LHB è stato finanziato dal programma di dottorato cellulare Wellcome Trust dinamico; KAR è stata finanziata dal MRC progetto di sovvenzione MR / L002566 / 1 (assegnato a EJR e CLH) e CLH è stato finanziato da Aruk concessione 19479. Vorremmo anche ringraziare l&#39;impianto Wolfson Bioimmagini per un consiglio di imaging.

Tutti i passaggi all&#39;interno del protocollo seguono l&#39;Università di cura degli animali di Bristol e le linee guida di assistenza sociale e quelli del Regno Unito Home Office. 1. Visualizzazione muscoloscheletrico Anatomia NOTA: per visualizzare la forma degli elementi scheletrici, per quantificare muscolare e per identificare l&#39;esatto posizionamento delle inserzioni muscolari, immunostain (punto 1.1) pesci all&#39;età appropriata per miosina scheletrica (che rivela muscolare) e collagene di tipo II (per visualizzare cartilagine). In alternativa, visualizzare l&#39;anatomia muscolo-scheletrico utilizzando linee transgeniche reporter fluorescente, come il collagene A1 giornalista COL2A1: mCherry 13,14 di visualizzare la cartilagine e il lento miosina catena pesante giornalista smyhc: GFP 15 per visualizzare la posizione delle inserzioni muscolari (sezione 1.2). linee alternative che segnano cartilagine e muscolo potrebbe funzionare altrettanto bene. <ol><li> fluorescente Immunostavorazio <ol><li> Fix larva superiore 4% paraformaldeide (PFA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per 1 ora. Lavare in PBS con 0,1% Tween 20 (PBT) e disidratare in metanolo al 50% (MeOH) in PBT e 100% MeOH per 5 min, rispettivamente. Attenzione: PFA è tossico e deve essere maneggiato secondo il foglio di materiale di sicurezza. NOTA: Larva può essere immagazzinato in 100% MeOH fino all&#39;utilizzo. </li><li> Reidratare larva nel 50% MeOH in PBT per 5 min. Lavare in PBT per 5 min. </li><li> Permeabilize larva a 0,25% tripsina in PBT in ghiaccio per 5-6 min. Lavare a 4x PBT per 5 minuti ciascuna. </li><li> Bloccare per 2-3 ore a 5% di siero in PBT. </li><li> Incubare larva nella diluizione raccomandata di coniglio anti-collagene di tipo 2 e mouse anticorpi anti-miosina in 5% di siero in PBT per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. NOTA: L&#39;intervallo di diluizione raccomandata è normalmente sulla scheda tecnica degli anticorpi. Scegli anticorpi che vengono sollevate contro le specie diverse tra loro e che sono anche diffenoleggiare al tessuto. </li><li> Lavare 6x larva per 15 minuti in PBT. </li><li> Bloccare per 1-2 ore a 5% di siero in PBT. </li><li> Incubare in anticorpi secondari nel buio. Utilizzare fluorescente anti-topo (550) e anti-coniglio (488) anticorpi secondari ad una diluizione appropriata in 5% di siero e PBT per l&#39;anticorpo specifico. </li><li> Lavare 6X per 10 minuti ciascuno in PBT e immagine su un microscopio confocale 10 volte il più presto possibile. </li></ol></li><li> Imaging muscoloscheletrico Geometria <ol><li> Montare le larve ventrale su un vetrino in condizioni di scarsa agarosio tiepida 0,3-0,5% punto di fusione (LMP) in soluzione di Danieau 16. NOTA: i pesci transgenici dovrà essere sedato a 0,02% MS222 (Tricaine metanosolfonato, pH 7) prima del montaggio e durante l&#39;imaging. </li><li> Prendete una immagine Pila confocale della regione di interesse utilizzando il 10X lente dell&#39;obiettivo e lo zoom digitale di circa 2,5 volte. Preparare le immagini del canale verde e rosso con il 488 nm e 561 nm Laser rispettivamente. Immagine ad una risoluzione pixel 512 x 512 con un intervallo tra z piani di 1,3 micron e 3 medie linea. Lo stack risultante sarà composta da circa 100 fette z. </li><li> Esportare i dati come una serie tiff. Proiezioni massime degli elementi muscolari e cartilagine da una larva zebrafish 5dpf sono mostrati in Figura 1. </li></ol></li></ol> 2. Creazione di una superficie 3D <ol style="margin-left: 40px;"><li> Scegliere un set di dati rappresentante per ogni punto di tempo a 3, 4 e 5 dpf (scegliere dopo la visualizzazione di campioni multipli). </li><li> Aprire pila tiff 3-dimensionale e selezionare tutti i canali di software di analisi. Fare clic destro sul canale cartilagine e selezionare il filtro immagine e levigante: gaussiana (Figura 2B). </li><li> In vista del progetto tasto destro del mouse sull&#39;immagine filtrata e selezionare &#39;segmentazione&#39; e poi &#39;editare nuova etichetta&#39;. Creare una nuova etichetta per ogni materiale, vale a dire, cartilagine e jmisto. Selezionare la regione cartilagine dell&#39;immagine (Figura 2C, il segnale bianco, contorno viola) utilizzando lo strumento bacchetta magica. Utilizzare lo strumento pennello per rimuovere il rumore dagli schemi. NOTA: Se si utilizza strumento bacchetta magica, clicca su &#39;Tutte le sezioni. </li><li> Selezionare la regione congiunta con lo strumento pennello e assegnare a un componente comune (Figura 2C, blu contorno) </li><li> Smooth più sezioni contemporaneamente selezionando la segmentazione nel menu in alto e le etichette lisce. Fare clic destro sull&#39;immagine e selezionate generare superfici per produrre un rendering 3D di superficie del componente (Figura 2D). </li><li> Fare clic sulla superficie e salvare i dati come file hmascii per l&#39;importazione in software meshing. </li></ol> 3. Calcolo delle forze muscolari per essere utilizzati nel modello FE <ol style="margin-left: 40px;"><li> Contare il numero di fibre muscolari da immagini confocale di smyhc: GFP zebrafish transgenico (Figura 1A, punta di freccia, 1C) e misurare il diametroeter delle fibre per calcolare la loro area di sezione trasversale (πr 2). </li><li> Identificare adatto forza per unità di area muscolare dalla letteratura. La forza muscolare massima generata per unità di superficie per i muscoli scheletrici zebrafish larvali (40 nN / micron 2) sono stati utilizzati 17. </li><li> Calcolare le forze per ogni gruppo muscolare anatomica moltiplicando il numero di fibre e la loro area dalla forza per unità di superficie. Vedere la Tabella 1. </li></ol> 4. Generazione di una Mesh <ol style="margin-left: 