The authors thank Masaki Yoda and Elise Lamar for critical reading of the manuscript, Kazumasa Takenouchi for help with histology, Mari Fujiwara for help with microscopy and Makoto Morikawa for help in photographing human and mouse auditory ossicles.

Tutte le procedure sugli animali eseguiti in questo studio sono approvati dalla Keio University Istituzionale cura degli animali e del Comitato uso (IACUC - numero di omologazione: 09221) e seguire le linee guida istituzionali sulla sperimentazione animale presso la Keio University per l&#39;utilizzo degli animali nella ricerca. campioni umani sono stati isolati da un cadavere donato al Dipartimento di Anatomia, Keio University School of Medicine, e sono stati utilizzati in conformità con le normative istituzionali. 1. Isolamento di Auditory Bulla e Capsule <ol><li> Euthanize topi in un vaso contenente una piattaforma sopra asciugamani di carta imbevuti di isoflurano o sevoflurano fino ventilazione respiratoria cessa per più di un minuto e quindi eseguire dislocazione cervicale. Fare attenzione a evitare il contatto diretto dei topi con i tovaglioli di carta imbevuti. </li><li> Effettuare una piccola incisione trasversale al lato dorsale del collo e tirare la pelle a parte verso la testa e la coda utilizzando entrambe le mani per esporre sottostante mu collotessuto SCLE. </li><li> Decapitare topi alla regione cervicale con 14 cm forbici chirurgiche taglienti. </li><li> pelle a buccia completamente verso il naso. Tagliare tutta la pelle insieme con il muso e incisivi. </li><li> Inserire le forbici in bocca e tagliare i muscoli masseteri su entrambi i lati. </li><li> Aprire la ganascia attentamente e rimuovere la lingua e la mascella inferiore insieme. </li><li> Utilizzando forbici affilate, cranio spaccato e base del cranio in due metà lungo il piano sagittale mediano (Figura 1A, B). </li><li> Utilizzando pinze, rimuovere gli emisferi cerebrali e cerebellari e del tronco cerebrale. La bulla uditivo e la capsula si trovano lateralmente al cervelletto e tronco cerebrale. Si noti che la bolla uditiva è anche lateralmente alla capsula uditivo (Figura 1C, D). </li><li> Sezionare la bulla e capsula con il circostante ossa del cranio (Figura 1E). </li><li> Trasferire la provetta in un piatto contenente fosfato-Buffered Saline (PBS) pH 7,4 a temperatura ambiente. </li><li> Under una dissezione microscopio binoculare, usare il forcipe per separare le ossa e le forbici per tagliare circondano il confine allentato attorno alla bulla e la capsula (Figura 1F). Le ossa che circondano rimossi sono il basioccipital (confine ventrale), exoccipital (ventro-posteriore confine), sopraoccipitale (bordo posteriore), interparietale, parietale (dorsale di confine), squammoso (confine dorso-anteriore), alisphenoid (bordo anteriore), e basisfenoide (confine antero-ventrale) ossa. Si noti che il processo styliform (Sp), che sostiene l&#39;apertura timpanica del tubo di Eustachio 41, è distinto dal processo stiloideo dell&#39;osso temporale. </li></ol> 2. Isolamento di Auditory Ossicini: martello, incudine e la staffa <ol><li> Martello <ol><li> Con entrambe le piccole forbici e pinze, rimuovere la parte del canale laterale uditivo esterno al tympanicus solco in modo che la membrana timpanica è visibile (Figura 2A, B). </li><li> Rimuovere parte della membrana timpanica e l&#39;osso timpanica vicino al malleal processus brevis (apofisi orbicolare, vedi la discussione), sia a livello ventrale (tratteggiata) e posteriore (#) pareti (Figura 2C). Il muscolo tympani martello e tensore dovrebbe ora essere esposta (Figura 2D, E). </li><li> Sollevare il martello (Figura 2F) e tagliare il muscolo tensore del timpano con il bordo smussato di un ago G 27 (Figura 2G). Si noti che il manubrio malleal attacca saldamente alla membrana timpanica, come si vede in altri mammiferi. </li><li> Staccare la membrana timpanica con cura dal manubrio, che è fragile. Rimuovere l&#39;osso timpanica per rivelare i tre ossicini. </li><li> Dislocare il martello dal incudine in corrispondenza della giunzione degli ossicini (Figura 2H). </li><li> Isolare il martello dalla frattura del processo anteriore al goniale. </li></ol></li><li> Incudine e staffe <ol><li> isolare tegli incudine tagliando il legamento posteriore del dell&#39;incudine a breve crus (Figura 3A). </li><li> Isolare staffa tagliando l&#39;arteria stapediale prossimità della staffa con il bordo smussato di un ago G 27 (Figura 3B, C). Se necessario, tagliare il tendine del muscolo stapediale il processo muscolare della staffa con l&#39;ago. </li><li> Inserire un ago per cucire (o uno spillo marcatura) nei forame otturatorio della staffa e sollevare la staffa. Dopo aver rimosso la staffa, l&#39;apertura finestra ovale deve essere chiaramente visibile (Figura 3D). </li></ol></li></ol> 3. Integrazione di Auditory Bulla e Capsule <ol><li> Preparazione per l&#39;incorporamento in blocchi di paraffina <ol><li> Isolare la bulla e la capsula come descritto nella Sezione 1. </li><li> Tagliare l&#39;estremità anteriore della bolla (il processo styliform) al largo con le forbici, immergere la bulla e la capsula nel 4% paraformaldeide (PFA) in PBS a 4 °C, e consentire fissativo per entrare nel bulla. Se l&#39;aria rimane intrappolata nella bolla, rimuoverla con un ago e la siringa. Lasciare la bulla e capsule nel fissativo a 4 ° CO / N su un rotatore tubo. Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato con cura. </li><li> Risciacquare una volta con PBS. </li><li> Decalcificare bulla e capsule per una settimana a 4 ° C in 10% etilendiamminotetraacetico sale disodico diidrato (EDTA-2Na), 100 base mM Tris, pH 7,0, in un tubo 2 mL. Modificare il buffer di ogni altro giorno. </li><li> Risciacquare una volta con PBS. I campioni possono essere conservati in etanolo al 70% in acqua a 4 ° C. Facoltativamente, il trasferimento al 70% di etanolo attraverso una serie graduata di alcool (30%, 50%, 70% in acqua). </li><li> Su un processore tessuto, disidrata esemplari in una serie graduata di soluzioni di etanolo (70%, 2x 95%, 3x 100%, ogni 1 h), xilene (4x, ogni 1 ora a 40 ° C), e infiltrarsi provini con cera di paraffina fusa 42. Opzionalmente, xilene sostituto con clearin tessuto commercialesoluzione g (per esempio, Histo-Clear). </li><li> Scaricare esemplari dal processore, e rimuoverli dalle loro cassette. </li><li> Su un sistema console tessuto embedding, luogo campioni in stampi riempiti di paraffina fusa. Procedere alla embedding (sezione 4). </li></ol></li><li> Preparazione per l&#39;incorporamento in blocchi congelati (metodo film di Kawamoto) 43 <ol><li> Isolare la bulla e la capsula come descritto nella