We thank Peter Johnson of the Georgetown University Microscopy Core for assistance with imaging the zebrafish embryos. The Microscopy &amp; Imaging Shared Resource and the Zebrafish Shared Resource are partially supported by NIH/NCI grant P30-CA051008. This work was also supported by NIH/NCI CA71508 (AW) and CA177466 (AW).

Etica Dichiarazione: zebrafish embrioni sono stati generati secondo un protocollo IACUC approvato. Questi esperimenti sono stati effettuati in conformità con le raccomandazioni del comitato di cura degli animali e Usa Georgetown University. 1. Organizzare embrioni per iniezione e creare soluzioni di riserva <ol><li> Generare requisito larve di zebrafish per valutare invasione vascolare delle cellule tumorali. <ol><li> Impostare coppia-saggio o di un gruppo in croce accoppiamento con Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa B692; B140 ednrb1 pesce. NOTA: Abbiamo generato Tg (kdrl: grcfp) zn1; mitfa B692; ednrb1 B140 zebrafish, attraversando Tg (kdrl: grcfp) zn1 25, che esprimono barriera verde proteina fluorescente corallo nelle cellule endoteliali, con una linea che manca di cellule pigmentate, mitfa B692, B140 ednrb1, sviluppato presso il Centro risorse Zebrafish International. </li><li> couova llect, pulita, e rimuovere gli embrioni non fecondate o deformate il giorno successivo 22. </li><li> Incubare gli embrioni a 28,5 ° C fino al momento per l&#39;iniezione di cellule tumorali, che si verificano quando gli embrioni di zebrafish sono 2 giorni dopo la fecondazione (2 DPF). </li></ol></li><li> Fare piastre di iniezione. <ol><li> Fate sciogliere 25 ml di 1,5% agarosio in DH 2 O per ogni piatto. </li><li> Versare 12 ml di agarosio in un x 15 mm piastra di Petri 100 mm e lasciarlo indurire. </li><li> Re-melt quindi versare i restanti agarosio nella piastra. </li><li> posizionare immediatamente uno stampo di vetro tagliate (3 mm x 7,2 cm di lunghezza di larghezza x 7,5 cm) in modo che sia a un angolo di 30 gradi rispetto al agarosio e posizionato al centro della piastra. NOTA: Questo creerà una ripida parete di 60 ° e una rampa inclinata di 30 °. </li><li> Nastro lo stampo di vetro al suo posto e lasciare indurire agarosio. </li><li> Rimuovere delicatamente lo stampo di vetro e fare attenzione a non strappare l&#39;agarosio. NOTA: Stampo può essere memorizzato in dH 2 O a 4 ° C. </li></ol></li><li> Equilibrare piatto iniezione con pesci d&#39;acqua (0,3 g / L di sale marino). <ol><li> Piastra Sciacquare due volte con acqua distillata. </li><li> Equilibrare plate aggiungendo 10 ml di acqua pesci alla piastra e posto su agitatore per 10 min. </li><li> Equilibrare piatto una seconda volta con acqua i pesci. </li></ol></li><li> Split post-fecondazione (DPF) di embrioni di 2 giorni in gruppi di iniezione trasferendoli in piatti a base di pesce contenenti acqua 22. </li><li> Preparare i piatti di recupero per ogni gruppo di utilizzare dopo l&#39;iniezione. Assicurarsi che il piatto di recupero contiene acqua 10 ml di pesce, più penicillina (25 mcg / ml) e streptomicina (50 mg / ml). </li><li> Preparare la soluzione tricaine 2x con l&#39;aggiunta di 4 ml di tricaine tamponata magazzino (4 mg / ml, 10 mM Tris, pH 7) a 50 ml di acqua i pesci più penicillina e la streptomicina. </li><li> Disciogliere 15 mg a basso punto di fusione agarosio in 10 ml di soluzione tricaine 2x per generare un mezzo di montaggio anestetico che immobilizza embrioni vivi per imaging. NOTA: Mezzo di montaggio consiste di 1,5% agarosio. </li><li> Tirare aghi microiniezione. <ol><li> Mettere in vetro tubo capillare in un estrattore pipetta verticale. Tirare le pipette lungo conici con 20 corrente mAmp e un elemento riscaldante 2-coil. </li></ol></li></ol> 2. Le cellule Etichettatura cancro con lipofila colorante fluorescente <ol><li> Mantenere le cellule tumorali nelle loro condizioni di coltura raccomandati. NOTA: Queste linee sono state mantenute in DMEM + 10% FBS: BT-474, MCF-7, MDA-MB-231, MDA-MB-468, e SK-BR-3. Queste linee sono state mantenute in RPMI + 10% FBS: HCC 1806 T-47D. Tutte le linee cellulari sono state mantenute a 37 ° C e 5% CO 2 durante l&#39;incubazione. </li><li> Generare una cella singola sospensione dissociandosi una cultura aderente di cellule tumorali. <ol><li> Lavare le cellule prima con PBS e poi trattare con soluzione di tripsina-EDTA 0,05%. NOTA: tempo di esposizione Tripsina dipenderà dalla linea cellulare. </li><li> Neutralizzare la soluzione tripsina con sérum contenenti terreni di coltura cellulare dopo che le cellule si staccano. </li></ol></li><li> Centrifugare la sospensione cellulare tripsina-neutralizzato per 5 minuti a 200 xg, quindi risospendere il pellet cellulare in mezzi di coltura fresco per il conteggio delle cellule. </li><li> Conta la sospensione cellulare utilizzando un contatore automatico e preparare 1 milione di cellule in 200 ml di mezzi di coltura cellulare. <ol><li> Verificare la vitalità delle cellule con trypan colorante esclusione blu prima iniezione in embrioni di zebrafish. NOTA: le popolazioni di cellule vitali solo devono essere iniettate in embrioni di zebrafish, come l&#39;iniezione di cellule morte non rifletterà vera invasione vascolare. </li></ol></li><li> Aggiungere 2 ml di colorante lipofile rosso alla sospensione cellulare di cancro per una diluizione 1: 100, mescolare bene, e poi incubare la miscela a 37 ° C per 20 min. NOTA: Concentrazione del tempo tintura e etichettatura può essere necessario ottimizzate per ciascuna linea cellulare. </li><li> Dopo l&#39;incubazione, aggiungere 1 ml di mezzi freschi al tubo e centrifugare per 5 min a200 x g. </li><li> Lavare via colorante fluorescente residuo dalle cellule tumorali. <ol><li> Aspirare il supernatante dal pellet cellulare, risospendere il pellet in 1 ml di terreni di coltura fresco, e centrifugare per 5 min a 200 x g. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio una seconda volta: aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di mezzi freschi e centrifugare ancora per 5 min a 200 x g. </li><li> Ripetere la fase di lavaggio terza volta: aspirare il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di mezzi freschi e centrifugare ancora per 5 min a 200 x g. </li></ol></li><li> Aspirare il surnatante e risospendere il pellet cellulare contenente 1 milione di cellule tumorali marcate in 500 ml di mezzi freschi. NOTA: 0,5 mM EDTA può essere aggiunto ai media per evitare grumi cellule. </li></ol> 3. Cellule Iniettare tumorali nel seno pre-cardiaca di embrioni di zebrafish <ol><li> Collegare il sistema di erogazione microiniezione a una fonte di aria compressa e accendere °e microiniezione fonte di alimentazione del sistema di erogazione. <ol><li> Pressione di prova premendo il pedale. Un breve impulso di aria dovrebbe emettere dalla porta-aghi. </li></ol></li><li> Equilibrare le piastre iniezione due volte con la soluzione 2x tricaine. <ol><li> Per ogni fase di equilibrio, aggiungere 20 ml di soluzione tricaine 2x alla piastra di iniezione e posto su agitatore per 10 minuti. </li></ol></li><li> Utilizzare pipetta di plastica per trasferire un gruppo di embrioni ad un piccolo recipiente contenente la soluzione 2x tricaine. </li><li> Backfill l&#39;ago dell&#39;iniezione microiniezione con le cellule tumorali utilizzando una punta della pipetta di gel-caricamento. <ol><li> Posizionare l&#39;ago in un vaso di stoccaggio elettrodo con l&#39;estremità appuntita rivolta verso il basso in modo da cellule stabilirsi vicino alla punta. </li></ol></li><li> Trasferimento 20 - 30 embrioni anestetizzati ad una piastra di iniezione attraverso la raccolta degli embrioni con abbondanza di 2x tricaine in una pipetta di plastica. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Lasciare embrioni di stabilirsi nella punta della pipetta. </li><li> gentiluomoly espellere embrioni nella vaschetta della piastra di iniezione, diffondendo gli embrioni lungo la lunghezza della vasca. </li><li> Allineare gli embrioni con le teste verso l&#39;alto e pance di fronte alla ripida parete della vasca. NOTA: soluzione Tricaine dovrebbe coprire sia la lunghezza trogolo e la superficie agarosio piatta, con embrioni risiede solo nel trogolo. Gli embrioni sono ora pronti per l&#39;iniezione. </li></ol></li><li> Iniettare 50 - 100 cellule tumorali (2-5 NL) nel seno precardiac degli embrioni di zebrafish utilizzando il sistema di erogazione microiniezione. <ol><li> Attaccare l&#39;ago al titolare ago di una micromanipolatore. </li><li> Posizionare la piastra iniezione sotto lo stereoscopio con la parete 60 gradi a sinistra e mettere a fuoco l&#39;embrione superiore a 25x. </li><li> Posizionare il micromanipolatore in modo tale che, se aperto, l&#39;ago trafiggerà l&#39;embrione. </li><li> Estendere l&#39;ago a occhio fino a quando non è quasi a contatto con l&#39;embrione. </li><li> Guardando al microscopio, allineare l&#39;ago in modo tcappello che trafiggerà l&#39;embrione su ulteriore estensione. </li><li> Pierce l&#39;embrione attraverso il sacco vitellino posizionando la punta appena a, ma non in, il seno pre-cardiaca. </li><li> Iniettare cellule premendo il pedale. La forza di iniezione espelle le cellule nel seno cardiaca. Ritrarre l&#39;ago. </li><li> Usando la mano destra, estendere e ritrarre l&#39;ago di iniezione. Con la mano sinistra, effettuare regolazioni di precisione per posizionare successivo dell&#39;embrione. </li><li> Ritorna l&#39;ago al barattolo di stoccaggio degli elettrodi durante l&#39;impostazione di iniettare un altro piatto. </li></ol></li><li> Trasferire gli embrioni al piatto recupero una volta che l&#39;intera piastra viene iniettato. <ol><li> La piastra di iniezione per unire gli embrioni in basso, lavando le rimanenti embrioni fuori del canale, e della raccolta con la pipetta di plastica. </li><li> Lasciare gli embrioni di depositarsi sul fondo della pipetta. </li><li> Trasferire gli embrioni al piatto di recupero in un volume minimo di tricaine. </li></ol></li><li> incubaTE recupero piatto a 28 ° C per 1 ora. <ol><li> Separare zebrafish embrioni vitali da embrioni morti e altri detriti. </li></ol></li><li> Incubare piatto a 33 ° C fino al momento per il punteggio, in genere 24-96 ore. NOTA: Questa temperatura è determinata come compromesso tra 37 ° C, la temperatura ideale per le cellule tumorali, e 28,5 ° C, la temperatura ideale per zebrafish. </li></ol> 4. Punteggio stravaso <ol><li> Anestetizzare la partita di embrioni per essere segnata mettendoli in un piatto con la soluzione tricaine. </li><li> Inserire un larve anestetizzato su un vetrino da microscopio depressione in una goccia di tricaine. <ol><li> larve Orient lateralmente per l&#39;imaging ottimale della regione caudale. </li></ol></li><li> Contare il numero di cellule tumorali che hanno invaso successo della vascolarizzazione concentrandosi su e giù attraverso la regione di coda di discernere chiaramente cellule intatte. NOTA: E &#39;meglio avere almeno due persone coinvolte in til suo processo, in cui l&#39;individuo segnando il pesce è cieco alla condizione sperimentale in corso di valutazione. <ol><li> Punteggio larve su un microscopio a fluorescenza mescola con la lente dell&#39;obiettivo 10x. Utilizzare l&#39;obiettivo 20x per le chiamate difficili. </li></ol></li></ol> 5. Embrioni di montaggio su vetrini e la successiva imaging di fluorescenza <ol><li> Sciogliere 1,5% soluzione di agarosio / tricaine e portare a 37 ° C. </li><li> Anestetizzare l&#39;embrione di essere ripreso ponendolo in soluzione tricaine. </li><li> Trasferire l&#39;embrione in una goccia di soluzione tricaine alla superficie di formazione dell&#39;immagine. Opzionalmente usare un piatto o vetrino da microscopio con fondo di vetro. </li><li> Utilizzare una pipetta di vetro per rimuovere la soluzione in eccesso tricaine, mantenendo l&#39;embrione sulla superficie di formazione dell&#39;immagine. </li><li> Sovrapponi una goccia di soluzione di agarosio fuso sopra l&#39;embrione. </li><li> Rapidamente, prima che l&#39;agarosio polimerizza, utilizzare uno strumento delicato, come un pennello ciglia, per orientare l&#39;embrione lateralmente per l&#39;imaging, dando particolare attenzioneper assicurare l&#39;embrione viene appiattito lungo la superficie di formazione dell&#39;immagine. </li><li> Immergere la goccia di agarosio ora polimerizzato sotto soluzione tricaine. </li><li> Sottoporre il zebrafish vivo per l&#39;imaging microscopico. </li></ol> 6. Modifica: iniezione di cellule tumorali nel tuorlo Sac di embrioni di zebrafish <ol><li> Preparare il sistema e di iniezione piastre microiniezione di erogazione come precedentemente descritto nella sezione (3) di questo protocollo. </li><li> Etichettare due popolazioni di cellule con contrasto coloranti fluorescenti come precedentemente descritto nel paragrafo (2) del presente protocollo. </li><li> Iniettare 5 - 10 nl di 2 x 10 ^ 7 cellule / ml nel sacco vitellino. Mantenere il costante volume di iniezione per iniettare il numero di cellule identiche (100 - 200 le cellule tumorali) da ciascuna popolazione cellulare NOTA: Si può utilizzare embrioni di zebrafish trasparente privi vascolare fluorescente per questo test. ingresso passivo di particelle nel sistema vascolare può essere controllato per iniettando perline fluorescenti (&lt;10 micron) o, alternativamente, una linea cellulare che non intravsate. </li><li> Recuperare gli embrioni iniettati come precedentemente descritto nella sezione (3) di questo protocollo e quindi lo screening per le iniezioni di successo. <ol><li> Utilizzare uno stereoscopio per lo screening e trasferire gli embrioni vitali che sono stati iniettati con successo ad un nuovo piatto. NOTA: tutti gli embrioni devono avere una massa di dimensioni sempre di cellule situate nel tuorlo. Gli embrioni vengono scartati se la dimensione di massa è diversa o se le cellule si trovano al di fuori del tuorlo. </li><li> Trasferire gli embrioni vitali per un nuovo piatto se le cellule tumorali si vedono chiaramente nel sacco vitellino. </li></ol></li><li> Incubare piatto a 33 ° C fino al momento per il punteggio, in genere 24-48 ore. NOTA: Questa temperatura è determinata come compromesso tra 37 ° C, la temperatura ideale per le cellule tumorali, e 28,5 ° C, la temperatura ideale per zebrafish. </li><li> A segnare intravasation, seguire le linee guida descritte nel paragrafo (4) del presente protocollo, ma invece contare il numero di ccellule ancer che hanno invaso con successo nel sistema vascolare della regione caudale. </li></ol>

