We thank Dr. Christian Rickert for critical reading of the manuscript. This work was supported by a grant from the National Heart Lung and Blood Institute (R01-HL088427) to CP. EJS was supported by 5T32-AG000279 from the National Institute on Aging. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.

Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal Comitato Cura e uso istituzionale degli animali della University of Colorado Anschutz Medical Campus. Il protocollo standard di seguito è stato ottimizzato utilizzando maschio C57BL / 6J topi di 2-3 mesi di età. 1. Preparare Azioni e accessori per la soluzione in anticipo di esperimenti NOTA: vedi Materiali Tavolo per attrezzature e forniture necessarie. <ol><li> Preparare 1 L ciascuna delle seguenti soluzioni come indicato nella Tabella 1:, basso Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di, Modified Kraft-Brühe (KB) Soluzione e Bovine Serum Albumin (BSA) soluzione completa di Tyrode. Usa ultrapura filtrata acqua deionizzata per tutte le soluzioni. Dividere ogni soluzione in 50 ml aliquote e conservare a 20 ° C per un massimo di sei mesi. Scongelare singole aliquote immediatamente prima degli esperimenti, e conservare per un massimo di una settimana a 46; C. </li><li> Preparare 50 ml di 10 mM NaCl e 1,8 mM CaCl 2 Adattamento soluzione sciogliendo NaCl e CaCl 2 in ultrapura filtrata acqua deionizzata (Tabella 1). Conservare a temperatura ambiente per un massimo di sei mesi. </li><li> Preparare 4,75 unità di attività enzimatica (U) aliquote di elastasi pipettando in tubi microcentrifuga. Conservare a 4 ° C per un massimo di tre mesi. </li><li> Preparare 375 mg aliquote (in ultrapura H 2 O) di collagenasi-proteasi miscela enzimatica pipettando in tubi microcentrifuga. Conservare a -20 ° C per un massimo di tre mesi. </li><li> Preparare due pipette ribruciate Pasteur, uno per il trasferimento di tessuto (~ finale diametro di apertura 1,5 millimetri; Figura 1Aiv e Figura 1C) e uno per la dissociazione (~ 2 mm di diametro; Figura 1Aiii e Figura 1C). <ol><li> Punteggio pipette Pasteur con un cutter vetro e scatto lungo il punteggio di produrre un&#39;apertura leggermente più grande della dimensione desiderata. Fuoco-Polacco la fine del taglio di ogni pipetta per ~ 30-60 sec a fuoco lento su un becco Bunsen per la produzione di una parete spessa e lucida un&#39;apertura del diametro desiderato. Garantire l&#39;apertura del fuoco lucidato è privo di eventuali crepe o asperità. </li></ol></li><li> Preparare due piatti di dissezione con l&#39;aggiunta di ~ 25 ml elastomero di silicone miscelato secondo le istruzioni del produttore per ogni 100 millimetri piastra di Petri (Figura 1AI e Figura 1B). Lasciare polimerizzare a temperatura ambiente per 48 ore. </li><li> Solo per la cultura: preparare 25-50 ml ogni placcatura Medium e terreno di coltura come da Tabella 2 Store per un massimo di due settimane a 4 ° C.. </li></ol> 2. Preparare le soluzioni da utilizzare il giorno di isolamento delle cellule NOTA: Le seguenti importi per l&#39;isolamento dei miociti seno-atriale da un mouse. <ol><li> Aggiungere 2,5 ml di bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode (pH 6.9) a ciascuno dei tre piccoli, tubo a fondo tondo culturaS. Porre le provette a bagnomaria 35 ± 1 ° C. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di bassa Ca 2+ / a una grande provetta a fondo tondo di Mg 2+ Tyrode. Per questo tubo, aggiungere 1 aliquota (4,75 U) elastasi ed una aliquota (375 mcg) collagenasi-proteasi enzima miscela. Agitare per mescolare. Collocare il tubo nel 35 ± 1 ° C bagnomaria. </li><li> Aggiungere 2,5 ml di KB da medio a tre piccoli, tubi di coltura a fondo tondo aggiuntivi e una grande, provetta a fondo tondo aggiuntivo. Porre le provette a bagnomaria 35 ± 1 ° C. </li><li> Aggiungere ~ 7 ml di soluzione BSA di un grande tubo cultura Bottomed. Mantenere questo tubo a temperatura ambiente. </li><li> Posizionare 20-40 ml di soluzione completa di Tyrode in un bicchiere da 50 ml (Figura 1Aii). Aggiungere 10 USP / ml di eparina, turbine a mescolare, e posizionare il bicchiere in bagno d&#39;acqua ° C 35 ± 1. </li></ol> 3. Preparare Altre soluzioni e materiali per colture cellulari (saltare questi passaggi per cellule acutamente isolato) <ol><li>In una cappa coltura di tessuti sterili, posizionare due 12 millimetri vetrini rotondi per il mouse in singoli pozzetti di una piastra da 24 pozzetti. NOTA: La piastra 24 e viene utilizzato perché i pozzi sono una dimensione conveniente, che serve a limitare il volume di infezioni virali successive. </li><li> Dispensare circa 200 ml di 100 ng / ml soluzione di laminina del mouse diluita in fosfato sterile salina tamponata (PBS) su ogni vetrino. </li><li> Incubare coprioggetto con laminina per la durata dell&#39;isolamento (almeno 1 ora) in un incubatore a 37 ° C. </li><li> Pre-caldo la placcatura Medium e terreno di coltura (dal punto 1.7 e tabella 3) a 37 ° C. </li></ol> Isolamento 4. senoatriale Nodo <ol><li> In una cappa, posizionare il mouse in una camera di una scatola a due camere e anestetizzare con ~ 200 ml isoflurano liquido introdotto tramite un bastoncino di cotone nell&#39;altra camera. Confermare anestesia (di solito entro 30-60 ~ sec) con un pizzico punta. euthanizemouse dislocazione cervicale. NOTA: 1 ml di dialogo punta della pipetta vuoto può essere usato per formare la scatola a due camere; girare la cremagliera a testa in giù nella casella per creare il vano separato per l&#39;isoflurano per evitare che il mouse di contattare direttamente. </li><li> Rimuovere pelliccia dal petto con le forbici e transetto gabbia toracica per esporre la cavità toracica con pinze esterni dei tessuti (Figura 1Aviii) e forbici dissezione (Figura 1Avix). Bagnare la cavità toracica con ~ 2 ml riscaldati Completa Tyrode di con eparina con una pipetta di trasferimento. NOTA: Continua cavità toracica da bagno quando è necessario, non consentono la preparazione di asciugarsi. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere con attenzione i polmoni e timo con le forbici interne (Figura 1Avi) e pinze dissezione (Figura 1Avii). </li><li> Tenendo delicatamente l&#39;apice del cuore con le pinze dissezione interni, accuratamente tagliato la vena cava inferiore e l&#39;aorta con le forbici interne per rimuovere il cuore dalla cavità toracica. Trasferire il cuore di uno dei piatti dissezione silicone e fare il bagno con ~ 4 ml riscaldato eparinizzato Completa Tyrode di usare la pipetta di trasferimento. </li><li> Orientare il cuore in modo tale che i vasi posteriori sono visibili e rivolta verso l&#39;alto, con atrio destro dell&#39;animale sulla destra dello sperimentatore e atrio sinistro sulla sinistra dello sperimentatore. Una volta orientato, immobilizzare il cuore appuntando attraverso l&#39;apice nel piatto dissezione silicone. </li><li> Individuare il solco tra i ventricoli e gli atri (chiaro anello di sopra del ventricoli). </li><li> Utilizzando le forbici dissezione interna, fare un&#39;incisione in corrispondenza della scanalatura, mantenendo più vicino ai ventricoli rispetto atri. Lavare la scanalatura e incisione con ulteriore riscaldato Tyrode Completa eparinizzato di quanto necessario per consentire una visione chiara degli atri e le valvole. Continuare a tagliare lungo la scanalatura per separare gli atri dai ventricoli. </li><li>Trasferire il tessuto atriale per il secondo piatto dissezione silicone e fare il bagno con ~ 3 ml riscaldato eparinizzato Completa Tyrode di. </li><li> Orient il tessuto in modo che nell&#39;atrio destro dell&#39;animale è ora sulla sinistra dello sperimentatore, e l&#39;atrio sinistro è sulla destra. NOTA: L&#39;atrio destro è più trasparente, mentre l&#39;atrio sinistro ha più di un tono di colore rosso scuro. </li><li> Pin il tessuto attraverso la vena cava inferiore e superiore e il diritto e appendici atriale sinistra, si estende la preparazione delicatamente. Rimuovere qualsiasi tessuto grasso o altro residuo per consentire una visione chiara della preparazione (attenzione a non tagliare nella parete atriale, come il nodo seno-atriale è molto delicata e può essere facilmente danneggiato). </li><li> Aprire la parete anteriore degli atri tagliando attraverso la vena cava. Riposizionare i perni come necessario per visualizzare il setto interatriale. </li><li> Tagliare lungo il setto interatriale per rimuovere l&#39;atrio sinistro. Re-pin della preparazione, che si estende dolcemente. </li><li> rimuovere tHa ragione atriale appendice e liberare il nodo seno-atriale tagliando lungo la terminalis creste, che appare come una striscia di colore arancione scuro al confine con l&#39;appendice atriale. </li><li> Re-pin del tessuto nodale e tagliare lateralmente (perpendicolare al terminalis crista) per la produzione di tre strisce di uguali dimensioni. </li></ol> 5. senoatriale Nodo Digestione <ol><li> Utilizzando la stretta incendio lucidato pipetta (Figura 1Aiv), trasferire i tre strisce di tessuto nodo seno-atriale nel primo dei tre piccoli, tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml di bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode del nel 35 ± 1 ° bagnomaria C. Incubare per 5 min. </li><li> Strisce di tessuto trasferimento al secondo piccolo, tubo fondo rotondo contenente 2,5 ml bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di in ° C bagnomaria 35 ± 1, utilizzando la stessa pipetta stretta. Lavare le strisce di tessuto delicatamente roteare il tubo o pipettando delicatamente con la pipetta stretto. Non invert tubo. </li><li> Strisce di tessuto trasferimento al terzo piccolo, tubo fondo rotondo contenente 2,5 ml bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode di, e ripetere la fase di lavaggio descritto al punto 5.2. </li><li> Strisce trasferimento nella grande tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml di bassa Ca 2+ / Mg 2+ Tyrode con enzimi (elastasi più miscela collagenasi-proteasi) nel bagno d&#39;acqua a 35 ° C. Assicurarsi che tutte le tre strisce di tessuto sono presenti. Incubare per 10-15 minuti a 35 ± 1 ° C. Mescolare ogni 5 minuti agitando delicatamente il tubo. Non invertire il tubo. </li></ol> 6. senoatriale Nodo miociti Dissociazione <ol><li> Dopo la digestione enzimatica, utilizzare la stretta pipetta incendio lucidato per trasferire delicatamente le strisce di tessuto al primo, il tubo a fondo tondo piccolo contenente 2,5 ml di soluzione KB a 35 ± 1 ° C. Lavare il tessuto agitando delicatamente il tubo. Nota: le strisce di tessuto saranno apparire un po &#39;trasparente e possono raggrupparsi a Thè il punto. Maneggiare molto delicatamente dopo la digestione enzimatica per evitare di perdere le cellule. </li><li> Trasferire il tessuto al secondo piccolo tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitare delicatamente per lavare. </li><li> Trasferire il tessuto al terzo piccolo tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. Agitare delicatamente per lavare. </li><li> Trasferire il tessuto alla grande, tubo a fondo rotondo contenente 2,5 ml KB a 35 ± 1 ° C. </li><li> Utilizzando la grande pipetta incendio lucidato (Figura 1Aiii e Figura 1C), dissociare le cellule nel grande tubo a fondo tondo da costante triturazione a circa 0,5-1 Hz per 5-10 minuti, avendo cura di mantenere il tubo di dissociazione sommerso nel 35 ± 1 ° C bagnomaria e per evitare di introdurre bolle nella soluzione. Nota: tempo di triturazione varia con diametro della pipetta di dissociazione e la forza di pipettaggio. Il tempo dovrebbe essere regolata in modo che i pezzi di tessuto rimanendo a tegli fine della dissociazione appare sottile, trasparente e ciuffi. Se il tessuto mantiene qualsiasi colore, la dissociazione è probabilmente incompleta. Frequenza (0,5-1 Hz) è determinato a mano. </li><li> Rimuovere il tubo a fondo rotondo contenente dissociata SAM dal bagnomaria ed equilibrare a temperatura ambiente per 5 min. </li></ol> 7. senoatriale Nodo calcio riadattamento (Eseguita a temperatura ambiente) NOTA: Per SAM destinato per esperimenti di coltura, le procedure descritte nella sezione seguente devono essere eseguite in una cappa sterile coltura di tessuti. Se SAM devono essere usati per esperimenti acuti, non vi è alcuna necessità di eseguire queste operazioni in un ambiente sterile. <ol><li> Aggiungere 75 ml di NaCl / CaCl 2 soluzione adattamento (Tabella 2). Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 5 min. </li><li> Aggiungere 160 ml di NaCl / CaCl soluzione 2 di adattamento. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 5 min. </li><li> Aggiungere 390 ml di BSA solution (Tabella 2). Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min. </li><li> Aggiungere 1,25 ml di soluzione di BSA. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min. </li><li> Aggiungere 4,37 ml di soluzione di BSA. Agitare delicatamente per mescolare e incubare per 4 min. Nota: La concentrazione finale di calcio sarà 1,8 mM. </li><li> A seguito di calcio riadattamento, raccogliere SAM consentendo di risolvere per gravità per ~ 10 minuti o per centrifugazione a ~ 2.000 xg per 3 min. <ol><li> Per le cellule acutamente isolate, rimuovere delicatamente e scartare circa 5 ml del surnatante con una pipetta Pasteur di vetro, lasciando le cellule in un volume di 2 ml ~. Conservare queste cellule a temperatura ambiente per un massimo di ~ 8 ore per le registrazioni di patch clamp. </li><li> Per le cellule in coltura, rimuovere la maggior quantità di surnatante possibile utilizzando una pipetta di vetro sterile Pasteur. Pellet Risospendere cellule in 1 ml di pre-riscaldato (37 ° C) Placcatura Medium (Tabella 2). </li></ol></li></ol> 8. placcatura e la cultura di senoatriale Myociti (Skip per cellule acutamente isolato) <ol><li> Rimuovere la soluzione laminina da lamelle dal punto 3.3 con una pipetta Pasteur. seminare Immediatamente 500 microlitri (~ 50-100 cellule) su ogni vetrino laminina rivestite (dal punto 3). NOTA: L&#39;inibitore contrattile 2,3-butanedione monoxime (BDM) è incluso nei media placcatura e cultura per prevenire la contrazione, che provoca logoramento delle cellule 9. </li><li> Riportare la piastra 24 pozzetti contenente SAM appena seminato al incubatore e mantenere a 37 ° C in atmosfera di 95% aria / 5% CO 2. Consentono alle cellule di aderire a lamelle per 4-6 ore nei media placcatura (Tabella 2). </li><li> Rimuovere delicatamente placcatura Media utilizzando una pipetta Pasteur sterile. Sostituire con 500 ml per pozzetto di pre-riscaldato (37 ° C) Culture Media (Tabella 2). </li></ol> 9. trasduzione adenovirale di adulti Culture senoatriali miociti (Vai a cellule acutamente isolato) <ol><li> Stimare il numero di cells per coprioggetto immediatamente prima dell&#39;applicazione adenovirus contando le cellule in un campo visivo al microscopio, regolando per l&#39;ingrandimento. Contare tutte le cellule, non solo SAM. </li><li> Diluire adenovirus in Medium 199 e regolare la diluizione per il titolo virale in modo che l&#39;applicazione di 1-10 microlitri è necessaria per ottenere una molteplicità finale di infezione (MOI) di 100 unità virali per cellula. Aggiungere la soluzione adenovirale in modo gocce direttamente sulla placcato SAM. </li><li> Incubare le cellule con il pernottamento medio virus contenente (~ 12-14 ore). Poi scambiare con terreno di coltura fresco. Mantenere le cellule in incubatrice, cambiando la cultura media ogni 48 ore, fino ad ottenere l&#39;espressione della proteina desiderata. </li></ol> 10. La valutazione funzionale del Acutamente isolato o coltivate SAM NOTA: Il seguente protocollo è un esempio di valutazioni funzionali di SAM isolato utilizzando l&#39;amfotericina tecnica perforato-patch per registrare sia i punti di accesso spontanee e I <sub&gt; f dalla stessa cellula (vedi riferimento 9). <ol><li> Preparare soluzioni di registrazione come descritto nella tabella 3. </li><li> Preparare una soluzione stock di 20 mg / ml di amfotericina B-in DMSO fresco il giorno della registrazione. Mantenere magazzino a temperatura ambiente e al riparo dalla luce. Diluire amfotericina B-magazzino in soluzione intracellulare ad una concentrazione finale di 200 ug / ml al momento dell&#39;uso. Mantenere la soluzione pipetta finale sul ghiaccio e al riparo dalla luce. NOTA: La soluzione pipetta amfotericina contenente per esperimenti deve essere preparato fresco oraria diluendo una aliquota della soluzione madre nella soluzione intracellulare e vortex per almeno 1 min. </li><li> Trasferire una aliquota della acutamente dissociate sospensione cellulare SAM o un frammento di vetro vetrino cuscinetto colta SAM ad una camera di registrazione contenente la soluzione di Tyrode a 35 ± 1 ° C. Profumato cellule con la soluzione di Tyrode per almeno 2 minuti prima recordin elettrofisiologicags per eliminare ogni residuo di BDM rimanente dal terreno di coltura. NOTA: contrazioni spontanee dovrebbe essere evidente subito dopo il trasferimento alla soluzione del Tyrode. SAM per la registrazione può essere identificato da una combinazione di funzioni, tra cui attività contrattile spontanea, morfologia caratteristica (ad es., Figura 2), la mancanza di striature, espressione della proteina HCN4, presenza di corrente I f, capacità di membrana &lt;50 pF, e spontanei AP con forme d&#39;onda che includono una fase di depolarizzazione diastolica e una salita lenta. </li><li> Usando pipette di vetro borosilicato con resistenze di 1,5-3,0 MW, riempire la punta con la soluzione intracellulare carente amfotericina per immersione per 10-30 sec. Poi di nuovo riempire la pipetta con la soluzione di amfotericina contenente. Una guarnizione cell-attached GΩ dovrebbe essere ottenuto più rapidamente possibile. Se la formazione di tenuta è difficile, aumentare il tempo di punta-fill. NOTA: La resistenza accesso dovrebbe essere continuamentemonitorati dopo la formazione del sigillo cellule iscritti, e le registrazioni devono essere avviate solo dopo aver ottenuto una resistenza accesso stabile di &lt;10 MW. </li><li> Per registrare i punti di accesso spontanee, commutare l&#39;amplificatore in modalità di corrente-clamp veloce senza iniezione di corrente. NOTA: 1 nM isoproterenolo è incluso nella soluzione extracellulare Tyrode durante la registrazione di punti di accesso per stabilizzare il tasso di fuoco, come riportato in precedenza 10. </li></ol>