40px;"><li> Importare il modello 3D generato nella sezione 2 (sopra) in un pacchetto software in grado di generare una mesh di elementi finiti. </li><li> Genera A2D maglie della cartilagine e superfici articolari tramite funzione termoretraibile nel menu 2D. Scegli una dimensione di elemento appropriato. Nota: utilizzare una dimensione elemento tra 1,5-2,5. Se necessario, generare una serie di superficie 2D in modo diverso dimensioni maglie di effettuare l&#39;ottimizzazione mesh 3D (sezione 4.4). </li><li> Effettuare controlli di qualità maglia trovati sotto &#39;2D&gt; Strumenti&gt; Controlla gli elementi&#39; pannello per verificare la presenza di elementi duplicati, inserzioni e degli attraversamenti di mesh. Fissare angoli diedri utilizzando la scheda di utilità nella struttura ad albero modello. </li><li> Generare una mesh 3D da maglie di superficie 2D di diverse dimensioni dell&#39;elemento utilizzando il pannello secondario 3D&gt; Tetramesh. NOTA: Confrontare i risultati di diverse dimensioni di maglia e selezionare il modello FE con la dimensione di maglia più bassa che converge dopo ulteriori simulazioni e non comprometta la definizione caratteristica. L&#39;esempio in figura 3 contiene 1,5 milioni di elementi tetraedrici per le cartilagini mascella inferiore e aveva una dimensione di elemento 2D di 2,0. </li><li> Trasformare la rete in modo mascella modello è in scala, come per ogni stack confocale utilizzando la geometria&gt; Distanza pannello secondario. NOTA: Assicurarsi che la cartilagine e componenti comuni sono collegati nel modello esportando un modello di fusione o utilizzando legami. </li></ol> 5. Finite Element ModEL costruzione <ol><li> Utilizzando il software commerciale ad elementi finiti (FE), creare un modello FE. Usando il muscolo 3D e cartilagine etichettati pile confocale generati nella sezione 1 come guida, assegnare nodi che corrispondono ai punti di attacco muscolare. Creare un vettore tra due nodi che rappresentano l&#39;origine e l&#39;inserimento di ciascun muscolo (Figura 3). </li><li> Creare un collezionista carico di tipo &#39;storia&#39; di applicare un &#39;carico C&#39; per ogni muscolo. Specificare la grandezza in newton (calcolati in fase 3.3) e assegnare il vettore associato. La figura 3 mostra i punti di fissaggio per il mandibulae adduttore (AM), goniometro hyoideus (PH) e intermandibularis (IM). NOTA: Per questi muscoli della mascella, massima forza contrattile è distribuita tra l&#39;origine e l&#39;inserimento in modo che solo il 50% di ciascun carico viene applicato in ogni sito. </li><li> Assegnare opportune proprietà elastiche del materiale isotropo come determinato dalla letteratura. modulo di Young per la cartilaginee il Interzone in questo modello sono stati 1,1 MPa e 0,25 MPa, rispettivamente, e il rapporto di Poisson è stato 0,25 per entrambi 18,19. </li><li> Creare un collezionista carico di tipo &#39;di confine&#39; di applicare i vincoli iniziali sul modello. Vai alla scheda Analisi&gt; Vincoli e nel pannello secondario creare, raccogliere i nodi sul modello che si desidera limitare. Selezionare i gradi di libertà (DOF) che il movimento limite del modello per la migliore approssimazione della sua gamma di movimento naturale. NOTA: Il modello in figura 3 è vincolato in tutti gli assi di moto (DOF: 1, 2, 3 rappresentano x, y, z, rispettivamente) alla ceratohyal per ancorarlo nello spazio in un punto intermedio nel modello e nel assi yez nel punto in cui la palatoquadrate collega al resto del cranio zebrafish (Figura 3, Tabella 1). Il modello deve essere vincolato in tutti e tre DOF in almeno un nodo. </li><li> Creare un &#39;carico passo&#39;, per ogni tipo di movimento che si desidera simulate (cioè, apertura, chiusura), sotto il menu di analisi e selezionare tutti i carichi rilevanti (realizzati nella sezione 5.2) e dei vincoli (made in Sezione 5.4) per simulare questo movimento. Seleziona &#39;Static&#39; dal menu a tendina quando viene visualizzato. </li><li> modello di esportazione comprese le maglie, i carichi, i vincoli e le proprietà del materiale in un formato di file appropriato, in questo formato caso &quot;.inp&quot;. </li><li> Modello di carico in software di analisi FE. Creare ed eseguire un lavoro per il modello utilizzando il modulo di lavoro. </li><li> Analizzare l&#39;uscita per lo stress, affaticamento, spostamento, ecc trovato nei risultati scheda e il menu di visualizzazione (figura 4 e 5). </li></ol> 6. Validazione di Jaw Deformazione / Displacement Distanze <ol><li> Selezionare 3-6 Tg (Col2a1aBAC: mCherry) zebrafish transgenico. </li><li> Leggermente anestetizzare le larve con 0,02% MS222 fino a che non cessano di rispondere al tatto, ma i loro cuori sono ancora battendo. </li><li> Montarele larve lateralmente (mentre anestetizzato) su vetrini in tiepida 1% LMP agarosio (composto in soluzione di Danieau). </li><li> Rimuovere l&#39;agarosio dalla intorno alla testa e la mandibola con una pinza. </li><li> Lavare soluzione fresca di Danieau (senza MS222) sopra la testa della larva di rimuovere l&#39;anestesia con una pipetta Pasteur fino normali movimenti della bocca riprendere. </li><li> Utilizzare il software di acquisizione di film a prendere campo chiaro video ad alta velocità dei movimenti della bocca. Prendere i film di circa un minuto nella durata al massimo frame rate, o sufficiente per registrare più cicli di apertura della mascella. </li><li> Scegli fotogrammi che mostrano la mascella aperta al suo spostamento massimo. Misurare la distanza tra la punta anteriore della cartilagine di Meckel e la mascella superiore (punta della piastra ethmoid) in micron. </li><li> Calcolare la cilindrata media da più larve di pesci. </li><li> Estrarre i dati di spostamento dal modello. Utilizzare lo spostamento medio calcolato in 6.8 per verificare il comportamento dello spostamento del modello ( <strong&gt; Figura 4). Se il modello si discosta da aspettarsi, analisi di sensitività gestito alterando in sequenza le proprietà del materiale e dei carichi muscolari. </li></ol>