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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immune+cell+promotion+of+metastasis.">Immune cell promotion of metastasis.</a> Nature Rev Immunol. 15 (2), 73-86 (2015).</li><li>He, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutrophil-mediated+experimental+metastasis+is+enhanced+by+VEGFR+inhibition+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Neutrophil-mediated experimental metastasis is enhanced by VEGFR inhibition in a zebrafish xenograft model.</a> J Pathol. 227 (4), 431-445 (2012).</li><li>Tulotta, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+signaling+between+human+CXCR4+and+zebrafish+ligands+by+the+small+molecule+IT1t+impairs+the+formation+of+triple-negative+breast+cancer+early+metastases+in+a+zebrafish+xenograft+model.">Inhibition of signaling between human CXCR4 and zebrafish ligands by the small molecule IT1t impairs the formation of triple-negative breast cancer early metastases in a zebrafish xenograft model.</a> Dis Model Mech. 9 (2), 141-153 (2016).</li><li>Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M. I., Elworthy, S., Ingham, P. W., Whyte, M. K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transgenic+zebrafish+model+of+neutrophilic+inflammation.">A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation.</a> Blood. 108 (13), 3976-3978 (2006).</li><li>Berens, E. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keratin-associated+protein+5-5+controls+cytoskeletal+function+and+cancer+cell+vascular+invasion.">Keratin-associated protein 5-5 controls cytoskeletal function and cancer cell vascular invasion.</a> Oncogene. , (2016).</li></ol>