Sezione 1. </li><li> Tagliare l&#39;estremità anteriore della bolla (il processo styliform) con forbici, immergere il bulla e capsule in fissativo (2% o 1% PFA anziché 4% in PBS per preservare antigenicità) a 4 ° C. Se l&#39;aria è intrappolato in bulla, rimuoverlo usando un ago e la siringa. Lasciare la bulla e capsule nel fissativo a 4 ° CO / N su un rotatore tubo. </li><li> Lavare bulla e la capsula rapidamente in PBS e subito immergere in compound crio-embedding liquido a 4 ° C. </li><li> Importante: rimuovere le bolle d&#39;aria eventualmente in mezzoed orecchio esterno attraverso l&#39;aspirazione da un ago, e aggiungendo il composto incorporamento con una pinza. Procedere alla embedding (sezione 4). </li></ol></li></ol> 4. Orientamento del campione e Embedding NOTA: L&#39;intero bulla e la capsula devono essere disposti in un particolare orientamento durante l&#39;incorporamento di tagliare sezioni desiderate. Le procedure descritte di seguito vengono utilizzate per la sezione martello in diversi orientamenti. <ol><li> Longitudinale (parasagittale) sezionamento del martello <ol><li> Mettere la parte laterale della bolla o condotto uditivo esterno basso in paraffina calda (o di composti crio-embedding). Regolare l&#39;orientamento in modo che il collo e trasversale lamina del martello sono parallele al fondo orizzontale del piatto incorporamento (Figura 4A - C). Si noti che la membrana timpanica è inclinata di un angolo di circa 30 ° rispetto alla verticale nella testa del mouse (Figura 4A; la figura 59 in Kampen <sup&gt; 44). </li></ol></li><li> Sezionamento orizzontale del martello <ol><li> Posizionare la cresta dorsale orizzontalmente in paraffina calda (o di composti crio-embedding). Regolare l&#39;orientamento della bolla e della capsula in modo che il collo e trasversale lamina del martello sono perpendicolari al fondo del piatto incorporamento (Figura 4D - F). </li></ol></li><li> Sezionamento frontale (sezioni) del manubrio e della membrana timpanica 5 <ol><li> Posizionare il manubrio malleal in paraffina calda (o di composti crio-embedding) tale che è perpendicolare al fondo del piatto incorporamento. </li></ol></li><li> Raffreddare il blocco a temperature adeguate per indurire paraffina su un sistema di console tessuto embedding (in alternativa, composto crio-embedding in ghiaccio / vasca esano secco). </li><li> blocco dei tessuti di processo e sezioni tagliate utilizzando procedure di routine. Ad esempio, le sezioni macchia paraffina con ematossilina e eosina (H &amp; #38; E), safranina O (per la cartilagine), o per il tartrato resistente attività fosfatasi acida (TRAP) (per osteoclasti) 3, o mediante immunoistochimica. Criosezioni Undecalcified sono adatti per l&#39;etichettatura delle ossa utilizzando fluorocromi 14, alizarin colorazione rosso per il calcio, ed immunofluorescenza 42. </li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Qui, vi presentiamo un metodo utile per isolare la bulla uditivo e la capsula nei topi postnatale. Prima di P12, i tessuti sono fragili e possono essere danneggiati durante l&#39;isolamento. Dopo P12, la bulla uditivo e capsule possono essere facilmente isolati dai tessuti circostanti. Sezionare la bulla dalla testa prima di sezionamento ha diversi vantaggi. In primo luogo, la cavitazione e la crescita della bolla uditiva postnatale si verificano più attivamente dal P6 in poi e sono completi da P14 50. Il tessuto mesenchimale tra la membrana timpanica e la parete cocleare viene sostituita da aria attraverso il processo di cavitazione. L&#39;aria risultante nella cavità dell&#39;orecchio medio può impedire il contatto tra i tessuti e liquidi durante la fissazione, decalcificazione e incorporamento. E &#39;più facile per eliminare l&#39;aria dal bulla uditivo isolato tagliando la fine (processo styliform) anterior piuttosto che cercare di farlo nel bulla non isolato. In secondo luogo, l&#39;orientamento del martello (e la membrana timpanica) non è verticalenella testa. È quindi più facile da parte del martello in piani desiderati incorporando isolate bulla uditivo e capsule in un determinato orientamento. Una volta isolato, bulla uditivo e le capsule sono utili per numerose analisi. Ad esempio, alta risoluzione a raggi X micro-CT può rivelare osso microstruttura morfologia come capillari osteogeniche del martello 14. Il stereofluorescence dissezione microscopio è un potente strumento per visualizzare le strutture nella valutazione topi indicatori che esprimono proteine fluorescenti nell&#39;orecchio medio o interno 33. Inoltre, vari in vivo o ex vivo fluorescenza metodi di etichettatura e di tutta la rilevazione immunofluorescenza monte possono essere intraprese. Luce microscopia a fluorescenza con è utile anche per l&#39;analisi tridimensionale 51. Anche se qui non descritto, diverse strutture anatomiche associate con la bolla uditivo e capsule come nervi periferici, vasi sanguigni, ela membrana timpanica nell&#39;orecchio medio può anche essere valutata utilizzando questo protocollo. Si noti che la paraffina sezionamento richiede la decalcificazione di tessuti ossei prima di incorporare e quindi non consentire l&#39;analisi di mineralizzazione. Al contrario, il metodo pellicola Kawamoto 43 utilizzato per preparare sezioni congelate può essere eseguita senza la decalcificazione ed è adatto per studi di mineralizzazione utilizzando tecniche in osso-etichettatura vivo o schegge speciali come alizarina colorazione. condizioni di Cryo-sezionamento devono essere ottimizzati in funzione in base all&#39;età del mouse. Ad esempio, una temperatura meno fredda all&#39;interno della camera criostato è raccomandato per esemplari più vecchi mouse per minimizzare i danni alle sezioni. Nel topo, il termine corretto per la sporgenza di primo piano semi-sferica del martello è &quot;apofisi orbicolare&quot;. Tuttavia, il termine &quot;processus brevis&quot; è stato ampiamente utilizzato per indicare all&#39;apofisi orbicolare per più thun ventennio, in particolare tra il mouse biologi dello sviluppo 16,20,22-25. &quot;Processus brevis&quot;, originariamente riferito al processo laterale (processus lateralis), che si differenzia dal apofisi orbicolare. Negli esseri umani, un processo laterale simile a una leggera sporgenza conica costituisce la linea generale di attacco alla membrana timpanica, che si estende dal manubrio (non visibile in figura 6B, vista mediale). Nei topi, il processo laterale è anche una proiezione del manubrio all&#39;estremità opposta al umbone 48. I pars flaccida della membrana timpanica è al di sopra del processo laterale del martello. apofisi orbicolare non è evidente nel martello umano.