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Gli autori non hanno nulla da rivelare. Alcuni dati delle figure 3-5 è stato ristampato da J.Biomech, 48 (12), Brunt et al., Elemento di modellazione Finite prevede cambiamenti di forma congiunta e il comportamento delle cellule a causa della perdita di tensione muscolare in fase di sviluppo della mascella, 3112-22. 2015, con il permesso di Elsevier 15.

Modelli ad elementi finiti sono stati utilizzati per collegare le aree di elementi scheletrici che sono sotto sforzo con quelli in fase di formazione ossea 10, così come per mappare le aree sotto sforzo durante encondrale e morfogenesi giunto 8,12,21. Altri studi sono stati anche in grado di applicare modelli di crescita teorici per replicare le modifiche durante lo sviluppo congiunto 11,12. Qui vi mostriamo il protocollo per la costruzione di modelli FE per un sistema relativamente semplice, la mascella zebrafish 20. A differenza dei metodi alternativi di raccolta immagini RAW per i modelli FE, come la TAC 22, l&#39;imaging confocale di linee transgeniche o zebrafish immunostained consente più tessuti da studiare. Si può, quindi, di fornire informazioni dirette sui punti di attacco muscolare in relazione alla cartilagine. Tra i modelli vertebrati zebrafish sono particolarmente suscettibili di manipolazione genetica e farmacologica. La generazione di modelli FE per zebrafishcartilagine craniofacciale ora apre la possibilità di un ulteriore studio della interazione tra biomeccanica e genetica nella morfogenesi congiunta. Ci sono un certo numero di fasi critiche del processo di creazione di un modello FE; il primo sta generando una accurata rappresentazione tridimensionale del sistema. Ciò richiede l&#39;imaging a una risoluzione abbastanza alta per definire chiaramente i confini. Si noti che anche con imaging ad alta risoluzione per fare una buona superficie di uno può avere per appianare alcune regioni. Un altro passo importante è la definizione del corretto posizionamento del carico e vincoli corretti. Un modello sufficientemente vincolato mancherà di risolvere e scorretto posizionamento dei carichi provoca movimenti anomali. Alcuni elaborazione dei dati grezzi (Figura 2) è necessario come superficie generata dai dati grezzi sarebbe difficile maglia (Figura 2B). Abbiamo filtrato i dati utilizzando un filtro gaussiano (Figura 2C </sTrong&gt;) e abbiamo effettuato alcune levigatura manuale delle curve per la produzione di una serie di linee pulite che può essere convertito in una superficie 3D. Troppo lisciatura può produrre una superficie &quot;fuso&quot; che ha perso molte delle sue caratteristiche. La scelta della dimensione di elemento corretto è un processo iterativo come la scelta troppo piccola una dimensione elemento crea troppo grande una maglia che è computazionalmente intensive. Tuttavia, la scelta troppo grandi dimensioni elemento produrrà una maglia che non riesce ricapitolare la corretta forma della struttura. La maglia corretta aveva la dimensione più piccolo elemento che ha catturato la corretta forma della mascella e convergenti su una soluzione corretta, verificata utilizzando lo spostamento della mascella. Può anche essere necessario modificare le proprietà del materiale o calcoli del carico di emulare meglio lo spostamento corretto come diverse età e specie avranno sostanzialmente diverse proprietà. È importante ricordare che ci sono sempre limitazioni un modello ipotetico essumptions fatto per i modelli FE. Quando solo modellare uno o un piccolo numero di campioni è fondamentale per garantire che un campione rappresentativo viene scelto come ci saranno probabilmente piccole variazioni tra gli individui. Poiché solo alcuni degli elementi a ganascia e muscoli sono stati inclusi, il modello è una versione semplificata del sistema muscolo-scheletrico craniofacciale zebrafish. Pertanto, i vincoli dovevano essere posizionato per spiegare dove gli elementi a ganascia modellati sarebbero collegarsi con il resto del cranio e il modello fu artificialmente vincolate al centro per fissarlo in &#39;spazio&#39;. Questo vincolo artificiale non ha impatto sull&#39;interpretazione disegnato dai modelli come il ceratohyal in sé non è stato analizzato. L&#39;inclusione di più della struttura cranio-facciale, in particolare altri apertura della mascella muscoli come i sternohyals e la sua cartilagine allegato 23, potuto aggiungere al modello, ma le limitazioni includono la capacità di modelli più grandi per l&#39;esecuzione del software degli elementi finiti. s = &quot;jove_content&quot;&gt; Un&#39;altra limitazione è che non abbiamo modellato inserimento legamento, anche se ciò potrebbe essere ottenuto mediante l&#39;inserimento di molle 8. Un&#39;altra ipotesi fatte in questo caso era che il modello sarebbe comportato linearmente. Le grandezze dei ceppi sui modelli erano paragonabili a quelle di modelli pubblicati e applicati alle cellule 10,24 in vitro, con ceppi di essere al di sotto di 3500 e sopra -5.000 μɛ parte di vincolo e di attacco muscolare punti. Pertanto, i ceppi alle regioni rilevanti del modello sono state considerate all&#39;interno di un range accettabile per un modello lineare. La cartilagine non si comporta esclusivamente come materia lineare ed è stata precedentemente modellato come un materiale poroelastic, che ha permesso l&#39;analisi del comportamento del fluido nel modello 25. Diffusione i punti di attacco muscolare tra un gruppo di nodi locali avrebbe distribuito le forze di picco e rappresentano più accuratamente l&#39;inserzione muscolo per alcuni muscoli. ent &quot;&gt; L&#39;utilizzo di FE consente una valutazione delle tensioni e sollecitazioni che agiscono su una struttura. Come tecnica è spesso utilizzato in molte discipline bioscienze tra cui ortopedia, paleontologia e, più recentemente, la biologia dello sviluppo. Qui si descrive come costruire FE per il pesce zebra mascella inferiore. in futuro questi modelli potrebbe essere esteso a guardare il corpo della mandibola, compreso il palato. tecniche simili potrebbero essere utilizzate per modellare biomeccanica della colonna vertebrale nei pesci, che fino ad oggi sono in gran parte stati studiati con mezzi cinematici.