The authors have no conflicts of interest to disclose.

Questa tecnica utilizza il modello zebrafish per testare efficacemente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali (vedi Figura 1). Qui abbiamo applicato la tecnica ad un pannello di linee cellulari di cancro al seno, al fine di fornire una base su cui altri ricercatori possono costruire i propri studi (vedi Tabella 1; figure 2 - 3). L&#39;osservazione che MDA-MB-231 cellule prontamente hanno invaso nella regione caudale embrioni di zebrafish renderebbe quest...

La malattia metastatica è una delle principali cause di mortalità per cancro e molti meccanismi che consentono la diffusione delle cellule tumorali rimangono da scoprire 1. Al fine di una cellula tumorale a metastatizzare con successo, deve prima di invadere attraverso lo stroma che circonda un tumore primario, entra (intravasate) nel sistema circolatorio, sopravvivere in transito, uscita (stravaso) dalla circolazione, e, infine, stabilire una colonia vitale presso il sito organo lontana 2. Intravasation e stravaso sono quindi una tappa fondamentale verso la cascata metastatica, eppure ogni cellula tumorale non è intrinsecamente abili a interrompere e la migrazione attraverso giunzioni endoteliali 3. In realtà, ci sono una serie di pressioni selettive uniche che circondano invasione vascolare delle cellule tumorali e il processo può essere ulteriormente influenzata da una varietà di fattori endogeni ed esogeni 4. Per queste ragioni, le tecniche che analizzano il comportamento aggressivo di cancro in fase avanzata spesso si concentrano su vascular capacità invasiva come un mezzo per prevedere diffusione metastatica. Vari sistemi modello esistono per facilitare lo studio di invasione vascolare delle cellule tumorali in vitro. Il più utilizzato in vitro coinvolgono sia sistemi transwell per valutare la migrazione delle cellule tumorali attraverso una tecnologia elettrica Cell-substrato impedenza di rivelazione (ECIS) barriera endoteliale 5 o per monitorare l&#39;interruzione in tempo reale di un monostrato endoteliale intatto dalle cellule tumorali 6. Questi test in genere non hanno la dinamica dei fluidi e fattori stromali che altrimenti un impatto attaccamento delle cellule tumorali ad una parete endoteliale. Questo problema è in qualche modo aggirato da reti vascolari perfusable che nascono dalla cultura 3D di endoteli con il supporto di cellule stromali, e questi sistemi microfluidici 3D ora rappresentano la prima linea di corrente in vitro opzioni 7,8. Tuttavia, questi approcci omettono microambiente robusta di un sistema circolatorio funzionantee quindi solo in parte sostituto per modelli in vivo. Il più utilizzato nel modello vivo di invasione vascolare è il mouse, in cui saggi metastasi sperimentali sono comunemente eseguiti perché si verificano in tempi relativamente brevi e sono generalmente indicativi di capacità metastatica 9. Questi test comportano l&#39;iniezione diretta delle cellule tumorali in circolazione e quindi modellare le fasi finali della metastasi, cioè stravaso e delle cellule del cancro della colonizzazione degli organi. I saggi metastasi sperimentali variano a seconda del sito di iniezione delle cellule tumorali e gli organi infine analizzati. Nel primo tipo di saggio, cellule tumorali vengono iniettate nella vena della coda di topi e semina delle cellule del cancro ai polmoni è monitorata 10,11. Il secondo saggio comprende l&#39;esecuzione di iniezioni intracardiaci per dirigere semina metastatico verso il microambiente del midollo 12-14, ma anche il cervello 15. Nel terzo test, il cancro cells vengono iniettati milza per permettere la colonizzazione del fegato 16 mentre il quarto percorso di consegna nella carotide trasporta cellule tumorali al cervello 17,18. Indipendentemente dal metodo di consegna delle cellule tumorali, la colonizzazione organo è il punto finale sperimentale accettato e viene generalmente determinato tramite luminescenza, istologia, o tecniche di PCR-based. Nonostante i vantaggi fisiologici di condurre test di metastasi sperimentali all&#39;interno di un host murino, questi esperimenti richiedono ancora settimane o mesi per completare e analizzare. Il modello di zebrafish (Danio rerio) ha recentemente emerso come un nuovo sistema per studiare la progressione del cancro 19,20, e permette per la valutazione di invasione vascolare delle cellule tumorali all&#39;interno di un sistema circolatorio funzionale su un arco di tempo molto più breve se confrontato con i topi 21-24. Il metodo utilizza un ceppo zebrafish trasparente che ha la sua endoteli etichettato con una barriera verde fluo corallinagiornalista proteine fluore- guidato dal promotore kdrl, il recettore zebrafish per endoteliali fattore di crescita vascolare 25. Nel saggio, le cellule tumorali sono etichettati con un marcatore fluorescente rosso e iniettato nel seno precardiac di 2 giorni embrioni. Ovunque tra 48 a 96 ore dopo l&#39;iniezione, le cellule tumorali che hanno invaso fuori del sistema vascolare e nella regione caudale embrioni possono essere lanciati in modo efficiente su un microscopio a fluorescenza. Qui si applica la tecnica di un panel di linee di cellule umane di cancro al seno comunemente usati per dimostrare forti differenze nella loro capacità invasiva vascolare. Inoltre, abbiamo dimostrato che cambiare il sito di iniezione al sacco embrionale tuorlo permette per lo studio delle interazioni cellulari eterogenee, come le popolazioni di cellule del cancro possono essere etichettati con differenziale coloranti fluorescenti e iniettate in embrioni di zebrafish prive di vascolarizzazione fluorescente. In quest&#39;ultimo test, le cellule tumorali che hanno invaso il tuorlo e intravasated nella vasculature sono segnato nella regione caudale 24-48 ore dopo l&#39;iniezione. A causa l&#39;efficacia e la convenienza di questo modello, zebrafish sono sempre più impiegati per testare rapidamente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali in un ambiente fisiologico.