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	<li>Irisawa, H., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+currents+in+mammalian+nodal+cells.">Pacemaker currents in mammalian nodal cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 16 (9), 777-781 (1984).</li><li>DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pacemaker+mechanisms+in+cardiac+tissue.">Pacemaker mechanisms in cardiac tissue.</a> Annu Rev Physiol. 55, 455-472 (1993).</li><li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genesis+and+regulation+of+the+heart+automaticity.">Genesis and regulation of the heart automaticity.</a> Physiol Rev. 88 (3), 919-982 (2008).</li><li>Lakatta, E. G., DiFrancesco, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=What+keeps+us+ticking:+a+funny+current,+a+calcium+clock,+or+both.">What keeps us ticking: a funny current, a calcium clock, or both.</a> J Mol Cell Cardiol. 47 (2), 157-170 (2009).</li><li>Liao, Z., Lockhead, D., Larson, E., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phosphorylation+and+modulation+of+hyperpolarization-activated+HCN4+channels+by+protein+kinase+A+in+the+mouse+sinoatrial+node.">Phosphorylation and modulation of hyperpolarization-activated HCN4 channels by protein kinase A in the mouse sinoatrial node.</a> J Gen Physiol. 136 (3), 247-258 (2010).</li><li>Liao, Z., St Clair, J. R., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myristoylated+peptides+potentiate+the+funny+current+(I(f))+in+sinoatrial+myocytes.">Myristoylated peptides potentiate the funny current (I(f)) in sinoatrial myocytes.</a> Channels. 5 (2), 115-119 (2011).</li><li>Larson, E. D., Clair, J. R. S., Sumner, W. A., Bannister, R. A., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Depressed+pacemaker+activity+of+sinoatrial+node+myocytes+contributes+to+the+age-dependent+decline+in+maximum+heart+rate.">Depressed pacemaker activity of sinoatrial node myocytes contributes to the age-dependent decline in maximum heart rate.</a> Proc Nat Acad Sci. 110 (44), 18011-18016 (2013).</li><li>St. Clair, J. R., Liao, Z., Larson, E. D., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PKA-independent+activation+of+I(f)+by+cAMP+in+mouse+sinoatrial+myocytes.">PKA-independent activation of I(f) by cAMP in mouse sinoatrial myocytes.</a> Channels. 7 (4), 318-321 (2013).</li><li>St. Clair, J. R., Sharpe, E. J., Proenza, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+and+adenoviral+infection+of+sinoatrial+node+myocytes+from+adult+mice.">Culture and adenoviral infection of sinoatrial node myocytes from adult mice.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. , (2015).</li><li>Clark, R. B., Mangoni, M. E., Lueger, A., Couette, B., Nargeot, J., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+rapidly+activating+delayed+rectifier+K++current+regulates+pacemaker+activity+in+adult+mouse+sinoatrial+node+cells.">A rapidly activating delayed rectifier K+ current regulates pacemaker activity in adult mouse sinoatrial node cells.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1757-H1766 (2004).</li><li>Mangoni, M., Nargeot, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+the+hyperpolarization-activated+current+(I(f))+in+isolated+mouse+sino-atrial+cells.">Properties of the hyperpolarization-activated current (I(f)) in isolated mouse sino-atrial cells.</a> Cardiovasc Res. 52 (1), 51-64 (2001).</li><li>Cho, H. S., Takano, M., Noma, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+electrophysiological+properties+of+spontaneously+beating+pacemaker+cells+isolated+from+mouse+sinoatrial+node.">The electrophysiological properties of spontaneously beating pacemaker cells isolated from mouse sinoatrial node.</a> J Physiol. 550 (Pt 1), 169-180 (2003).</li><li>Rose, R. A., Lomax, A. E., Kondo, C. S., Anand-Srivastava, M. B., Giles, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+C-type+natriuretic+peptide+on+ionic+currents+in+mouse+sinoatrial+node:+a+role+for+the+NPR-C+receptor.">Effects of C-type natriuretic peptide on ionic currents in mouse sinoatrial node: a role for the NPR-C receptor.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (5), H1970-H1977 (2004).</li><li>Rose, R. A., Kabir, M. G., Backx, P. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Heart+Rate+and+Sinoatrial+Node+Function+in+Mice+Lacking+the+cAMP+Regulator+Phosphoinositide+3-Kinase-\gamma\.">Altered Heart Rate and Sinoatrial Node Function in Mice Lacking the cAMP Regulator Phosphoinositide 3-Kinase-\gamma\.</a> Circ Res. 101 (12), 1274-1282 (2007).</li><li>Hua, R., Adamczyk, A., Robbins, C., Ray, G., Rose, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+patterns+of+constitutive+phosphodiesterase+activity+in+mouse+sinoatrial+node+and+atrial+myocardium.">Distinct patterns of constitutive phosphodiesterase activity in mouse sinoatrial node and atrial myocardium.</a> PloS ONE. 7 (10), e47652 (2012).</li><li>Groenke, S., Larson, E. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complete+atrial-specific+knockout+of+sodium-calcium+exchange+eliminates+sinoatrial+node+pacemaker+activity.">Complete atrial-specific knockout of sodium-calcium exchange eliminates sinoatrial node pacemaker activity.</a> PloS ONE. 8 (11), e81633 (2013).</li><li>Torrente, A. G., Zhang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burst+pacemaker+activity+of+the+sinoatrial+node+in+sodium-calcium+exchanger+knockout+mice.">Burst pacemaker activity of the sinoatrial node in sodium-calcium exchanger knockout mice.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 112 (31), 9769-9774 (2015).</li><li>Denyer, J. C., Brown, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rabbit+sino-atrial+node+cells:+isolation+and+electrophysiological+properties.">Rabbit sino-atrial node cells: isolation and electrophysiological properties.</a> J Physiol. 428 (1), 405-424 (1990).</li><li>Thum, T., Borlak, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Butanedione+monoxime+increases+the+viability+and+yield+of+adult+cardiomyocytes+in+primary+cultures.">Butanedione monoxime increases the viability and yield of adult cardiomyocytes in primary cultures.</a> Cardiovasc Toxicol. 1 (1), 61-72 (2001).</li><li>Borlak, J., Zwadlo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+myosin+ATPase+inhibitor+2,3-butanedione+monoxime+dictates+transcriptional+activation+of+ion+channels+and+Ca(2+)-handling+proteins.">The myosin ATPase inhibitor 2,3-butanedione monoxime dictates transcriptional activation of ion channels and Ca(2+)-handling proteins.</a> Molec Pharmacol. 66 (3), 708-717 (2004).</li></ol>