I tre ossicini dell&#39;orecchio medio, vale a dire i martello, incudine e staffa, formano una catena uditivo-specific mammiferi che trasmette il suono dalla membrana timpanica all&#39;orecchio interno, o coclea 1,2. La funzione uditiva può essere valutata in topi misurando Auditory Brainstem Response (ABR) soglie 3-6, e le vibrazioni del martello dietro la membrana timpanica può essere monitorato tramite Laser Doppler Vibrometry (LDV) 7. Grazie alla combinazione di ABR, LDV, e misure di distorsione del prodotto Otoacoustic Emission (DPOAE), ipoacusia trasmissiva può essere discriminato da compromissione neurosensoriale 8. Modelli animali di condizioni per le orecchie sono necessari, data l&#39;importanza di ascoltare e di salute orecchio per il benessere dei pazienti di tutte le età. Ad esempio, l&#39;otite media è una infezione dell&#39;orecchio molto comune visto nei neonati e nei bambini umani, e gravi, otite media acuta e le sue complicazioni può verificarsi se il Condizione non è trattato con antimicrobici appropriati 9. Modelli murini di otite media potrebbero rivelarsi utili per la comprensione della patogenesi e nello sviluppo di trattamenti 10,11. Ossicini murini, che (ad eccezione della parte goniale del martello) sono formate da encondrale 12,13, sono molto importanti per lo studio del metabolismo osseo e la morfogenesi. Innanzitutto, le loro piccole dimensioni permette l&#39;analisi ad alta risoluzione di ossa con periostio intatti utilizzando raggi X o la microscopia a fluorescenza 14. In secondo luogo, il metabolismo osseo aberranti, come eccessiva o carente riassorbimento osseo, o interazioni con problemi tra le cellule ossee 15, può essere analizzato come un potenziale contributo alla perdita dell&#39;udito 3,4,7. In terzo luogo, anormale morfogenesi ossicino è riportato in diversi topi gene-deficienti, come gli animali privi Hoxa2 16-19, 20-22 Msx1, Prrx1 23, Goosecoid(GSC) 24,25, Bapx1 13, Tshz1 26, Dusp6 (Mkp3) 27, Noggin (Nog) 28, FGFR1 29, recettore degli ormoni tiroidei (THRA, Thrb) 5, Bcl2 30 e altri 1,31, o nei topi che iperesprimono Hoxa2 32. Infine, nonostante le loro piccole dimensioni, le strutture associate a ossicini come i muscoli e le articolazioni 33 34,35 sono accessibili. ossicini del mouse sono più piccoli ossicini umani, ma è da notare che l&#39;orecchio centrale del mouse non è una versione in miniatura della sua controparte umana. Ad esempio, nei topi, l&#39;arteria stapediale, che passa attraverso l&#39;anello della staffa, persiste per tutta la vita 36, che negli esseri umani, l&#39;arteria stapediale embrionale scompare durante la gestazione. Inoltre, la morfologia del martello del mouse differisce da quello di the ossa umane (vedi figura 6). Nei topi, l&#39;uditivo (timpanica) bulla racchiude la cavità dell&#39;orecchio medio piena d&#39;aria, mentre negli esseri umani, le cellule mastoidee composto da osso trabecolare nell&#39;osso temporale ospita gli ossicini, piuttosto che una bulla 37. In entrambe le specie, la capsula uditivo (capsula otica, labirinto osseo) racchiude la coclea e canali semicircolari dell&#39;orecchio interno. Biologia comparativa ed evolutiva dell&#39;orecchio medio è stato ampiamente rivisto 38-40. Il protocollo di seguito prima spiega come sezionare la bulla uditivo e la capsula, che consistono principalmente l&#39;orecchio medio e orecchio interno, rispettivamente. Questo protocollo dimostra anche come isolare il martello, incudine e staffa dal bulla uditivo. Infine, si mostra come orientare la bulla uditivo e capsule per l&#39;incorporamento, in preparazione per il sezionamento del tessuto di ossicini uditivi.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Tools/Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paper towel</td><td>Daio Paper Corporation</td><td>703347</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Glass Jar</td><td>Various</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>14 cm surgical scissors</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>91400-14</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Extra fine scissors-straight</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>14084-08</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Fine Forceps Angled 45&lt;b&gt;&amp;deg;&lt;/b&gt;</td><td>Fine Science Tools (F.S.T.)</td><td>11063-07</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td>for routine dissection</td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>Nikon</td><td>SMZ18</td><td>for movies&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Injection needle 27 G</td><td>TERUMO</td><td>NN-2719S</td><td></td></tr><tr><td>Syringe (1 mL)</td><td>TERUMO</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Marking Pin</td><td>Various</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tube rotator RT-50</td><td>TAITEC</td><td>0000165-000</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM3050S</td><td>http://www.leicabiosystems.com/histology-equipment/cryostats/details/product/leica-cm3050-s/</td></tr><tr><td>TC-65 Tungsten blade</td><td>Leica</td><td>14021626379</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Stainless containers</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Cryofilm type IIC</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Silane coated slide (New Silane II)</td><td>Muto Pure Chemicals</td><td>511617</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Cover glass</td><td>Matsunami</td><td></td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue processor</td><td>Sakura Finetek</td><td>VIP-5</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Tissue Embedding Console System</td><td>Sakura Finetek</td><td>Tissue-Tek TEC 5&amp;nbsp;</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Sliding microtome for paraffin</td><td>Yamato Kohki Industrial</td><td>REM-710</td><td>can be purchased from other vendors</td></tr><tr><td>Path Blade+pro for hard tissue</td><td>Matsunami</td><td>PB3503C</td><td>for paraffin section</td></tr><tr><td>Micro-CT</td><td>RIGAKU</td><td>R_mCT2</td><td>http://www.rigaku.com/en</td></tr><tr><td>Fluorescence microscope</td><td>KEYENCE</td><td>BZ-9000</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Maruishi pharmaceutical Co. Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>wako</td><td>191-01665</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>wako</td><td>285-14</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; 12H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>wako</td><td>196-02835</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>wako</td><td>287-21</td><td>for PBS</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA, EM Grade)</td><td>TAAB</td><td>P001</td><td></td></tr><tr><td>EDTA-2Na</td><td>wako</td><td>15111-45</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T1503-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Super Cryoembedding Medium</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td>Various</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Hexane</td><td>wako</td><td>080-03423</td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Super Cryomouting Medium type R2</td><td>Leica</td><td></td><td>for Kawamoto&#039;s firm method</td></tr><tr><td>Paraffin</td><td>Sakura Finetek</td><td>781001A0107</td><td></td></tr><tr><td>Histo-Clear</td><td>NDS</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Calcein</td><td>DOJINDO</td><td>340-00433</td><td></td></tr><tr><td>Hematoxylin&amp;nbsp;</td><td>wako</td><td>131-09665</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>wako</td><td>051-06515</td><td></td></tr></tbody></table>

