaverton OR USA</td><td>TDS2000C</td><td>Visual report of individual spikes</td></tr></tbody></table>

electrophysiological recording from drosophila trichoid sensilla in response to odorants of low volatility

Gli insetti si affidano al loro senso di odore per guidare una vasta gamma di comportamenti critici per la loro sopravvivenza, come la ricerca di cibo, l&#39;evasione dei predatori, l&#39;oviposizione e l&#39;accoppiamento. Le sostanze chimiche di varie volatilità variabili sono state identificate come odoranti naturali che attivano gli insetti del recettore del olfattivo (ORN). Tuttavia, studiare le risposte olfattive agli odoranti a bassa volatilità è stato ostacolato dall&#39;incapacità di effettivamente presentare tali stimoli usando metodi convenzionali di erogazione. Qui descriviamo una procedura che consente la presentazione efficace di odoranti a bassa volatilità per la registrazione in singola sensillazione in vivo (SSR). Minimizzando la distanza tra l&#39;origine dell&#39;odore e il tessuto bersaglio, questo metodo consente l&#39;applicazione di odori biologicamente salienti ma finora inaccessibili, compreso l&#39;acido palmitoleico, un feromone stimolante con un effetto dimostrato sugli ORN coinvolti nel corteggiamento e nel comportamento di accoppiamento 1 .La nostra procedura offre quindi un nuovo modo di analizzare una serie di odoranti a bassa volatilità per lo studio dell&#39;intelligenza degli insetti e della comunicazione feromonica.

La nostra tecnica è stata applicata con successo per determinare l&#39;efficacia relativa degli isomeri dell&#39;acido palmitoleico trans ( Figura 5A ) e cis ( Figura 5B ). I nostri dati rappresentativi dimostrano che l&#39;acido trans- palmitoleico è un ligando più efficace per Or47b ORNs rispetto alla isoforma cis ( Figura 5C ). Un singolo neurone è stato re...

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Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

L&#39;obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare come presentare gli odoranti a bassa volatilità per la registrazione singolo-sensillare da parte dei neuroni del recettore olfattivo Drosophila che rispondono ai feromoni cuticolari a catena lunga.

Registrazione elettrofisiologica da<em&gt; Drosophila</em&gt; Senso Trichoide in risposta a Odoranti di bassa volatilità

Insects rely on their sense of smell to guide a wide range of behaviors that are critical for their survival, such as food-seeking, predator avoidance, ...

electrophysiological-recording-from-drosophila-trichoid-sensilla

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

8.8K Views.  University of California San Diego.  L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di dimostrare come presentare gli odoranti a bassa volatilità per la registrazione singolo-sensillare da parte dei neuroni del recettore olfattivo Drosophila che rispondono ai feromoni cuticolari a catena lunga. 

Video: Electrophysiological Recording from Drosophila Trichoid Sensilla in Response to Odorants of Low Volatility

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Ricerca

Neuroscienze

High-resolution Measurement of Odor-Driven Behavior in Drosophila Larvae

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral paradigm, the experimenter usually assumes that the rapid diffusion of odorant molecules from the source leads to the creation of a stable gradient in the dish. To establish a quantitative correlation between sensory inputs and behavioral responses, it is necessary to achieve a more thorough characterization of the odorant stimulus conditions. In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

In this video article, we describe a new method allowing the construction of odorant gradients with stable and controllable geometries. We briefly illustrate how these gradients can be used to screen for olfactory defects (full and partial anosmia) and to study more subtle features of chemotaxis behavior.

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Olfactory responses in Drosophila larvae have been traditionally studied in Petri dishes comprising a single peripheral odor source. In this behavioral ...

Biologia

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory bulb1-5. Olfactory information in the external world is transmitted to the antennal lobe by olfactory sensory neurons (OSNs), which segregate to distinct regions of neuropil called glomeruli according to the specific olfactory receptor they express. Here, OSN axons synapse with both local interneurons (LNs), whose processes can innervate many different glomeruli, and projection neurons (PNs), which convey olfactory information to higher olfactory brain regions.
Optical imaging of the activity of OSNs, LNs and PNs in the antennal lobe - traditionally using synthetic calcium indicators (e.g. calcium green, FURA-2) or voltage-sensitive dyes (e.g. RH414) - has long been an important technique to understand how olfactory stimuli are represented as spatial and temporal patterns of glomerular activity in many species of insects6-10. Development of genetically-encoded neural activity reporters, such as the fluorescent calcium indicators G-CaMP11,12 and Cameleon13, the bioluminescent calcium indicator GFP-aequorin14,15, or a reporter of synaptic transmission, synapto-pHluorin16 has made the olfactory system of the fruitfly, Drosophila melanogaster, particularly accessible to neurophysiological imaging, complementing its comprehensively-described molecular, electrophysiological and neuroanatomical properties2,4,17. These reporters can be selectively expressed via binary transcriptional control systems (e.g. GAL4/UAS18, LexA/LexAop19,20, Q system21) in defined populations of neurons within the olfactory circuitry to dissect with high spatial and temporal resolution how odor-evoked neural activity is represented, modulated and transformed22-24.
Here we describe the preparation and analysis methods to measure odor-evoked responses in the Drosophila antennal lobe using G-CaMP25-27. The animal preparation is minimally invasive and can be adapted to imaging using wide-field fluorescence, confocal and two-photon microscopes.