Finite Element (FE) modellazione è una tecnica di ingegneria che può computazionalmente calcolare e mappare la grandezza e la posizione di ceppi che agiscono su una struttura di 1. Il modello consiste della struttura 3D, rappresentato da una maglia di &quot;Elementi finiti&quot;, e il risultato finale dell&#39;analisi è governata da una serie di fattori, tra cui la struttura e il numero di elementi della rete, l&#39;entità e la posizione del meccanico carichi e le proprietà del materiale. Le proprietà del materiale descrivono alcuni aspetti del comportamento di un materiale in una determinata tipologia di carico; modulo di Young (E) descrive l&#39;elasticità del materiale mentre il rapporto di Poisson descrive la diminuzione proporzionale alla larghezza di un materiale di sua lunghezza quando un campione viene allungato. FE modellazione può essere usato per calcolare una serie di variabili incluso lo spostamento, lo stress, la pressione e la tensione che agisce sul modello tenendo conto dei dati di ingresso unici sulla struttura &#39;; S forma, la posizione e la grandezza dei carichi e le proprietà dei materiali specifici. FE modellazione è ampiamente utilizzato in ingegneria 2 e sempre per ortopedici 3 e paleontologici applicazioni 4. Nello sviluppo forze biomeccaniche sono noti per agire come stimolo in molte cellule di attivare risposte cellulari 5-8 ed è utile per prevedere entrambe le posizioni relative e grandezze di stimoli meccanici all&#39;interno sviluppare sistemi di organi, tuttavia, attualmente FE modellazione è stato poco usato per lo sviluppo di zebrafish. Sia la cartilagine e ossa hanno dimostrato di essere i materiali meccanosensibili. Ad esempio, la compressione in vitro è stato trovato per attivare percorsi condrogeniche, mentre la tensione ha dimostrato di essere necessario per la formazione ossea 9. FE analisi (FEA) è stata sfruttata per modellare ceppi agendo su campioni biologici, compresi quelli che agiscono sugli elementi scheletrici durante l&#39;osso FOrmazioni 10. Altre applicazioni di sviluppo includono il suo uso per prevedere la forma di un giunto dopo che è stato esposto a forze biomeccaniche teorici 11,12 e per mostrare il modello di ceppi presenti durante pulcino ginocchio morfogenesi giunto 8. Questo protocollo ha lo scopo di condividere l&#39;esperienza di generare superfici 3-dimensionale, maglie e modelli ad elementi finiti dalle immagini confocali al fine di comprendere i meccanismi di tessuti in via di sviluppo. Mostriamo anche modi di validazione dei modelli FE se l&#39;acquisizione di informazioni reale spostamento giunto in vivo. Mentre usiamo mascella zebrafish come esemplare le stesse tecniche possono essere utilizzati su qualsiasi piccola sistema biologico per il quale le informazioni 3D sulla struttura del locomotore può essere ottenuta tramite microscopia confocale o multiphoton.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="937">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Coll2</td>
			<td style="width:237px;">Abcam</td>
			<td style="width:119px;">ab34712</td>
			<td style="width:365px;">Type II collagen antibody - stains all cartilage</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">A4.1025 / MF20</td>
			<td style="width:237px;">Developmental studies hybridoma bank</td>
			<td style="width:119px;">A4.1025</td>
			<td>Skeletal mysoin antibody - marks all skeletal muscle&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Low melt agarose</td>
			<td style="width:237px;">Sigma&#160;</td>
			<td>A9414-5G</td>
			<td>For mounting zebrafish</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">MS222 (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate )</td>
			<td style="width:237px;">Sigma</td>
			<td>E10521-10G</td>
			<td>To make anaesthetic</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin</td>
			<td style="width:237px;">Fisher</td>
			<td>T/3760/48</td>
			<td>sample permeablilisation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 488Mouse IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher</td>
			<td align="right" style="width:119px;">35502</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Dylight 550 Rabbit IgG</td>
			<td style="width:237px;">Thermofisher&#160;</td>
			<td align="right" style="width:119px;">84541</td>
			<td>Secondary antibody</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">SP8/SP5 or SPE confocal</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>For imaging&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;LAS Leica capture software&#160;</td>
			<td style="width:237px;">Leica&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aviso (version 7.0.0)</td>
			<td style="width:237px;">FEI Visualization Science Group</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>3D image analysis software (Section 2)</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Hypermesh part of the Hyperworks package (version 10)</td>
			<td style="width:237px;">Altair Engineering</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE model generating software (Section 4-5)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Abaqus (version 6.14)</td>
			<td style="width:237px;">SIMULIA</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>FE analysis software (Section 5.7-5.8)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

building finite element models to investigate zebrafish jaw biomechanics

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical strain. Skeletal joints are subjected to dynamic mechanical loading. Finite element analysis (FEA) is a computational method, frequently used in engineering that can predict how a material or structure will respond to mechanical input. By dividing a whole system (in this case the zebrafish jaw skeleton) into a mesh of smaller 'finite elements', FEA can be used to calculate the mechanical response of the structure to external loads. The results can be visualized in many ways including as a 'heat map' showing the position of maximum and minimum principal strains (a positive principal strain indicates tension while a negative indicates compression. The maximum and minimum refer the largest and smallest strain). These can be used to identify which regions of the jaw and therefore which cells are likely to be under particularly high tensional or compressional loads during jaw movement and can therefore be used to identify relationships between mechanical strain and cell behavior. This protocol describes the steps to generate Finite Element models from confocal image data on the musculoskeletal system, using the zebrafish lower jaw as a practical example. The protocol leads the reader through a series of steps: 1) staining of the musculoskeletal components, 2) imaging the musculoskeletal components, 3) building a 3 dimensional (3D) surface, 4) generating a mesh of Finite Elements, 5) solving the FEA and finally 6) validating the results by comparison to real displacements seen in movements of the fish jaw.