dissection of the auditory bulla in postnatal mice: isolation of the middle ear bones and histological analysis

Nella maggior parte dei mammiferi, ossicini dell&#39;orecchio medio, tra cui il martello, l&#39;incudine e la staffa, sono le ossa più piccole. Nei topi, una struttura ossea chiamata bulla uditivo ospita gli ossicini, mentre la capsula uditivo racchiude l&#39;orecchio interno, vale a dire la coclea e canali semicircolari. ossicini murini sono essenziali per l&#39;ascolto e quindi di grande interesse per i ricercatori nel campo della otorinolaringoiatria, ma il loro metabolismo, lo sviluppo e l&#39;evoluzione sono molto importanti per altri campi. Metabolismo osseo Altered può influenzare la funzione dell&#39;udito nei topi adulti, e vari topi gene-carenti mostrano cambiamenti nella morfogenesi di ossicini uditivi in utero. Anche se murini ossicini sono piccoli, la loro manipolazione è fattibile se si comprende il loro orientamento anatomico e struttura 3D. Qui, descriviamo come sezionare la bulla uditivo e capsule di topi postnatale e quindi isolare i singoli ossicini rimuovendo parte della bolla. Discuteremo anche come emletto la bulla e la capsula in diversi orientamenti per generare paraffina o sezioni congelate adatto per la preparazione di sezioni longitudinali, orizzontali, o frontali sul martello. Infine, annoveriamo differenze anatomiche tra mouse e ossicini umani. Questi metodi sarebbero utile per analizzare gli aspetti patologici, di sviluppo e di evoluzione di ossicini e dell&#39;orecchio medio nei topi.