Calcium Imaging of Odor-evoked Responses in the Drosophila Antennal Lobe

We describe an established technique to measure and analyze odor-evoked calcium responses in the antennal lobe of living Drosophila melanogaster.

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

The antennal lobe is the primary olfactory center in the insect brain and represents the anatomical and functional equivalent of the vertebrate olfactory ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the researcher to measure gustatory responses directly and quantitatively, reflecting the sensory input that the insect nervous system receives from taste stimuli in its environment. This protocol outlines all key steps in performing this technique. The critical steps in assembling an electrophysiology rig, such as selection of necessary equipment and a suitable environment for recording, are delineated. We also describe how to prepare for recording by making appropriate reference and recording electrodes, and tastant solutions. We describe in detail the method used for preparing the insect by insertion of a glass reference electrode into the fly in order to immobilize the proboscis. We show traces of the electrical impulses fired by taste neurons in response to a sugar and a bitter compound. Aspects of the protocol are technically challenging and we include an extensive description of some common technical challenges that may be encountered, such as lack of signal or excessive noise in the system, and potential solutions. The technique has limitations, such as the inability to deliver temporally complex stimuli, observe background firing immediately prior to stimulus delivery, or use water-insoluble taste compounds conveniently. Despite these limitations, this technique (including minor variations referenced in the protocol) is a standard, broadly accepted procedure for recording Drosophila neuronal responses to taste compounds.

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

This protocol describes extracellular recording of the action potential responses fired by labellar taste neurons in Drosophila.

Elettrofisiologici Registrazione da<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila express gustatory receptors1,2, ion channels3-6, and ionotropic receptors7 that are involved in the detection of volatile and non-volatile sensory cues. These neurons directly contact tastants such as food, noxious substances and pheromones and therefore influence many complex behaviors such as feeding, egg-laying and mating. Electrode recordings and calcium imaging have been widely used in insects to quantify the neuronal responses evoked by these tastants. However, electrophysiology requires specialized equipment and obtaining measurements from a single taste sensillum can be technically challenging depending on the cell-type, size, and position. In addition, single neuron resolution in Drosophila can be difficult to achieve since taste sensilla house more than one type of chemosensory neuron. The live calcium imaging method described here allows responses of single gustatory neurons in live flies to be measured. This method is especially suitable for imaging neuronal responses to lipid pheromones and other ligand types that have low solubility in water-based solvents.

Measuring Physiological Responses of Drosophila Sensory Neurons to Lipid Pheromones Using Live Calcium Imaging

The forelegs and proboscis of Drosophila contain a rich repertoire of gustatory sensory neurons. Here, we present a method using calcium imaging to measure physiological responses from sensory neurons in the foreleg and proboscis of live flies upon exogenous application of a gustatory pheromone.

Misurare risposte fisiologiche di<em&gt; Drosophila</em&gt; Neuroni sensoriali a Lipid feromoni utilizza Live Calcio Imaging

Unlike mammals, insects such as Drosophila have multiple taste organs. The chemosensory neurons on the legs, proboscis, wings and ovipositor of Drosophila ...

Immunologia e infezioni

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To complicate matters even further, the odors detected by the insect nervous system usually are not single compounds but mixtures whose composition and concentration ratios vary. This leads to an almost infinite amount of different olfactory stimuli which have to be evaluated by the nervous system.
To understand which aspects of an odor stimulus determine its evaluation by the fly, it is therefore desirable to efficiently examine odor-guided behavior towards many odorants and odor mixtures. To directly correlate behavior to neuronal activity, behavior should be quantified in a comparable time frame and under identical stimulus conditions as in neurophysiological experiments. However, many currently used olfactory bioassays in Drosophila neuroethology are rather specialized either towards efficiency or towards resolution.
Flywalk, an automated odor delivery and tracking system, bridges the gap between efficiency and resolution. It allows the determination of exactly when an odor packet stimulated a freely walking fly, and to determine the animal&#180;s dynamic behavioral reaction.

High-resolution Quantification of Odor-guided Behavior in Drosophila melanogaster Using the Flywalk Paradigm

The automated tracking system Flywalk is used for high-resolution quantification of odor-guided behavior in Drosophila melanogaster.

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Utilizzo della<em&gt; Flywalk</em&gt; Paradigm

In their natural environment, insects such as the vinegar fly Drosophila melanogaster are bombarded with a huge amount of chemically distinct odorants. To ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method described here enables the investigator to measure long-lasting (from minutes to hours) high-quality intracellular responses from single Drosophila R1-R6 photoreceptors and Large Monopolar Cells (LMCs) to light stimuli. Because the recording system has low noise, it can be used to study variability among individual cells in the fly eye, and how their outputs reflect the physical properties of the visual environment. We outline all key steps in performing this technique. The basic steps in constructing an appropriate electrophysiology set-up for recording, such as design and selection of the experimental equipment are described. We also explain how to prepare for recording by making appropriate (sharp) recording and (blunt) reference electrodes. Details are given on how to fix an intact fly in a bespoke fly-holder, prepare a small window in its eye and insert a recording electrode through this hole with minimal damage. We explain how to localize the center of a cell's receptive field, dark- or light-adapt the studied cell, and to record its voltage responses to dynamic light stimuli. Finally, we describe the criteria for stable normal recordings, show characteristic high-quality voltage responses of individual cells to different light stimuli, and briefly define how to quantify their signaling performance. Many aspects of the method are technically challenging and require practice and patience to master. But once learned and optimized for the investigator's experimental objectives, it grants outstanding in vivo neurophysiological data.