Immunocolorazione per il muscolo (Figura 1A) e della cartilagine (Figura 1B) o imaging reporter transgenici (Figura 1C) consente alla struttura 3D della mandibola da visualizzare, insieme alla muscolatura associata. Con immagini ad alta risoluzione è stato possibile costruire un modello che cattura sia la forma tridimensionale della mandibola (Figura 2) e la posizione e la disposizione dei carichi (figura 3). Utilizzando in spostamenti vivo visto attraverso la cattura di video ad alta velocità (Figura 4) abbiamo verificato che la gamma di movimento nel modello era all&#39;interno di una gamma realistica. I modelli FE volta corsa può essere utilizzato per visualizzare una serie di dati, come ad esempio lo stress (Figura 5A), minima e massima deformazione principale (Figura 5B - K). Questi risultati sono tre-dim<html> ensional in modo che il modello può essere ingrandita a vedere i modelli sottili di dettaglio (Figura 5E, 5I) ruotato per ottenere i pareri (Figura 5F, 5G, 5J, 5K) e in digitale sezionati (Figura 5E &#39;, 5E&#39; &#39;, 5I&#39;, 5I &#39;&#39;) per mostrare come i modelli di stress, tensione o variazione di pressione in tutto il modello. È anche possibile estrarre dati quantitativi dal modello (non mostrato). Verificando il modello e utilizzando le più accurate proprietà del materiale, carichi e mesh forma il modello FE può essere utilizzato per esplorare la migliore stima dell &#39;ambiente meccanico viene sperimentato da cellule durante quella finestra di sviluppo. I risultati del modello sono direttamente confrontabili ai cambiamenti nel comportamento cellulare e l&#39;espressione genica 20. <html> re 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 54811 / 54811fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1:. Immagini rappresentative degli elementi muscolo-scheletrici del pesce zebra mascella inferiore a 5 dpf pile confocale rappresentativi della mandibola di larve 5dpf tutto mostrato con anteriore in alto (A) immunocolorazione per A4.1025 che colora tutta la miosina scheletrica (B) immunocolorazione per il collagene di tipo II che segna tutta la cartilagine (C) Pila da una larva dal vivo che esprime i giornalisti transgenici COL2A1: mCherry marcatura cartilagine (rosso) e smyhc: GFP lento muscolare (verde). IA: intermandibularis anteriore, PH: goniometro hyoideus, AM: adduttore mandibulae, HI: hyoideus inferiore, HI: hyoideus superiore, CH: sternohyoideus, MC: la cartilagine di Meckel, PQ: Palatoquadrate, CH:. Ceratohyal <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> &quot;Fo: together.within-page keep-=&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig2.jpg" /> Figura 2: generazione di una superficie 3D da dati confocali immagini che mostrano la transizione dai dati confocali in una superficie 3D per la zebrafish mascella inferiore con elevato ingrandimento della regione di giunzione.. (A) i dati confocale prime; (B) Dataset dopo l&#39;applicazione di un filtro gaussiano; (C) contorno filtrata; Di superficie (D) 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig3.jpg" /> Figura 3: maglie rappresentativi mostrano vincoli e vettori di forza maglie rappresentativi per una larva 5 dpf per (A) di chiusura della bocca e.(B) apertura della bocca. Punti bianchi indicano luoghi in cui il modello è vincolata ed in cui le dimensioni (ad esempio, x ed y oppure x, y, z). Linee bianche indicano posizioni muscolari, con il vettore della forza muscolare indicato con frecce bianche. Rosso mostra la cartilagine e giallo il Interzone. Questa cifra è stata modificata dal materiale supplementare precedentemente pubblicato in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig4.jpg" /> Figura 4:. Test di sensibilità FE-modello che simula lo spostamento della mascella in zebrafish 5dpf per diversi cartilagine e interzone moduli di Young. Mascella spostamento (aperto a chiuso in micron) è segnato sulla mascella; registrati utilizzando il tasto di colore. Ogni modello (A - L) presenta una diversa combinazione di cartilagine (c = 1,1, 3,1 o 6,1 MPa) o interzone (i = 0,25, 0,5, 0,75, o 1 proprietà MPa). Orizzontale freccia nera mette in evidenza il valore dello spostamento della mascella sulla punta della cartilagine del Meckel (rappresentato dalla freccia nera verticale). M e N alambicchi dal video di 5 DPF minimo che mostra le larve, vale a dire, la mascella chiusa (M) e il massimo, vale a dire, mascella completamente aperto (N) con i due sovrapposti (O) - linea bianca sul O rappresenta lo spostamento (43 micron). In questo caso relativa proprietà della cartilagine di 1.1 con un Interzone di 0,25 (A) migliore corrispondenza gli spostamenti visti in pesci vivi (O). I pannelli AL di questa figura sono stati precedentemente pubblicati in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare un vers più grandi</a>ione di questa figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54811/54811fig5.jpg" /> Figura 5: i dati rappresentativi dei modelli FE simulazione FE-modello di tutti i muscoli applicate in 5 dpf larva (A - C).. (A) di Von Mises (EMaxmin) (B) ceppo minimo principale (E min. P, μɛ) (C) ceppo massima principale (E Max. P., μɛ). simulazione FE-modello di ceppi massimi e minimi principali durante l&#39;apertura della mascella. (D - K): ceppo massima principale (. E Max P., μɛ) a (D) vista mascella ventrale e (E) ventrale vista comune (E) indica la posizione delle sezioni prossimale-distale attraverso la cartilagine del Meckel congiunta e il Interzone in (e &#39;) e (e&#39; &#39;), rispettivamente. (F): lateralemascella vista. (G): vista laterale congiunta. (H - K): ceppo minimo principale (. E Min P, μɛ) a (H) vista ventrale mascella e (I) ventrale vista comune. (I) indica la posizione delle sezioni prossimale-distale attraverso congiunta cartilagine di Meckel e Interzone a (I &#39;) e (I&#39; &#39;), rispettivamente (J): vista laterale della mascella. (K): vista laterale congiunta. Questo dato è stato pubblicato in precedenza in Brunt et al. 15. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54811/54811fig5large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Numero di fibre muscolari </td><td> Area di fibra muscolare (micron 2) </td><td> zona gruppo muscolare (micron2) </td><td> Forza (N) </td></tr><tr><td> 5 dpf intermandibularis anteriore </td><td> 5 </td><td> 23.8 </td><td> 119 </td><td> 4.76e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf goniometro hyoideus </td><td> 6 </td><td> 23.8 </td><td> 142.8 </td><td> 5.71e-6 </td></tr><tr><td> 5 dpf adduttore mandibulae </td><td> 9 </td><td> 23.8 </td><td> 214.2 </td><td> 8.57e-6 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Muscle quantificazione. Calcolato forze muscolari medi del Intermandibularis anteriore, adduttore Mandibulae e goniometro Hyoideus a 5 dpf utilizzando 40 nN / micron 2 (valore per unità di superficie preso da riferimento 17). (Iorga et al., 2011) (n = 3).