Questo protocollo presenta un metodo per isolare ossicini dalla bolla del mouse uditivo. Innanzitutto, la bolla e capsule sono sezionati come un unico pezzo dal cranio (Figura 1). La bolla sezionato viene poi utilizzata per preparare il martello (Figura 2) e l&#39;incudine e staffe (Figura 3). Punti di riferimento della bulla uditivo e capsule sono il processo styliform alla fine anteriore della bolla, la cresta dorsale, anteriore canale semicircolare, e la fossa subarcuate (Figura 1F). Microcomputed tomografia (CT) Imaging rivela ossicini della bolla uditiva nonché gli orientamenti ottimali per sezionamento longitudinale ed orizzontale di detti ossicini (Figura 4). Per longitudinale paraffina sezionamento del martello, la bolla e capsule sono state decalcificate in EDTA a 4 ° C per una settimana, incorporato in un pablocco Raffin con l&#39;orientamento mostrato in Figura 4 A - C, sezionato a 4 micron, e quindi colorato con H &amp; E. Il martello attaccato alla membrana timpanica in bolla uditiva rivelato corso encondrale a P14 (Figura 5A). Per visualizzare formazione di nuovo osso, calceina (30 mcg / g di peso corporeo) è stato peritoneally iniettato in un topo P20, e bulla e la capsula sono stati isolati 24 ore dopo a P21. Il campione senza decalcificazione stato incorporato congelato e poi cryosectioned a 6 micron utilizzando una pellicola adesiva sulla base del metodo di Kawamoto 43. Dopo la colorazione nucleare con DAPI (4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo), la sezione è stata osservata sotto un microscopio a fluorescenza. Segnali calceina (verde) ha rivelato la formazione di nuovo tessuto osseo nel martello (m), Bulla e capsula (Figura 5B). Per il sezionamento orizzontale del martello, la bulla uditivo isolato da un topo 5 settimane di età è stato incorporato congelato senza decalcificazione (per laorientamento vedi Figura 4D - F), cryosectioned a 6 micron con il metodo Kawamoto, e macchiato con H &amp; E. Sezionamento orizzontale della brevis malleal processus (MPB) mostra anche la coclea (Figura 5C). Una vista mediale degli ossicini uditivi giusti isolati da un topo P31 presenta caratteristiche tipiche del martello del mouse, vale a dire, il &quot;volo a vela-gabbiano-ala-like&quot; (o persiano spada come 45) manubrio, un processus di primo piano brevis (apofisi orbicolare , vedi Discussione), e la lamina trasversale (Figura 6). Si noti che il processo anteriore (processus anterior) è stato fratturato nella procedura dissezione attorno al goniale ed è stato separato dal ring timpanica (ectotympanic). Questo campione rappresentativo presenta un giunto incudomalleolar intatta tra il martello e incudine, mentre l&#39;articolazione incudostapedial è dislocata. inserzioni tendinee nel malleal estapediali processi muscolari sono rilevabili (Figura 6A, asterischi). Figura 6B confronta mouse e ossicini umani allo stesso ingrandimento. differenze di specie, diverse dalla taglia, sono i seguenti. Il manubrio è malleal ala-come nei topi, ma club come negli esseri umani. L&#39;angolo tra l&#39;asse anatomico (o l&#39;asse di rotazione, la linea attraverso il processo anteriore del martello e processo breve dell&#39;incudine) ed il manubrio è molto più piccolo in topi ei due sono quasi parallele, al contrario di quasi perpendicolare negli esseri umani 6,46-48. In ossicini umani, gli studi vibrometrico rivelano che la joint-incudo malleolare è mobile, piuttosto che funzionalmente fisso 49. Il martello del mouse presenta un ampio, sottile e piatta lamina trasversale non evidente negli esseri umani 47. Nei topi, anteriore processus fonde alle ossa membranose, vale a dire la goniale e timpanianello c, mentre nell&#39;uomo anteriore processus è ridotta ad una piccola spicule di osso 41. La staffa di topi e gli esseri umani differisce anche: nei topi, la crus anteriore è curvo e la crus posteriore è più dritta, mentre negli esseri umani, la crus anteriore è più diretto rispetto al cru posteriore. Vale la pena notare che la testa martello rispetto alle dimensioni del corpo è massicciamente ampliato in specie come la talpa d&#39;oro, dimostrando una significativa variabilità nei rapporti allometriche dei &quot;più piccoli&quot; ossa 48. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig1.jpg" /> Figura 1. Dissezione del Auditory Bulla e della capsula. (A) Il cranio di un mouse P31 è diviso in due metà destra e sinistra. A, anteriore; P, posteriore; L, a sinistra; R, a destra. (B) superficie mediale della metà destra della tagliata in due, la testa pelata. Cx, corteccia cerebrale; Cb, cervelletto; Bs, Brainstem. D, dorsale; V, ventrale. (C) La rimozione del cervello con una pinza. (D) vista mediale della capsula uditivo nel cranio destra. La cresta dorsale (punte di freccia) si trova tra la fossa cranica mezzo (MCF) e posteriore del cranio fossa (PCF) e separa dorso-anteriore e superfici ventro-posteriore della capsula uditivo. Barra di scala, 2 mm. (E) maggiore ingrandimento di bulla uditivo e capsula (vista mediale). Co, coclea; VII, nervo facciale; VIII, nervo vestibolococleare; AC, anteriore (superiore) Canale semicircolare; Sf, fossa subarcuate, che ospita il paraflocculus cerebellare. Barra di scala, 1 mm. (F) Micrografia di isolati bulla uditivo e capsula (vista mediale). Sp, processo styliform. Barra di scala, 1 mm. (A - E), P31 mouse. (F), P33 mouse. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig2.jpg" /> Figura 2. La dissezione del Malleus. (A) Vista ventrolaterale di una bolla uditiva destra e capsula. Il tympanicus solco (ST, freccia tratteggiata) è il sito di attacco della membrana timpanica. Il laterali osso al ST è parte dell&#39;orecchio esterno e mediale osso al ST forma il pavimento della cavità dell&#39;orecchio medio. A, anteriore; P, posteriore; D, dorsale; V, ventrale. (B) Vista dopo la rimozione del condotto uditivo esterno per rivelare la membrana timpanica (TM), comprese le pars flaccida (Pf) e pars Tensa (Pt). (C) rimozione di parti di osso timpanica (linee tratteggiate e #) vicino al malleal processus brevis (MPB). m, malleus; mM, manubrio malleal. Freccia, bolla d&#39;aria nella cavità dell&#39;orecchio medio visto attraverso la membrana timpanica. (D) Malleus esposto. Malleus testa è indicato. punteggiatolinea indica la superficie articolare dell&#39;incudine. (E) tendine del muscolo tensore del timpano (TT) attaccato al martello. (F) La timpani tensore è tirato quando il martello è sollevato. *, Processo muscolare. (G) Tensor timpani è tagliato con un ago. (H) Tre ossicini dopo la rimozione della membrana timpanica. La joint-incudo malleolare è dislocato. m, malleus; Io, incudine; s, staffa; Go, goniale (fusa al martello e timpanica anello, TR). Tutte le barre di scala, 0,5 mm. (A, H), P33 mouse. (B - G), P31 mouse. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig3.jpg" /> Figura 3. La dissezione del incudine e staffe. (A) Incudine estaffa dopo la rimozione del martello. L&#39;arteria stapediale (SA) passa attraverso la staffa (s). La linea tratteggiata indica la superficie articolare dell&#39;incudine. Si noti che il breve crus (ICB, crus breve) dell&#39;incudine (i) è fissato dal legamento posteriore (non mostrata). Asterisk, processo muscolare della staffa. (B) della staffa dopo la rimozione dell&#39;incudine. punta dell&#39;ago viene utilizzato per tagliare l&#39;arteria stapediale (SA). Freccia, direzione del flusso ematico. La linea tratteggiata indica superficie articolare della staffa. (C) L&#39;arteria stapediale viene rimosso dalla staffa. X indica la fine del taglio dell&#39;arteria stapediale (SA). (D) La finestra ovale (Ow, ovalis Fenestra o vestibuli Fenestra) è visibile dopo la rimozione della staffa. Rw, finestra rotonda (finestra rotonda o coclee Fenestra). Barre di scala, 0,5 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa</a>figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig4.jpg" /> Figura 4. Orientamento uditivo Bulla e della capsula durante Incorporare per Longitudinale (parasagittale, A - C) e orizzontale (D - E) sezionamento del Malleus. (A - C) Il collo e trasversale lamina del martello sono posti parallelamente al fondo del piatto incorporamento. (A) Vista laterale: Immagine micro-CT per mostrare incorporamento del martello proprio in bolla (pseudocolored blu). Il martello e incudine sono pseudocolored verde. La linea tratteggiata, il piano di taglio desiderato. linea continua, fondo di incorporare piatto. m, malleus; punte di freccia, cresta dorsale. M, mediale; L, laterale; D, dorsale; V, ventrale. (B) Vista: immagine Micro-CT. Si noti che l&#39;estremità anteriore della bolla (processo styliform) è stato rimosso. Io, incudine. (C) Vista: microfotografia (prese con unafiltro colore). AC, anteriore (superiore) Canale semicircolare; Sf, fossa subarcuate; Sp, processo styliform. A, anteriore; P, posteriore; D, dorsale; V, ventrale. (D - F) Il brevis processus del martello è posizionato perpendicolare al fondo di incorporamento piatto. (D) Vista laterale: Immagine Micro-CT per mostrare incorporamento del martello destra. La linea tratteggiata, il piano di taglio desiderato. linea continua, fondo di incorporare piatto. (E) Vista: immagine Micro-CT. mM, manubrio malleal. (F) Vista dall&#39;alto: al microscopio (scattate con un filtro di colore). Barre di scala, 1 mm. Immagini Micro-TC sono stati ottenuti con una risoluzione voxel di 5 micron, come precedentemente descritto 7. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig5.jpg" /> FIGURA 5. Istologia. (A) colorazione H &amp; E. Sezione longitudinale (parasagittale) del martello in paraffina destra (m) nella uditivo bulla (linea tratteggiata) a P14. TM, membrana timpanica. Etichettatura ossea (B) calceina. Sezione longitudinale del, malleus congelato undecalcified sinistra (m) nella bolla uditiva a P21. Di contrasto, DAPI. (C) colorazione H &amp; E. Sezione orizzontale del brevis congelato, undecalcified sinistra malleal processus (MPB) nel bulla uditivo e capsula (5 settimane di età del mouse). Co, coclea. Barre di scala, 1 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55054/55054fig6.jpg" /> Figura 6. mediale Vista Auditory Ossicini. (A) Diritto ossicini di P31 del mouse. A, anteriore; P, posteriore; D, dorsale; V, ventrale. Barra di scala, 1 mm. malleus testa (Caput mallei, Capitulum mallei); collo (Collum mallei); lamina (lamina trasversale); mm (manubrio mallei); asterisco nero (processo muscolare del martello); MPa (Processus anteriore, Processus gracile); MPB (processus brevis); corpo incudine (Corpus incudis); ICB (breve Crus, breve crus, processo breve); ICL (longum Crus, lungo crus, lungo processo); IPL (Processus Lenticularis, processo lenticolare, Sylvian apofisi); testa della staffa (Caput stapedis); asterisco bianco (processo muscolare della staffa); sca (Crus anterius, crus anteriore); SCP (Crus posterius, posteriore crus); di base (stapedis base, pedana); SOF (forame otturatorio, forame intercrural). (B) destra ossicini di un 76-year-old femmina umana (Per gentile concessione del Dipartimento di Anatomia, Keio University School of Medicine). Gli ossicini di topo P31 (in basso a destra) vengono esposte allo stesso ingrandimento di quello usato per ossicini umani. curvfrecce cati indicano l&#39;angolo tra l&#39;asse anatomico e il manubrio (linee tratteggiate). Barra di scala, 2 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55054/55054fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