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>100 mm Dishes</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-100</td><td></td></tr><tr><td>5 3/4&quot; Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass</td><td>Fisher Brand</td><td>13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>60 mm Dish</td><td>Corning Incorporated</td><td>3160-60</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Low Melting</td><td>Fisher</td><td>BP165-25</td><td></td></tr><tr><td>Agarose, Molecular Grade</td><td>Bioline</td><td>BIO-41026</td><td></td></tr><tr><td>Capillary Glass, Standard, 1.2 mm x 0.68 mm, 4&quot;</td><td>A-M Systems, Inc</td><td>627000</td><td></td></tr><tr><td>David Kopf 700C Vertical Pipette Puller</td><td>Hofstra Group</td><td>3600</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Electrode Storage Jar, 1.0 mm</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>E210</td><td></td></tr><tr><td>Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)</td><td>Fluka</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>Eyelash Brush</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>113</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-12</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Transfer Pipettes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-711-7M</td><td></td></tr><tr><td>Gel Loading Pipet Tips</td><td>Fisher Brand</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Glass Bottom Dishes (12.0 mm)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>150680</td><td></td></tr><tr><td>Glass Depression Slide</td><td>VWR</td><td>470005-634</td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt, Sea Salt</td><td>Pentair</td><td>IS50</td><td></td></tr><tr><td>Latex Rubber Bulbs, 2 ml, Pack of 72</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS20622B</td><td></td></tr><tr><td>SP8 Confocal Microscope</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulator</td><td>Narishige</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse E600</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-G Potassium</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP914-100</td><td></td></tr><tr><td>Petri Plates, 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Brand</td><td>&amp;nbsp;FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer II</td><td>General Valve Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>11875-093</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin Sulfate</td><td>Fisher Biotech</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiI</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22885</td><td></td></tr><tr><td>Vybrant DiO</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V22886</td><td></td></tr><tr><td>Zebrafish&amp;nbsp;</td><td>Georgetown Zebrafish Shared Resources</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

testing the vascular invasive ability of cancer cells in zebrafish (danio rerio)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Qui abbiamo testato la capacità invasiva vascolare comunemente utilizzate linee di cellule di cancro al seno in un modello di zebrafish (Figura 1). criteri rigorosi sono stati impiegati nel punteggio stravaso per queste diverse linee cellulari, dove gli eventi positivi sono stati contati solo se le cellule tumorali avevano chiaramente uscito dai vasi, questo essere fatto principalmente per limitare eventuali falsi positivi che potrebbero derivare da segnando detriti cel...

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Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish Danio Rerio

Questo metodo utilizza zebrafish embrioni per testare efficacemente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali. le cellule tumorali fluorescenti sono iniettati nel precardiac seno o il sacco vitellino di embrioni in via di sviluppo. invasione vascolare delle cellule tumorali e stravaso è valutata mediante microscopia a fluorescenza della regione di coda 24-96 ore più tardi.

Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish (<em&gt; Danio Rerio</em&gt;)

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression.  Traditional in vitro models of cancer cell invasion of ...

testing-vascular-invasive-ability-cancer-cells-zebrafish-danio

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Testing the Vascular Invasive Ability of Cancer Cells in Zebrafish (Danio Rerio)

11.9K Views.  Georgetown University.  Questo metodo utilizza zebrafish embrioni per testare efficacemente la capacità invasiva vascolare delle cellule tumorali. le cellule tumorali fluorescenti sono iniettati nel precardiac seno o il sacco vitellino di embrioni in via di sviluppo. invasione vascolare delle cellule tumorali e stravaso è valutata mediante microscopia a fluorescenza della regione di coda 24-96 ore più tardi. 

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Mosaic Zebrafish Transgenesis for Functional Genomic Analysis of Candidate Cooperative Genes in Tumor Pathogenesis

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers. To robustly and efficiently identify oncogenic &#8220;drivers&#8221; among these tumors and define their complex relationships with concurrent genetic alterations during tumor pathogenesis remains a daunting task. Recently, zebrafish have emerged as an important animal model for studying human diseases, largely because of their ease of maintenance, high fecundity, obvious advantages for in vivo imaging, high conservation of oncogenes and their molecular pathways, susceptibility to tumorigenesis and, most importantly, the availability of transgenic techniques suitable for use in the fish. Transgenic zebrafish models of cancer have been widely used to dissect oncogenic pathways in diverse tumor types. However, developing a stable transgenic fish model is both tedious and time-consuming, and it is even more difficult and more time-consuming to dissect the cooperation of multiple genes in disease pathogenesis using this approach, which requires the generation of multiple transgenic lines with overexpression of the individual genes of interest followed by complicated breeding of these stable transgenic lines. Hence, use of a mosaic transient transgenic approach in zebrafish offers unique advantages for functional genomic analysis in vivo. Briefly, candidate transgenes can be coinjected into one-cell-stage wild-type or transgenic zebrafish embryos and allowed to integrate together into each somatic cell in a mosaic pattern that leads to mixed genotypes in the same primarily injected animal. This permits one to investigate in a faster and less expensive manner whether and how the candidate genes can collaborate with each other to drive tumorigenesis. By transient overexpression of activated ALK in the transgenic fish overexpressing MYCN, we demonstrate here the cooperation of these two oncogenes in the pathogenesis of a pediatric cancer, neuroblastoma that has resisted most forms of contemporary treatment.

The goal of this study is to demonstrate how the mosaic transgenesis strategy can be used in zebrafish to rapidly and efficiently assess the relative contributions of multiple oncogenes in tumor initiation and progression in vivo.

Mosaic Zebrafish Transgenesi per analisi genomica funzionale di geni candidati cooperative in Tumor Patogenesi

Comprehensive genomic analysis has uncovered surprisingly large numbers of genetic alterations in various types of cancers.  To robustly and efficiently ...

Ricerca

Biologia dello sviluppo

Invasive Behavior of Human Breast Cancer Cells in Embryonic Zebrafish

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying cancer metastasis in vivo, other efficient, reliable, low-cost models are needed to quickly access the potential effects of (epi)genetic changes or pharmacological compounds. As such, we illustrate and explain the feasibility of xenograft models using human breast cancer cells injected into zebrafish embryos to support this goal. Under the microscope, fluorescent proteins or chemically labeled human breast cancer cells are transplanted into transgenic zebrafish embryos, Tg (fli:EGFP), at the perivitelline space or duct of Cuvier (Doc) 48 h after fertilization. Shortly afterwards, the temporal-spatial process of cancer cell invasion, dissemination, and metastasis in the living fish body is visualized under a fluorescent microscope. The models using different injection sites, i.e., perivitelline space or Doc are complementary to one another, reflecting the early stage (intravasation step) and late stage (extravasation step) of the multistep metastatic cascade of events. Moreover, peritumoral and intratumoral angiogenesis can be observed with the injection into the perivitelline space. The entire experimental period is no more than 8 days. These two models combine cell labeling, micro-transplantation, and fluorescence imaging techniques, enabling the rapid evaluation of cancer metastasis in response to genetic and pharmacological manipulations.

Here, we describe xenograft zebrafish models using two different injection sites, i.e., perivitelline space and duct of Cuvier, to investigate the invasive behavior and to assess the intravasation and extravasation potential of human breast cancer cells, respectively.

Invasiva comportamento delle cellule cancro al seno umano in Zebrafish embrionali

In many cases, cancer patients do not die of a primary tumor, but rather because of metastasis. Although numerous rodent models are available for studying ...

Ricerca sul cancro

Transplantation of Zebrafish Pediatric Brain Tumors into Immune-competent Hosts for Long-term Study of Tumor Cell Behavior and Drug Response

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to assess potential patient response to therapy. Current methods largely depend on using syngeneic or immune-compromised animals to avoid rejection of the tumor graft. Such methods require the use of specific genetic strains that often prevent the analysis of immune-tumor cell interactions and/or are limited to specific genetic backgrounds. An alternative method in zebrafish takes advantage of an incompletely developed immune system in the embryonic brain before 3 days, where tumor cells are transplanted for use in short-term assays (i.e., 3 to 10 days). However, these methods cause host lethality, which prevents the long-term study of tumor cell behavior and drug response. This protocol describes a simple and efficient method for the long-term orthotopic transplantation of zebrafish brain tumor tissue into the fourth ventricle of a 2-day-old immune-competent zebrafish. This method allows: 1) long-term study of tumor cell behaviors, such as invasion and dissemination; 2) durable tumor response to drugs; and 3) re-transplantation of tumors for the study of tumor evolution and/or the impact of different host genetic backgrounds. In summary, this technique allows cancer researchers to assess engraftment, invasion, and growth at distant sites, as well as to perform chemical screens and cell competition assays over many months. This protocol can be extended to studies of other tumor types and can be used to elucidate mechanisms of chemoresistance and metastasis.