Questo articolo presenta i protocolli dettagliati per l&#39;isolamento e la coltura di completamente differenziate miociti nodo seno-atriale da topi adulti. Il protocollo di isolamento produce in modo affidabile SAM spontaneamente attivi del mouse adatti sia per l&#39;analisi elettrofisiologica immediata o successiva cultura. Protocolli simili sono stati riportati da molti altri gruppi (per esempio, vedere riferimenti 11,12,10,13-17). Tuttavia, il protocollo per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro...

miociti pacemaker nel nodo seno-atriale del cuore (miociti seno-atriale, &quot;SAM&quot;) generano, potenziali spontanei ritmiche d&#39;azione (AP) che si propagano attraverso il miocardio di avviare ogni battito cardiaco. Gli esperimenti che utilizzano SAM acutamente isolati da molte specie sono stati fondamentali per la spiegazione dei meccanismi che contribuiscono alla generazione di attività pacemaker. SAM sono cardiomiociti altamente specializzati che differiscono sostanzialmente dalle loro controparti nel miocardio atriale e ventricolare in termini di morfologia, funzione e l&#39;espressione della proteina. Il segno distintivo di AP spontanee SAM è una depolarizzazione spontanea durante la diastole che spinge il potenziale di membrana di soglia per far scattare la prossima AP 1,2. Questa &quot;potenziale pacemaker&quot; dipende dall&#39;attività coordinata di molte diverse correnti di membrana compreso il &quot;divertente di&quot; (I f), correnti di calcio T e L-type, e la sodico-calcico scambiatore current (I NCX), che è guidato da Ca 2+ rilascio dal reticolo sarcoplasmatico 3,4. Mentre acutamente isolato mouse SAM è una preparazione sperimentale essenziale per lo studio della pacemaking, l&#39;isolamento di SAM da topi può essere un metodo difficile adottare perché l&#39;anatomia indistinto e piccole dimensioni del mouse SAN richiede una microdissezione sfumata e la enzimatica combinata e meccanica dissociazione delle cellule richiede l&#39;ottimizzazione attenta. Forniamo qui un video dimostrativo dettagliata di un protocollo che è stato usato con successo per isolare SAM da topi adulti per le registrazioni di patch clamp 5-8. A nostra conoscenza, non esiste una dimostrazione visiva disponibile da qualsiasi altra fonte. Inoltre, un nuovo metodo è dimostrato nella quale isolato SAM da topi adulti può essere mantenuto in vitro per diversi giorni, permettendo così l&#39;introduzione di proteine, geneticamente codificatomolecole giornalista o RNAi tramite infezione da adenovirus 9.