La dissezione del Auditory Bulla nei topi postnatale: Isolamento delle ossa dell&#39;orecchio medio e l&#39;analisi istologica

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

dissection-auditory-bulla-postnatal-mice-isolation-middle-ear-bones

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

29.9K Views.  Keio University School of Medicine. We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis. 

Video: Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

A Protocol for Decellularizing Mouse Cochleae for Inner Ear Tissue Engineering

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current regenerative medicine strategies have focused on transplanting stem cells or genetic manipulation of surrounding support cells in the inner ear to encourage replacement of damaged stem cells to correct hearing loss. Yet, the extracellular matrix (ECM) may play a vital role in inducing and maintaining function of hair cells, and has not been well investigated. Using the cochlear ECM as a scaffold to grow adult stem cells may provide unique insights into how the composition and architecture of the extracellular environment aids cells in sustaining hearing function. Here we present a method for isolating and decellularizing cochleae from mice to use as scaffolds accepting perfused adult stem cells. In the current protocol, cochleae are isolated from euthanized mice, decellularized, and decalcified. Afterward, human Wharton&#39;s jelly cells (hWJCs) that were isolated from the umbilical cord were carefully perfused into each cochlea. The cochleae were used as bioreactors, and cells were cultured for 30 days before undergoing processing for analysis. Decellularized cochleae retained identifiable extracellular structures, but did not reveal the presence of cells or noticeable fragments of DNA. Cells perfused into the cochlea invaded most of the interior and exterior of the cochlea and grew without incident over a duration of 30 days. Thus, the current method can be used to study how cochlear ECM affects cell development and behavior.

The goal of this protocol is to demonstrate an effective method to decellularize and decalcify mouse cochleae for utilization as scaffolds for tissue engineering applications.

Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

In mammals, mechanosensory hair cells that facilitate hearing lack the ability to regenerate, which has limited treatments for hearing loss. Current ...

Ricerca

Bioingegneria

Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a spiral shape and have a tonotopic gradient for sound detection. The mouse cochlea is approximately 6 mm long and often divided into three turns (apex, middle, and base) for analysis. To investigate cell loss, cell division, or mosaic gene expression, the whole mount or surface preparation of the cochlea is useful. This dissection method allows visualization of all cells within the organ of Corti when combined with immunostaining and confocal microscopy to image cells at different planes in the z-axis. Multiple optical cross-sections can also be obtained from these z-stack images. In addition, the whole mount dissection method can be used for scanning electron microscopy, although a different fixation method is needed. Here, we present a method to isolate the organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). This method can be used for mice ranging from one week of age through adulthood and differs from the technique used for neonatal samples where calcification of the cochlea is incomplete. A slightly modified version can be used for dissection of the rat cochlea. We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies.

We present a method to isolate the adult organ of Corti as three intact cochlear turns (apex, middle, and base). We also demonstrate a procedure for immunostaining with fluorescently tagged antibodies. Together these techniques allow the study of hair cells, supporting cells, and other cell types found in the cochlea.

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

The organ of Corti, housed in the cochlea of the inner ear, contains mechanosensory hair cells and surrounding supporting cells which are organized in a ...