The transplantation of cancer cells is an important tool for the identification of cancer mechanisms and therapeutic responses. Current techniques depend on immune-incompetent animals. Here, we describe a method to transplant zebrafish tumor cells into immune-competent embryos for the long-term analysis of tumor cell behavior and in vivo drug responses.

Il trapianto di tumori del cervello pediatrico di Zebrafish in ospedali immunitario-competenti per uno studio a lungo termine del comportamento della cellula tumorale e della risposta ai farmaci

Tumor cell transplantation is an important technique to define the mechanisms controlling cancer cell growth, migration, and host response, as well as to ...

In Vivo Imaging and Quantitation of the Host Angiogenic Response in Zebrafish Tumor Xenografts

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A zebrafish xenograft is created by implanting mammalian tumor cells into the perivitelline space of two days-post-fertilization zebrafish embryos, followed by measuring the extent of the angiogenic response observed at an experimental endpoint up to two days post-implantation. The key advantage to this method is the ability to accurately quantitate the zebrafish host angiogenic response to the graft. This enables detailed examination of the molecular mechanisms as well as the host vs tumor contribution to the angiogenic response. The xenografted embryos can be subjected to a variety of treatments, such as incubation with potential anti-angiogenesis drugs, in order to investigate strategies to inhibit tumor angiogenesis. The angiogenic response can also be live-imaged in order to examine more dynamic cellular processes. The relatively undemanding experimental technique, cheap maintenance costs of zebrafish and short experimental timeline make this model especially useful for the development of strategies to manipulate tumor angiogenesis.

The aim of this method is to generate an in vivo model of tumor angiogenesis by xenografting mammalian tumor cells into a zebrafish embryo that has fluorescently-labelled blood vessels. By imaging the xenograft and associated vessels, a quantitative measurement of the angiogenic response can be obtained.

Imaging in vivo e quantitazione dell'ospite risposta angiogenica in Xenogrfts tumore zebrati

Tumor angiogenesis is a key target of anti-cancer therapy and this method has been developed to provide a new model to study this process in vivo. A ...

Drug Screening of Primary Patient Derived Tumor Xenografts in Zebrafish

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the standard in the field, but zebrafish have emerged as an alternative model with several advantages, including the ability for high-throughput and low-cost drug screening. Zebrafish also allow for in vivo drug screening with large replicate numbers that were previously only obtainable with in vitro systems. The ability to rapidly perform large scale drug screens may open up the possibility for personalized medicine with rapid translation of results back to clinic. Zebrafish xenograft models could also be used to rapidly screen for actionable mutations based on tumor response to targeted therapies or to identify new anti-cancer compounds from large libraries. The current major limitation in the field has been quantifying and automating the process so that drug screens can be done on a larger scale and be less labor-intensive. We have developed a workflow for xenografting primary patient samples into zebrafish larvae and performing large scale drug screens using a fluorescence microscope equipped imaging unit and automated sampler unit. This method allows for standardization and quantification of engrafted tumor area and response to drug treatment across large numbers of zebrafish larvae. Overall, this method is advantageous over traditional cell culture drug screening as it allows for growth of tumor cells in an in vivo environment throughout drug treatment, and is more practical and cost-effective than mice for large scale in vivo drug screens.

Zebrafish xenograft models allow for high-throughput drug screening and fluorescent imaging of human cancer cells in an in vivo microenvironment. We developed a workflow for large scale, automated drug screening on patient-derived leukemia samples in zebrafish using an automated fluorescence microscope equipped imaging unit.

Screening farmacologico del paziente primario - Tumore derivato Xenotrapianto nel pesce zebra

Patient derived xenograft models are critical in defining how different cancers respond to drug treatment in an in vivo system. Mouse models are the ...

In Vivo Targeting of Xenografted Human Cancer Cells with Functionalized Fluorescent Silica Nanoparticles in Zebrafish

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal models are required for bridging the nanotechnology to its biomedical application. The mouse represents the traditional animal model for preclinical testing; however, mice are relatively expensive to keep and have long experimental cycles due to the limited progeny from each mother. The zebrafish has emerged as a powerful model system for developmental and biomedical research, including cancer research. In particular, due to its optical transparency and rapid development, zebrafish embryos are well suited for real-time in vivo monitoring of the behavior of cancer cells and their interactions with their microenvironment. This method was developed to sequentially introduce human cancer cells and functionalized nanoparticles in transparent Casper zebrafish embryos and monitor in vivo recognition and targeting of the cancer cells by nanoparticles in real time. This optimized protocol shows that fluorescently labeled nanoparticles, which are functionalized with folate groups, can specifically recognize and target metastatic human cervical epithelial cancer cells labeled with a different fluorochrome. The recognition and targeting process can occur as early as 30 min postinjection of the nanoparticles tested. The whole experiment only requires the breeding of a few pairs of adult fish and takes less than 4 days to complete. Moreover, zebrafish embryos lack a functional adaptive immune system, allowing the engraftment of a wide range of human cancer cells. Hence, the utility of the protocol described here enables the testing of nanoparticles on various types of human cancer cells, facilitating the selection of optimal nanoparticles in each specific cancer context for future testing in mammals and the clinic.