<table><tbody><tr><td>Sylgruard/Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 0.5KG</td><td></td></tr><tr><td>Borosilicate 9&quot; pasteur pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20C</td><td></td></tr><tr><td>Small, round bottomed culture tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>352059</td><td></td></tr><tr><td>Large, round bottomed culture tubes</td><td>Corning</td><td>14-959-11B</td><td></td></tr><tr><td>Elastase</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002279</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>Tissue dissociation solution</td></tr><tr><td>Heparin</td><td>SAGENT Pharmaceuticals&amp;nbsp;</td><td>NDC 25021-400-10</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Laminin</td><td>Corning</td><td>CB-354232</td><td></td></tr><tr><td>12 mm round glass coverslips</td><td>Fisher&amp;nbsp;</td><td>12-545-80</td><td></td></tr><tr><td>24-well culture plate</td><td>Fisher</td><td>08-772-1</td><td></td></tr><tr><td>Ad-mCherry</td><td>Vector Biolabs</td><td>1767</td><td></td></tr><tr><td>Ad-eGFP</td><td>Vector Biolabs</td><td>1060</td><td></td></tr><tr><td>Plastic, disposable transfer pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micro scissors</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-496</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Forceps</td><td>Roboz Instruments</td><td>RS-4904</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Forceps</td><td>Roboz Instruments</td><td>RS-8164</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Iris Scissors</td><td>WPI, Inc.</td><td>501264</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Pins</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-20</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>60128</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>60353</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>54457</td><td></td></tr><tr><td>glucose</td><td>Sigma</td><td>G0350500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>taurine</td><td>Sigma</td><td>T0625</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>K-glutamate</td><td>Sigma</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>K-aspartate</td><td>Sigma</td><td>A6558</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>creatine</td><td>Sigma</td><td>C0780</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin-B</td><td>Fisher Scientific</td><td>1397-89-3</td><td></td></tr><tr><td>Isoproterenol</td><td>Calbiochem</td><td>420355</td><td></td></tr><tr><td>Media199</td><td>Sigma</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>2,3-butanedione monoxime (BDM)</td><td>Sigma</td><td>B0753</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>SH30071</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A5611</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Selenium</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin</td><td>GE Healthcare</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Hyclone</td><td>SV30010</td><td></td></tr></tbody></table>

methods for the isolation, culture, and functional characterization of sinoatrial node myocytes from adult mice