Neuroscienze

The Mouse Round-window Approach for Ototoxic Agent Delivery: A Rapid and Reliable Technique for Inducing Cochlear Cell Degeneration

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research involving the cochlea and its associated neural pathways entails exposure of model cochleae to a variety of ototoxic agents. This allows investigators to study the effects of targeted damage to cochlear structures, and in some cases, the self-repair or regeneration of those structures. Various techniques exist for delivery of ototoxic agents to the cochlea. When selecting a particular technique, investigators must consider a number of factors, including the induction of inadvertent systemic toxicity, the amount of cochlear damage produced by the surgical procedure itself, the type of lesion desired, animal survivability, and reproducibility/reliability of results. Currently established techniques include parenteral injection, intra-peritoneal injection, trans-tympanic injection, endolymphatic sac injection, and cochleostomy with perilymphatic perfusion. Each of these methods has been successfully utilized and is well described in the literature; yet, each has various shortcomings. Here, we present a technique for topical application of ototoxic agents directly to the round window niche. This technique is non-invasive to inner ear structures, produces rapid onset of reliably targeted lesions, avoids systemic toxicity, and allows for an intra-animal control (the contra-lateral ear). Results stemming from this approach have helped deeper understanding of auditory pathophysiology, cochlear cell degeneration, and regenerative capacity in response to an acute injury. Future investigations may use this method to conduct interventional studies involving gene therapy and stem cell transplantation to combat hearing loss.

Various methods exist for introducing ototoxic agents to the cochleae of animal models. Presented is a surgical protocol for delivery of ototoxic agents to the round window niche. The procedure is reliable, creates targeted intra-cochlear lesions, and avoids mechanical damage to the microarchitecture. Examination of cochlear self-repair/regeneration is possible.

L&#39;approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Investigators have utilized a wide array of animal models and investigative techniques to study the mammalian auditory system. Much of the basic research ...

Medicina

Evaluation of Planar-Cell-Polarity Phenotypes in Ciliopathy Mouse Mutant Cochlea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest signaling pathways shown to be associated with ciliary function was the non-canonical Wnt signaling pathway, also referred to as planar cell polarity (PCP) signaling. One of the best places in which to study the effects of planar cell polarity (PCP) signaling during vertebrate development is the mammalian cochlea. PCP signaling disruption in the mouse cochlea disrupts cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, all of which are affected by cilia dysfunction. The goal of this protocol is to describe the analysis of PCP signaling in the developing mammalian cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy. Defects in convergence and extension are manifested as a shortening of the cochlear duct and/or changes in cellular patterning, which can be quantified following dissection from developing mouse mutants. Changes in stereociliary bundle orientation and kinocilia length or positioning can be observed and quantitated using either immunofluorescence or scanning electron microscopy (SEM). A deeper insight into the role of ciliary proteins in cellular signaling pathways and other biological phenomena is crucial for our understanding of cellular and developmental biology, as well as for the development of targeted treatment strategies.

Primary cilia influence various signaling pathways. The mammalian cochlea is ideal for examining planar cell polarity (PCP) signaling. Cilia dysfunction affects cochlear outgrowth, cellular patterning and hair cell orientation, readouts of PCP. Our goal is to analyze PCP signaling in mouse cochlea via phenotypic analysis, immunohistochemistry and scanning electron microscopy.

Valutazione della Planar-Cell-polarità fenotipi in Ciliopathy mouse Mutant Coclea

In recent years, primary cilia have emerged as key regulators in development and disease by influencing numerous signaling pathways. One of the earliest ...

Cryosectioning and Immunostaining Mouse Inner Ear Tissue: From Embryonic to Adult Stages

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is to provide a straightforward and standardized method for inner ear tissue processing for researchers, possibly new to the field, interested in working with the mouse cochlea. Included here are protocols for dissection, fixation, embedding, cryosectioning, and immunostaining. Section immunostaining is one of the best methods for examining individual cells within the context of the entire cochlea.
Key steps include dissecting the inner ear away from the skull, fixing the tissue using 4% paraformaldehyde, embedding with Optimal Cutting Temperature compound, cryosectioning, and immunostaining with antibodies targeting specific proteins expressed by the cochlea.
Included in our methods are special considerations made for the cochlea given its 
shape and structure.&#160;Reasonably good focus and dissection skills are needed, as tissue damage can affect the quality of immunostaining and consistency among samples. However, with the procedures we outline, most users can be trained in a few weeks to make beautiful preparations. Overall, this protocol offers a valuable way to promote research to understand auditory development, function, and disease in mouse models.

This protocol, intended for novice users of mouse inner ear tissue, comprehensively details steps for processing mouse inner ears at different developmental stages for section immunostaining.

Criosezione e immunocolorazione del tessuto dell'orecchio interno del topo: dagli stadi embrionali a quelli adulti

This protocol details general histology methods for preparing inner ear samples from embryonic, neonatal, and adult mice. The purpose of this protocol is ...

Biologia dello sviluppo

Cochlear Implant Surgery and Electrically-evoked Auditory Brainstem Response Recordings in C57BL/6 Mice

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of hearing. Improvement of the implant technology is needed if CI users are to perceive music and perform in more natural environments, such as hearing out a voice with competing talkers, reflections, and other sounds. Such improvement requires experimental animals to better understand the mechanisms of electric stimulation in the cochlea and its responses in the whole auditory system. The mouse is an increasingly attractive model due to the many genetic models available. However, the limited use of this species as a CI model is mainly due to the difficulty of implanting small electrode arrays. More details about the surgical procedure are therefore of great interest to expand the use of mice in CI research.
In this report, we describe in detail the protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in the C57BL/6 mouse strain. We demonstrate the functional efficacy of this procedure with electrically-evoked auditory brainstem response (eABR) and show examples of facial nerve stimulation. Finally, we also discuss the importance of including a deafening procedure when using a normally hearing animal. This mouse model provides a powerful opportunity to study genetic and neurobiological mechanisms that would be of relevance for CI users.

Animal models of cochlear implants can advance knowledge of the technological bases of treating permanent sensorineural hearing loss with electrical stimulation. This study presents a surgical protocol for acute deafening and cochlear implantation of an electrode array in mice as well as the functional assessment with auditory brainstem response.