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Costruire modelli a elementi finiti per studiare la biomeccanica della mascella del pesce zebra | Biologia dello sviluppo | Video

Building Finite Element Models to Investigate Zebrafish Jaw Biomechanics

Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw.

Costruire modelli ad elementi finiti per Indagare Zebrafish Jaw Biomeccanica

Skeletal morphogenesis occurs through tightly regulated cell behaviors during development; many cell types alter their behavior in response to mechanical ...

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9.1K Views.  University of Bristol. Finite Element Analysis is a frequently used tool to investigate the mechanical performance of structures under load. Here we apply its use to modeling the biomechanics of the zebrafish jaw. 

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Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the large size of their cells in early embryos, make Xenopus laevis a useful model for visualising GFP-tagged ligands. Synthetic mRNAs are efficiently translated after injection into early stage Xenopus embryos, and injections can be targeted to a single cell. When combined with a lineage tracer such as membrane tethered RFP, the injected cell (and its descendants) that are producing the overexpressed protein can easily be followed. This protocol describes a method for the production of fluorescently tagged Wnt and Shh ligands from injected mRNA. The methods involve the micro dissection of ectodermal explants (animal caps) and the analysis of ligand diffusion in multiple samples. By using confocal imaging, information about ligand secretion and diffusion over a field of cells can be obtained. Statistical analyses of confocal images provide quantitative data on the shape of ligand gradients. These methods may be useful to researchers who want to test the effects of factors that may regulate the shape of morphogen gradients.

Using Confocal Analysis of Xenopus laevis to Investigate Modulators of Wnt and Shh Morphogen Gradients

The manuscript here provides a simple set of methods for analysing the secretion and diffusion of fluorescently tagged ligands in Xenopus. This provides a context for testing the ability of other proteins to modify ligand distribution and allowing experiments that may give insight into mechanisms regulating morphogen gradients.

Utilizzando Analisi confocale di<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Per Indagare modulatori di Wnt e Shh morphogen gradienti

This protocol describes a method to visualise ligands distributed across a field of cells. The ease of expressing exogenous proteins, together with the ...

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Loss- and Gain-of-function Approach to Investigate Early Cell Fate Determinants in Preimplantation Mouse Embryos

Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene modification in preimplantation embryos provides a means to study the underlying mechanisms of genes implicated in, for instance, cellular differentiation into the trophectoderm (TE) and the inner cell mass (ICM). Here, we describe a protocol that examines the role of neogenin as an authentic receptor for initial cell fate determination in preimplantation mouse embryos. First, we discuss the experimental manipulations that were used to produce gain and loss of neogenin function by microinjecting neogenin cDNA and shRNA; the effectiveness of this approach was confirmed by a strong correlation between the pair-wise expression levels of either red fluorescent protein (RFP) or green fluorescent protein (GFP) and the immunocytochemical quantification of neogenin expression. Secondly, overexpression of neogenin in preimplantation mouse embryos leads to normal ICM development while neogenin knockdown causes the ICM to develop abnormally, implying that neogenin could be a receptor that relays extracellular cues to drive blastomeres to early cell fates. Given the success of this detailed protocol in investigating the function of a novel embryonic developmental stage-specific receptor, we propose that it has the potential to aid in exploration and identification of other stage-specific genes during embryogenesis.

The goal of this protocol is to describe a loss- and gain-of function method that is applicable to identify neogenin as a stage-specific receptor that leads to trophectoderm and inner cell mass differentiation in preimplantation mouse embryos.

Loss e approccio guadagno-di-funzione per indagare cellulare precoce Fate Determinanti in preimpianto embrioni di topo

 Gene silencing and overexpression techniques are instrumental for the identification of genes involved in embryonic development. Direct target gene ...

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema and diminished visual acuity. However, human CECs are prone to compromised proliferative potential. Furthermore, stimulation of cell growth is often complicated by gradual endothelial-mesenchymal transition (EnMT). Therefore, understanding the mechanism of EnMT is necessary for facilitating the regeneration of CECs with competent function. In this study, we prepared a primary culture of bovine CECs by peeling the CECs with Descemet's membrane from the corneal button and demonstrated that bovine CECs exhibited the EnMT process, including phenotypic change, nuclear translocation of &#946;-catenin, and EMT regulators snail and slug, in the in vitro culture. Furthermore, we used a rat corneal endothelium cryoinjury model to demonstrate the EnMT process in vivo. Collectively, the in vitro primary culture of bovine CECs and in vivo rat corneal endothelium cryoinjury models offers useful platforms for investigating the mechanism of EnMT.

In Vitro and In Vivo Models to Study Corneal Endothelial-mesenchymal Transition

A primary culture of bovine corneal endothelial cells was used to investigate the mechanism of corneal endothelial-mesenchymal transition. Furthermore, a rat corneal endothelium cryoinjury model was used to demonstrate corneal endothelial-mesenchymal transition in vivo.