miociti nodo seno-atriale (SAM) agiscono come i pacemaker naturale del cuore, avviando ogni cuore battere generando potenziali d&#39;azione spontanei (AP). Questi punti di accesso pacemaker riflettono l&#39;attività coordinata di numerose correnti di membrana e il ciclismo calcio intracellulare. Tuttavia i meccanismi precisi che guidano l&#39;attività di pacemaker spontanea in SAM rimangono sfuggente. Acutamente SAM isolati sono una preparazione fondamentale per gli esperimenti di sezionare le basi molecolari della pacemaking cardiaco. Tuttavia, l&#39;anatomia indistinto, microdissezione complessa, e le condizioni di digestione enzimatica meticolosi hanno impedito l&#39;uso diffuso di acutamente isolato SAM. Inoltre, i metodi non erano disponibili fino a poco tempo per consentire la cultura a lungo termine di SAM per gli studi di espressione proteica. Qui forniamo un protocollo e video dimostrativo step-by-step per l&#39;isolamento di SAM da topi adulti. Un metodo è dimostrato anche per il mantenimento di topo adulto SAM in vitro e per espressivosu di proteine ​​esogene tramite infezione da adenovirus. Acutamente isolate e coltivate SAM preparati tramite questi metodi sono adatti per una varietà di studi elettrofisiologici e di imaging.

I protocolli descritti qui sono stati precedentemente utilizzati per isolare spontaneamente attivi SAM da topi adulti che sono adatti per una varietà di differenti di patch clamp studi 5-8. Inoltre, i protocolli consentono SAM isolati che possono essere mantenute in coltura per fino ad una settimana. Il trasferimento genico nelle cellule in coltura può essere realizzato tramite infezione da adenovirus 9. I risultati presentati in questa sezione derivano dal nostro...

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Methods for the Isolation, Culture, and Functional Characterization of Sinoatrial Node Myocytes from Adult Mice

I metodi sono dimostrati per l&#39;isolamento dei miociti nodo seno-atriale (SAM) da topi adulti per gli studi di patch clamp elettrofisiologia e di imaging. cellule isolate possono essere usate direttamente oppure possono essere mantenute in coltura per consentire l&#39;espressione di proteine ​​di interesse, come reporter geneticamente codificati.

Metodi per l&#39;isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

Sinoatrial node myocytes (SAMs) act as the natural pacemakers of the heart, initiating each heart beat by generating spontaneous action potentials (APs). ...

methods-for-isolation-culture-functional-characterization-sinoatrial

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

13.1K Views.  University of Colorado Anschutz Medical Campus.  I metodi sono dimostrati per l'isolamento dei miociti nodo seno-atriale (SAM) da topi adulti per gli studi di patch clamp elettrofisiologia e di imaging. cellule isolate possono essere usate direttamente oppure possono essere mantenute in coltura per consentire l'espressione di proteine ​​di interesse, come reporter geneticamente codificati. 

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Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

Isolamento, Cultura e caratterizzazione funzionale di topo adulto Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Ricerca

Biologia

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

Isolamento dei miociti atriale dai topi adulti

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Medicina

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolamento e Cultura del topo adulto Cardiomyocytes per Cell Signaling e<em&gt; In vitro</em&gt; Cardiaca Ipertrofia

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

Isolation and Culture of Resident Cardiac Macrophages from the Murine Sinoatrial and Atrioventricular Node

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by electrical impulses generated in sinoatrial node (SAN) and then conducted to ventricles via atrioventricular node (AVN). To further study the role of resident macrophages in cardiac conduction system, a proper isolation of resident macrophages from SAN and AVN is necessary, but it remains challenging. Here, we provide a protocol for the reliable microdissection of the SAN and AVN in murine hearts followed by the isolation and culture of resident macrophages.
Both, SAN which is located at the junction of the crista terminalis with the superior vena cava, and AVN which is located at the apex of the triangle of Koch, are identified and microdissected. Correct location is confirmed by histologic analysis of the tissue performed with Masson's trichrome stain and by anti-HCN4.
Microdissected tissues are then enzymatically digested to obtain single cell suspensions followed by the incubation with a specific panel of antibodies directed against cell-type specific surface markers. This allows to identify, count, or isolate different cell populations by fluorescent activated cell sorting. To differentiate cardiac resident macrophages from other immune cells in the myocardium, especially recruited monocyte-derived macrophages, a delicate devised gating strategy is needed. First, lymphoid lineage cells are detected and excluded from further analysis. Then, myeloid cells are identified with resident macrophages being determined by high expression of both CD45 and CD11b, and low expression of Ly6C. With cell sorting, isolated cardiac macrophages can then be cultivated in vitro over several days for further investigation. We, therefore, describe a protocol to isolate cardiac resident macrophages located within the cardiac conduction system. We discuss pitfalls in microdissecting and digesting SAN and AVN, and provide a gating strategy to reliably identify, count and sort cardiac macrophages by fluorescence-activated cell sorting.

The protocol presented here provides a step-by-step approach for the isolation of cardiac resident macrophages from the sinoatrial node (SAN) and atrioventricular node (AVN) region of mouse hearts.

Isolamento e coltura di macrofagi cardiaci residenti dal nodo senoatriale e atrioventricolare murino

Resident cardiac macrophages have been demonstrated to facilitate the electrical conduction in the heart. The physiologic heart rhythm is initiated by ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

Modifiche del metodo Langendorff per l'isolamento simultaneo di miociti atriali e ventricolari da topi adulti

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...