Chirurgia di impianto cocleare e registrazioni di risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale in topi C57BL/6

Cochlear implants (CIs) are neuroprosthetic devices that can provide a sense of hearing to deaf people. However, a CI cannot restore all aspects of ...

Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency Regions of the Mouse Cochlea

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have indicated that hair cell synapses may be the initial targets in sensorineural hearing loss (SNHL). Such studies have proposed the concept of cochlear &#34;synaptopathy&#34;, which refers to alterations in ribbon synapse number, structure, or function that result in abnormal synaptic transmission between IHCs and SGNs. While cochlear synaptopathy is irreversible, it does not affect the hearing threshold. In noise-induced experimental models, restricted damage to IHC synapses in select frequency regions is employed to identify the environmental factors that specifically cause synaptopathy, as well as the physiological consequences of disturbing this inner ear circuit. Here, we present a protocol for analyzing cochlear synaptic morphology and function at a specific frequency region in adult mice. In this protocol, cochlear localization of specific frequency regions is performed using place-frequency maps in conjunction with cochleogram data, following which the morphological characteristics of ribbon synapses are evaluated via synaptic immunostaining. The functional status of ribbon synapses is then determined based on the amplitudes of auditory brainstem response (ABR) wave I. The present report demonstrates that this approach can be used to deepen our understanding of the pathogenesis and mechanisms of synaptic dysfunction in the cochlea, which may aid in the development of novel therapeutic interventions.

This manuscript describes an experimental protocol for evaluating the morphological characteristics and functional status of ribbon synapses in normal mice. The present model is also suitable for noise-induced and age-related cochlear synaptopathy-restricted models. The correlative results of previous mouse studies are also discussed.

Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo

Cochlear inner hair cells (IHCs) transmit acoustic signals to spiral ganglion neurons (SGNs) through ribbon synapses. Several experimental studies have ...

Cochlear Surface Preparation in the Adult Mouse

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous etiologies such as exposure to excessive noise, the use of ototoxic medications, bacterial or viral ear infections, head injuries, and the aging process. Loss of sensory hair cells is a common pathological feature of the varieties of acquired hearing loss. Additionally, the inner hair cell synapse can be damaged by mild insults. Therefore, surface preparations of cochlear epithelia, in combination with immunolabeling techniques and confocal imagery, are a very useful tool for the investigation of cochlear pathologies, including losses of ribbon synapses and sensory hair cells, changes in protein levels in hair cells and supporting cells, hair cell regeneration, and determination of report gene expression (i.e., GFP) for verification of successful transduction and identification of transduced cell types. The cochlea, a bony spiral-shaped structure in the inner ear, holds the auditory sensory end organ, the organ of Corti (OC). Sensory hair cells and surrounding supporting cells in the OC are contained in the cochlear duct and rest on the basilar membrane, organized in a tonotopic fashion with high-frequency detection occurring in the base and low-frequency in the apex. With the availability of molecular and genetic information and the ability to manipulate genes by knockout and knock-in techniques, mice have been widely used in biological research, including in hearing science. However, the adult mouse cochlea is miniscule, and the cochlear epithelium is encapsulated in a bony labyrinth, making microdissection difficult. Although dissection techniques have been developed and used in many laboratories, this modified microdissection method using cell and tissue adhesive is easier and more convenient. It can be used in all types of adult mouse cochleae following decalcification.

This article presents a modified cochlear surface preparation method that requires decalcification and use of a cell and tissue adhesive to adhere the pieces of cochlear epithelia to 10 mm round cover slips for immunohistochemistry in adult mouse cochleae.

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Auditory processing in the cochlea depends on the integrity of the mechanosensory hair cells. Over a lifetime, hearing loss can be acquired from numerous ...

Dissection of the Endolymphatic Sac from Mice

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the human phenotypes. Although important progress has been done in the understanding of the development and function of the neurosensory epithelia of the cochlea and vestibula, limited knowledge is available regarding the development, cellular composition, molecular pathways and functional characteristics of the endolymphatic sac. This is, in large part, due to the difficulty of visualizing and microdissecting this tissue, which is an epithelium comprised of only one cell layer. The study presented here describes an approach to access and microdissect the endolymphatic sac from the wild-type mouse inner ear at different ages. The result of a similar dissection is shown in a pendrin-deficient mouse model of enlargement of the vestibular aqueduct. A transgenic mouse with a fluorescent endolymphatic sac is presented. This reporter mouse can be used to readily visualize the endolymphatic sac with limited dissection and determine its size. It can also be used as an educational tool to teach how to dissect the endolymphatic sac. These dissection procedures should facilitate further characterization of this understudied part of the inner ear.

<meta charset="utf8"></head><body>Dissezione del sacco endolinfatico da topi

This study describes how to dissect the endolymphatic sac from the inner ear of the mouse at different ages. The result of a similar dissection is shown in an Slc26a4-null mouse model of enlargement of the endolymphatic sac. A transgenic mouse with a fluorescent reporter expressed in the endolymphatic sac is presented as a model to readily visualize the endolymphatic sac, and educational tool.

Dissezione del sacco endolinfatico da topi

The study of mutant mouse models of human hearing and balance disorders has unraveled many structural and functional changes which may contribute to the ...

La dissezione del Auditory Bulla nei topi postnatale: Isolamento delle ossa dell'orecchio medio e l'analisi istologica

Riepilogo

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Capitoli in questo video

Un protocollo per Decellularizing Mouse coclee per l'ingegneria dei tessuti dell'orecchio interno

Tutta Monte dissezione e immunofluorescenza del topo adulto Coclea

L'approccio del mouse Round-finestra per ototossico Delivery Agent: Una rapida e tecnica affidabile per indurre la degenerazione delle cellule Cochlear

Valutazione della Planar-Cell-polarità fenotipi in Ciliopathy mouse Mutant Coclea

Criosezione e immunocolorazione del tessuto dell'orecchio interno del topo: dagli stadi embrionali a quelli adulti

Chirurgia di impianto cocleare e registrazioni di risposta elettricamente evocate uditive del tronco cerebrale in topi C57BL/6

Valutazione morfologica e funzionale delle sinapsi del nastro nelle specifiche regioni di frequenza della Coclea del topo

Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto

Dissezione del sacco endolinfatico da topi

Dissezione del sacco endolinfatico da topi