Described here is a method for utilizing zebrafish embryos to study the ability of functionalized nanoparticles to target human cancer cells in vivo. This method allows for the evaluation and selection of optimal nanoparticles for future testing in large animals and in clinical trials.

In Vivo Targeting di cellule tumorali umane Xenografted con nanoparticelle di silice fluorescenti funzionalizzate nel pesce zebra

Developing nanoparticles capable of detecting, targeting, and destroying cancer cells is of great interest in the field of nanomedicine. In vivo animal ...

Generation of Zebrafish Larval Xenografts and Tumor Behavior Analysis

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly visualizing the response to anti-cancer therapies (chemo, radiotherapy, and biologicals), angiogenesis and metastasis with single cell resolution, places the zebrafish xenograft model as a top choice to develop preclinical studies.

The zebrafish larval xenograft assay presents several experimental advantages compared to other models, but probably the most striking is the reduction of size scale and consequently time. This reduction of scale allows single cell imaging, the use of a relatively low number of human cells (compatible with biopsies), medium-high-throughput drug screenings, but most importantly enables a significant reduction of the time of the assay. All these advantages make the zebrafish xenograft assay extremely attractive for future personalized medicine applications.

Many zebrafish xenograft protocols have been developed with a wide diversity of human tumors; however, a general and standardized protocol to efficiently generate zebrafish larval xenografts is still lacking. Here we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Here, we provide a step-by-step protocol, with tips to generate xenografts and guidelines for tumor behavior analysis, whole-mount immunofluorescence, and confocal imaging quantification.

Generazione di xenografti larvali zebrafish e analisi del comportamento tumorale

Zebrafish larval xenografts are being widely used for cancer research to perform in vivo and real-time studies of human cancer. The possibility of rapidly ...

Zebrafish Model of Neuroblastoma Metastasis

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing technologies applied in zebrafish modeling, the ease of maintenance, high-yield productivity, and powerful live imaging altogether make the zebrafish a valuable model system to study metastasis and cellular and molecular bases underlying this process in vivo. The first zebrafish neuroblastoma (NB) model of metastasis was developed by overexpressing two oncogenes, MYCN and LMO1, under control of the dopamine-beta-hydroxylase (d&#946;h) promoter. Co-overexpressed MYCN and LMO1 led to the reduced latency and increased penetrance of neuroblastomagenesis, as well as accelerated distant metastasis of tumor cells. This new model reliably reiterates many key features of human metastatic NB, including involvement of clinically relevant and metastasis-associated genetic alterations; natural and spontaneous development of metastasis in vivo; and conserved sites of metastases. Therefore, the zebrafish model possesses unique advantages to dissect the complex process of tumor metastasis in vivo.

This paper introduces the method of developing, characterizing, and tracking in real-time the tumor metastasis in zebrafish model of neuroblastoma, specifically in the transgenic zebrafish line with overexpression of MYCN and LMO1, which develops metastasis spontaneously.

Zebrafish Modello di Metastasi del Neuroblastoma

Zebrafish has emerged as an important animal model to study human diseases, especially cancer. Along with the robust transgenic and genome editing ...

Utilizzo delle larve di pesce zebra per studi efficienti sui tumori in vivo

A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we present larval zebrafish as a transplant model that has numerous advantages over murine models, including ease of handling, low expense, and short experimental duration. Moreover, the absence of an adaptive immune system during larval stages obviates the need to generate and use immunodeficient strains. While established protocols for xenotransplantation in zebrafish embryos exist, we present here an improved method involving embryo staging for faster transfer, survival analysis, and the use of flow cytometry to assess disease burden. Embryos are staged to facilitate rapid cell injection into the yolk of the larvae and cell marking to monitor the consistency of the injected cell bolus. After injection, embryo survival analysis is assessed up to 7 days post injection (dpi). Finally, disease burden is also assessed by marking transferred cells with a fluorescent protein and analysis by flow cytometry. Flow cytometry is enabled by a standardized method of preparing cell suspensions from zebrafish embryos, which could also be used in establishing the primary culture of zebrafish cells. In summary, the procedure described here allows a more rapid assessment of the behavior of tumor cells in vivo with larger numbers of animals per study arm and in a more cost-effective manner.

Autore in primo piano: Avanzamento delle terapie antitumorali utilizzando lo xenotrapianto tumorale nel pesce zebra

We describe a protocol for xenotransplantation into the yolk of transparent zebrafish embryos that is optimized by a simple, rapid staging method. Post-injection analyses include survival and assessing the disease burden of xenotransplanted cells by flow cytometry.

Un metodo semplice, rapido ed efficace per l'analisi dello xenotrapianto tumorale in embrioni trasparenti di zebrafish

In vivo studies of tumor behavior are a staple of cancer research; however, the use of mice presents significant challenges in cost and time. Here, we ...

Testare la capacità vascolare invasiva delle cellule tumorali in Zebrafish (

Riepilogo

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Capitoli in questo video

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