Isolation, Culture and Transduction of Adult Mouse Cardiomyocytes

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and accessibility of in vitro culture enables fine control over biochemical analyses, live imaging, and electrophysiology. Long-term culture of cardiomyocytes offers access to additional experimental approaches that cannot be completed in short term cultures. For example, the in vitro investigation of dedifferentiation, cell cycle re-entry, and cell division has thus far largely been restricted to rat cardiomyocytes, which appear to be more robust in long-term culture. However, the availability of a rich toolset of transgenic mouse lines and well-developed disease models make mouse systems attractive for cardiac research. Although several reports exist of adult mouse cardiomyocyte isolation, few studies demonstrate their long-term culture. Presented here, is a step-by-step method for the isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes. First, retrograde Langendorff perfusion is used to efficiently digest the heart with proteases, followed by gravity sedimentation purification. After a period of dedifferentiation following isolation, the cells gradually attach to the culture and can be cultured for weeks. Adenovirus cell lysate is used to efficiently transduce the isolated cardiomyocytes. These methods provide a simple, yet powerful model system to study cardiac biology.

This protocol describes a step-by-step method for the reproducible isolation and long-term culture of adult mouse cardiomyocytes with high yield, purity, and viability.

Isolamento, cultura e trasduzione di topo adulto cardiomiociti

Cultured cardiomyocytes can be used to study cardiomyocyte biology using techniques that are complementary to in vivo systems. For example, the purity and ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

Un metodo semplice ed efficace per isolare in modo coerente i cardiomiociti di topo

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

Isolamento simultaneo e cultura di miociti atriali, miociti ventricolari e non miociti da un cuore di topo adulto

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

An Antegrade Perfusion Method for Cardiomyocyte Isolation from Mice

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating cardiomyocytes from rabbits, guinea pigs or rats has been performed via retrograde perfusion of the heart with enzymes using a Langendorff apparatus. However, a high degree of skill is required when this method is used with a small mouse heart. An antegrade perfusion method that does not use a Langendorff apparatus was recently reported for the isolation of mouse cardiomyocytes. We herein report a complete protocol for the improved antegrade perfusion of the excised heart to isolate individual heart cells from adult mice (8 - 108 weeks old). Antegrade perfusion is performed by injecting perfusate near the apex of the left ventricle of the excised heart, the aorta of which was clamped, using an infusion pump. All procedures are carried out on a pre-warmed heater mat under a microscope, which allows for the injection and perfusion processes to be monitored. The results suggest that ventricular and atrial myocytes, and fibroblasts can be well isolated from a single adult mouse simultaneously.

We developed a simple method for isolating high quality individual mouse heart cells by the antegrade perfusion technique. This method is Langendorff-free and useful for isolating ventricular and atrial myocytes or interstitial cells, such as cardiac fibroblasts or progenitors.

Un metodo di perfusione antegrada per l'isolamento dei cardiomiociti dai topi

In basic research using mouse heart, isolating viable individual cardiomyocytes is a crucial technical step to overcome. Traditionally, isolating ...

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and calcium handling. For this purpose, atrial or ventricular cardiomyocytes of high quality are necessary to perform patch-clamp measurements or to explore calcium handling abnormalities. However, the limited yield of high-quality cardiomyocytes obtained by current isolation protocols does not allow both measurements in the same mouse. This article describes a method to isolate high-quality murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, for subsequent simultaneous measurements of calcium transients and L-type calcium current from one animal. Mouse hearts are obtained, and the aorta is rapidly cannulated to remove blood. Hearts are then initially perfused with a calcium-free solution (37 &#176;C) to dissociate the tissue at the level of intercalated discs and afterwards with an enzyme solution containing little calcium to disrupt extracellular matrix (37 &#176;C). The digested heart is subsequently dissected into atria and ventricles. Tissue samples are chopped into small pieces and dissolved by carefully pipetting up and down. The enzymatic digestion is stopped, and cells are stepwise reintroduced to physiologic calcium concentrations. After loading with a fluorescent Ca2+-indicator, isolated cardiomyocytes are prepared for simultaneous measurement of calcium currents and transients. Additionally, isolation pitfalls are discussed and patch-clamp protocols and representative traces of L-type calcium currents with simultaneous calcium transient measurements in atrial and ventricular murine myocytes isolated as described above are provided.

Isolation of High Quality Murine Atrial and Ventricular Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and L-Type Calcium Current

Mouse models allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis. For this purpose, high quality cardiomyocytes are necessary to perform patch-clamp measurements. Here, a method to isolate murine atrial and ventricular myocytes via retrograde enzyme-based Langendorff perfusion, which allows simultaneous measurements of calcium-transients and L-type calcium current, is described.

Isolamento di miociti atriali e ventricolari murini di alta qualità per misurazioni simultanee di transitori Ca2+ e corrente di calcio di tipo L

Mouse models play a crucial role in arrhythmia research and allow studying key mechanisms of arrhythmogenesis including altered ion channel function and ...

Metodi per l'isolamento, la cultura, e la caratterizzazione funzionale di seno-atriale Nodo miociti da topi adulti

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