In vitro e in modelli in vivo per studiare transizione corneale endoteliale-mesenchimale

Corneal endothelial cells (CECs) play a crucial role in maintaining corneal clarity through active pumping. A reduced CEC count may lead to corneal edema ...

Analysis of Coronary Vessels in Cleared Embryonic Hearts

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard microscopy techniques, due to the scattering of imaging light by the thick heart tissue, as these vessels are localized deep within the walls of the developing heart. As optical clearing of tissues using organic solvents such as BABB (1 part benzyl alcohol to 2 parts benzyl benzoate) has been shown to greatly improve the optical penetration depth that can be achieved, we combined clearance of whole, PECAM1-immunostained hearts, with laser-scanning confocal microscopy, in order to obtain high-resolution images of vessels throughout the entire heart. BABB clearance of embryonic hearts takes place rapidly and also acts to preserve the fluorescent signal for several weeks; in addition, samples can be imaged multiple times without loss of signal. This straightforward method is also applicable to imaging other types of blood vessels in whole embryos.

We present a protocol for the analysis of coronary vessels in whole embryonic murine hearts up to E15.5, using standard immunological staining methods followed by optical clearance and confocal microscopy. This technique enables visualization of blood vessels throughout the entire heart without the need for time-consuming analysis of serial sections.

Analisi dei vasi coronarici in sgomberati cuori embrionali

Whole mount visualization of the embryonic coronary plexus from which the capillary and arterial networks will form is rendered problematic using standard ...

Acute and Chronic Models of Hyperglycemia in Zebrafish: A Method to Assess the Impact of Hyperglycemia on Neurogenesis and the Biodistribution of Radiolabeled Molecules

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological problems after stroke and is shown to impair neurogenic processes. Interestingly, the adult zebrafish has recently emerged as a relevant and useful model to mimic hyperglycemia/diabetes and to investigate constitutive and regenerative neurogenesis. This work provides methods to develop zebrafish models of hyperglycemia to explore the impact of hyperglycemia on brain cell proliferation under homeostatic and brain repair conditions. Acute hyperglycemia is established using the intraperitoneal injection of D-glucose (2.5 g/kg bodyweight) into adult zebrafish. Chronic hyperglycemia is induced by immersing adult zebrafish in D-glucose (111 mM) containing water for 14 days. Blood-glucose-level measurements are described for these different approaches. Methods to investigate the impact of hyperglycemia on constitutive and regenerative neurogenesis, by describing the mechanical injury of the telencephalon, dissecting the brain, paraffin embedding and sectioning with a microtome, and performing immunohistochemistry procedures, are demonstrated. Finally, the method of using zebrafish as a relevant model for studying the biodistribution of radiolabeled molecules (here,[18F]-FDG) using PET/CT is also described.

This work describes methods to establish acute and chronic hyperglycemia models in zebrafish. The aim is to investigate the impact of hyperglycemia on physiological processes, such as constitutive and injury-induced neurogenesis. The work also highlights the use of zebrafish to follow radiolabeled molecules (here, [18F]-FDG) using PET/CT.

Modelli acuti e cronici di iperglicemia in Zebrafish: un metodo per valutare l&#39;impatto dell&#39;iperglicemia sulla neurogenesi e la biodistribuzione delle molecole radiomarcate

Hyperglycemia is a major health issue that leads to cardiovascular and cerebral dysfunction. For instance, it is associated with increased neurological ...

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding and invasion. Current animal models for the study of T. cruzi allow limited observation of parasites in vivo, representing a challenge for understanding parasite behavior during the initial stages of infection in humans. This protozoan has a flagellar stage in both vector and mammalian hosts, but there are no studies describing its motility in vivo.The objective of this project was to establish a live vertebrate zebrafish model to evaluate T. cruzi motility in the vascular system. Transparent zebrafish larvae were injected with fluorescently labeled trypomastigotes and observed using light sheet fluorescence microscopy (LSFM), a noninvasive method to visualize live organisms with high optical resolution. The parasites could be visualized for extended periods of time due to this technique&#39;s relatively low risk of photodamage compared to confocal or epifluorescence microscopy. T. cruzi parasites were observed traveling in the circulatory system of live zebrafish in different-sized blood vessels and the yolk. They could also be seen attached to the yolk sac wall and to the atrioventricular valve despite the strong forces associated with heart contractions. LSFM of T. cruzi-inoculated zebrafish larvae is a valuable method that can be used to visualize circulating parasites and evaluate their tropism, migration patterns, and motility in the dynamic environment of the cardiovascular system of a live animal.

Establishment of Larval Zebrafish as an Animal Model to Investigate Trypanosoma cruzi Motility In Vivo

In this protocol, fluorescently labeled T. cruzi&#160;were injected into transparent zebrafish larvae, and parasite motility was observed in vivo using light sheet fluorescence microscopy.

Stabilimento di larvale Zebrafish come modello animale per indagare Trypanosoma cruzi motilità In Vivo

Chagas disease is a parasitic infection caused by Trypanosoma cruzi, whose motility is not only important for localization, but also for cellular binding ...

Adult Zebrafish Injury Models to Study the Effects of Prednisolone in Regenerating Bone Tissue

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows within roughly two weeks after injury. Furthermore, zebrafish are able to heal bone rapidly after trepanation of the skull, and repair fractures that can be easily introduced into zebrafish bony fin rays. These injury assays represent feasible experimental paradigms to test the effect of administered drugs on rapidly forming bone. Here, we describe the use of these 3 injury models and their combined use with systemic glucocorticoid treatment, which exerts bone inhibitory and immunosuppressive effects. We provide a workflow on how to prepare for immunosuppressive treatment in adult zebrafish, illustrate how to perform fin amputation, trepanation of calvarial bones, and fin fractures, and describe how the use of glucocorticoids affects both bone forming osteoblasts and cells of the monocyte/macrophage lineage as part of innate immunity in bone tissue.

Here, we describe 3 adult zebrafish injury models and their combined use with immunosuppressive drug treatment. We provide guidance on imaging of regenerating tissues and on detecting bone mineralization therein.