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Sharp microelectrodes enable accurate electrophysiological characterization of photoreceptor and visual interneuron output in living Drosophila. Here we show how to use this method to record high-quality voltage responses of individual cells to controlled light stimulation. This method is ideal for studying neural information processing in insect compound eyes.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Voltage responses of insect photoreceptors and visual interneurons can be accurately recorded with conventional sharp microelectrodes. The method ...

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an excellent model system for such investigations due to its complex behaviors, powerful genetic techniques, and compact nervous system. Laboratory behavioral assays have long been used with Drosophila to simulate properties of the natural environment and study the neural mechanisms underlying the corresponding behaviors (e.g. phototaxis, chemotaxis, sensory learning and memory)1-3. With the recent availability of large collections of transgenic Drosophila lines that label specific neural subsets, behavioral assays have taken on a prominent role to link neurons with behaviors4-11. Versatile and reproducible paradigms, together with the underlying computational routines for data analysis, are indispensable for rapid tests of candidate fly lines with various genotypes. Particularly useful are setups that are flexible in the number of animals tested, duration of experiments and nature of presented stimuli. The assay of choice should also generate reproducible data that is easy to acquire and analyze. Here, we present a detailed description of a system and protocol for assaying behavioral responses of Drosophila flies in a large four-field arena. The setup is used here to assay responses of flies to a single olfactory stimulus; however, the same setup may be modified to test multiple olfactory, visual or optogenetic stimuli, or a combination of these. The olfactometer setup records the activity of fly populations responding to odors, and computational analytical methods are applied to quantify fly behaviors. The collected data are analyzed to get a quick read-out of an experimental run, which is essential for efficient data collection and the optimization of experimental conditions.

Olfactory Behaviors Assayed by Computer Tracking Of Drosophila in a Four-quadrant Olfactometer

We describe here a behavioral setup and data analysis method for assaying olfactory responses of up to 100 vinegar flies (Drosophila melanogaster). This system may be used with single or multiple olfactory stimuli, and adaptable for optogenetic activation or silencing of neuronal subsets.

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di<em&gt; Drosophila</em&gt; In un Olfattometro quattro quadranti

A key challenge in neurobiology is to understand how neural circuits function to guide appropriate animal behaviors. Drosophila melanogaster is an ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Sensillum singole registrazioni per Locust Palp sensilli Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Un nuovo metodo per una migliore analisi dell'attività dei neuroni del gusto degli insetti

Base Recording: A Technique for Analyzing Responses of Taste Neurons in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential food source, compounds from the food source enter through the pore and activate neurons within. For over 50 years, these responses have been recorded using a technique called tip recording. However, this method has major limitations, including the inability to measure neural activity before or after stimulus contact and the requirement for tastants to be soluble in aqueous solutions. We describe here a technique that we call base recording, which overcomes these limitations. Base recording allows the measurement of taste neuron activity before, during, and after the stimulus. Thus, it allows extensive analysis of OFF responses that occur after a taste stimulus. It can be used to study hydrophobic compounds such as long-chain pheromones that have very low solubility in water. In summary, base recording offers the advantages of single-sensillum electrophysiology as a means of measuring neuronal activity - high spatial and temporal resolution, without the need for genetic tools - and overcomes key limitations of the traditional tip recording technique.

Autore in primo piano: Progressi nella chemiorecezione: dai recettori degli odori degli insetti agli RNA non codificanti

A rarely used method of electrophysiological recording, base recording, allows analysis of features of taste coding that cannot be examined by conventional recording methods. Base recording also allows the analysis of taste responses to hydrophobic stimuli that cannot be studied using traditional electrophysiological methods.

Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila

Insects taste the external world through taste hairs, or sensilla, that have pores at their tips. When a sensillum comes into contact with a potential ...

Registrazione elettrofisiologica da

Riepilogo

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Registrazioni Sensillum singolo in Insetti Drosophila melanogaster E Anopheles gambiae

Ad alta risoluzione misurazione del comportamento Odor-Driven in Larve Drosophila

Imaging di calcio di cattivi odori evocati risposte nel Drosophila Lobe antenne

Elettrofisiologici Registrazione da

Misurare risposte fisiologiche di

Ad alta risoluzione quantificazione del comportamento Odor-guidata

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di

Comportamenti olfattive analizzati da Computer di monitoraggio di

Sensillum singole registrazioni per Locust Palp sensilli Basiconica

Registrazione di base: una tecnica per analizzare le risposte dei neuroni del gusto in Drosophila