Modelli di lesione di Zebrafish adulto per studiare gli effetti del Prednisolone nella rigenerazione di tessuto osseo

Zebrafish are able to regenerate various organs, including appendages (fins) after amputation. This involves the regeneration of bone, which regrows ...

Adult Mouse Digit Amputation and Regeneration: A Simple Model to Investigate Mammalian Blastema Formation and Intramembranous Ossification

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic regeneration, which involves blastema formation and intramembranous ossification analyzed by fluorescence immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography (&#956;CT). Mammalian regeneration is restricted to amputations transecting the distal region of the terminal phalanx (P3); digits amputated at more proximal levels fail to regenerate and undergo fibrotic healing and scar formation. The regeneration response is mediated by the formation of a proliferative blastema, followed by bone regeneration via intramembranous ossification to restore the amputated skeletal length. P3 amputation is a preclinical model to investigate epimorphic regeneration in mammals, and is a powerful tool for the design of therapeutic strategies to replace fibrotic healing with a successful regenerative response. Our protocol uses fluorescence immunohistochemistry to 1) identify early-and-late blastema cell populations, 2) study revascularization in the context of regeneration, and 3) investigate intramembranous ossification without the need for complex bone stabilization devices. We also demonstrate the use of sequential in vivo &#956;CT to create high resolution images to examine morphological changes after amputation, as well as quantify volume and length changes in the same digit over the course of regeneration. We believe this protocol offers tremendous utility to investigate both epimorphic and tissue regenerative responses in mammals.

Here, we present a protocol of adult mouse terminal phalanx amputation to investigate mammalian blastema formation and intramembranous ossification, analyzed by fluorescent immunohistochemistry and sequential in-vivo microcomputed tomography.

Amputazione e rigenerazione delle cifre del mouse adulto: un modello semplice per indagare sulla formazione del Blastema mammario e sull'ossificazione intramembranosa

Here, we present a protocol of adult mouse distal terminal phalanx (P3) amputation, a procedurally simple and reproducible mammalian model of epimorphic ...

Whole-Mount In Situ Hybridization in Zebrafish Embryos and Tube Formation Assay in iPSC-ECs to Study the Role of Endoglin in Vascular Development

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in zebrafish during different developmental stages. To investigate the role of endoglin(eng) in vessel formation during the development of hereditary hemorrhagic telangiectasia&#160;(HHT), morpholino-mediated targeted knockdown of eng in zebrafish are used to study its temporal expression and associated functions. Here, whole-mount in situ RNA hybridization (WISH) is employed for the analysis of eng and its downstream genes in zebrafish embryos. Also, tube formation assays are performed in HHT patient-derived induced pluripotent stem cell-differentiated&#160;endothelial cells (iPSC-ECs; with eng mutations). A specific signal amplifying system using the whole amount In Situ Hybridization &#8211; WISH provides higher resolution and lower background results compared to traditional methods. To obtain a better signal, the post-fixation time is adjusted to 30 min after probe hybridization. Because fluorescence staining is not sensitive in zebrafish embryos, it is replaced with diaminobezidine (DAB) staining here. In this protocol, HHT&#160;patient-derived iPSC lines containing an eng mutation are differentiated into endothelial cells. After coating a plate with basement membrane matrix for 30 min at 37 &#176;C, iPSC-ECs are seeded as a monolayer into wells and kept at 37 &#176;C for 3 h. Then, the tube length and number of branches are calculated using microscopic images. Thus, with this improved WISH protocol, it is shown that reduced eng expression affects endothelial progenitor formation in zebrafish embryos. This is further confirmed by tube formation assays using iPSC-ECs derived from a patient with HHT. These assays confirm the role for eng in early vascular development.

Presented here is a protocol for whole-mount in situ RNA hybridization analysis in zebrafish and tube formation assay in patient-derived induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells to study the role of endoglin in vascular formation.

Ibridazione dell'intero Monte In Situ negli embrioni di pesce zebra e nella formazione dei tubi, analisi dei prodotti iPSC-EC per studiare il ruolo dell'endoglin nello sviluppo vascolare

Vascular development is determined by the sequential expression of specific genes, which can be studied by performing in situ hybridization assays in ...

Translating Ribosome Affinity Purification (TRAP) to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome affinity purification (TRAP) method and consecutive optimized low-input library preparation.
As starting material, we employ plant lines that express GFP-tagged ribosomal protein RPL18 in a cell type-specific manner by use of adequate promoters. Prior to immunopurification and RNA extraction, the tissue is snap frozen, which preserves tissue integrity and simultaneously allows execution of time series studies with high temporal resolution. Notably, cell wall structures remain intact, which is a major drawback in alternative procedures such as fluorescence-activated cell sorting-based approaches that rely on tissue protoplasting to isolate distinct cell populations. Additionally, no tissue fixation is necessary as in laser capture microdissection-based techniques, which allows high-quality RNA to be obtained.
However, sampling from subpopulations of cells and only isolating polysome-associated RNA severely limits RNA yields. It is, therefore, necessary to apply sufficiently sensitive library preparation methods for successful data acquisition by RNA-seq.
TRAP offers an ideal tool for plant research as many developmental processes involve cell wall-related and mechanical signaling pathways. The use of promoters to target specific cell populations is bridging the gap between organ and single-cell level that in turn suffer from little resolution or very high costs. Here, we apply TRAP to study cell-cell communication in lateral root formation.

Translating Ribosome Affinity Purification TRAP to Investigate Arabidopsis thaliana Root Development at a Cell Type-Specific Scale

Translating ribosome affinity purification (TRAP) offers the possibility to dissect developmental programs with minimal processing of organs and tissues. The protocol yields high-quality RNA from cells targeted with a green fluorescent protein (GFP)-labeled ribosomal subunit. Downstream analysis tools, such as qRT-PCR or RNA-seq, reveal tissue and cell type-specific expression profiles.

Tradurre la purificazione dell'affinità del ribosoma (TRAP) per studiare lo sviluppo della radice di Arabidopsis thaliana su una scala specifica del tipo di cella

In this article, we give hands-on instructions to obtain translatome data from different Arabidopsis thaliana root cell types via the translating ribosome ...

Costruire modelli ad elementi finiti per Indagare Zebrafish Jaw Biomeccanica

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