Gli autori ringraziano Marin Manuel e Olivia Goldman-Szwajkajzer per il loro aiuto nel prendere le fotografie. Gli autori ringraziano anche Arjun Masukar e Tobias Bock per la correzione del manoscritto. sostegni finanziari sono stati forniti dalla Agence Nationale pour la Recherche (HYPER-MND, ANR-2010-BLAN-1429-1401), il NIH-NINDS (R01NS077863), il Thierry Latran Foundation (OHEX Project), l&#39;associazione francese per la miopatia ( concessione numero 16026) e target SLA sono ringrazia. Felix Leroy è stato il destinatario di un &quot;Contratto di Dottorato&quot; presso l&#39;Ecole Normale Supérieure, Cachan.

Gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le direttive europee (86/609 / CEE e 2010-63-UE) e la legislazione francese, e sono state approvate dal comitato etico Paris Descartes University. 1. midollo spinale Fetta Preparazione <ol><li> Preparare le seguenti soluzioni giornaliere o un giorno di anticipo. Se tenuto durante la notte, bolla con 95% O 2 e il 5% di CO 2 e conservare in frigo in bottiglie ben chiusi. <ol><li> Preparare bassa Na + fluido artificiale cerebrospinale (ACSF): 3 mm KCl, 1 mM NaH 2 PO 4, 230 mm di saccarosio, 26 mm NaHCO 3, 0,8 mm CaCl 2, 8 mm MgCl 2, 25 mM di glucosio, acido ascorbico 0,4 mm, 1 mM Na-kynurenate, 2 mM Na-piruvato. Bubble con 95% O 2 e 5% CO 2 (pH 7,4). Dal momento che Na-kynurenate è spesso difficile da sciogliere, assicurarsi di acquistare quello elencato nella tabella dei materiali. </li><li> Preparare Solu K-gluconatozione: 130 mm K-gluconato, 15 mm KCl, 0,05 mm EGTA, 20 mM HEPES, 25 mM di glucosio, 1 mM Na-kynurenate, 2 mM Na-piruvato, portato a pH 7,4 con KOH. </li><li> Preparare ACSF: 130 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM MgCl 2, 1 mM NaH 2 PO 4 26 mM NaHCO 3, 25 mM glucosio, 0.4 mM acido ascorbico, 2 mM Na-piruvato. Bubble con 95% O 2 e 5% CO 2 (pH 7,4). </li><li> Prima dell&#39;inizio della dissezione, sciogliere 2% agar in 80 ml della soluzione di K-gluconato e mantiene caldo a 60 ° C. </li></ol></li><li> intracardiaca perfusione <ol><li> Eseguire questa preparazione sui topi maschi e femmine, di età compresa da P2 a P11. </li><li> Anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di 0,1 ml di 25 mM di sodio pentobarbital (50 mg / kg). </li><li> L&#39;utilizzo di aghi o nastro, immobilizzare il mouse sul dorso su un grande piatto di Petri riempita di silicone. Utilizzare un Microscopio di dissezionee per il resto della dissezione. </li><li> Tenendo la punta dello sterno, sollevare il torace e tagliare la membrana usando forbici sottili. Quindi aprire il petto su entrambi i lati da taglio attraverso le costole per esporre il cuore. </li><li> Tagliare l&#39;atrio destro prima di pungere il ventricolo sinistro con un ago 27G. </li><li> Profumato con ghiacciata basso Na + ACSF. Dopo 30 sec, bassa Na + ACSF va visto scorre fuori dell&#39;atrio. Bassa quantità di sodio impediscono alle cellule di chiodare e riducono la morte cellulare durante la dissezione. </li><li> Tenere premuto l&#39;ago nel cuore sotto il microscopio da dissezione fino fegato diventa giallo quando il sangue viene drenato. </li></ol></li><li> Dissezione del midollo spinale <ol><li> Decapitare l&#39;animale e metterlo sul suo stomaco. </li><li> Rimuovere rapidamente la pelle del dorso (Figura 1A1). Fare due tagli attraverso le spalle e scendendo la gabbia toracica (Figura 1A2). Poi tagliare il cordone, come low possibile nella sezione caudale per isolare la colonna vertebrale con l&#39;inizio delle nervature dalla parte inferiore dell&#39;animale. Vibrazione di nuovo l&#39;animale e rimuovere le viscere ancora attaccato alle costole. </li><li> Trasferire la colonna vertebrale ad un altro, più piccolo di silicio pieno capsula di Petri e utilizzare 4 perni di insetti per tenerlo dorsale rivolta verso l&#39;alto (Figura 1A). </li><li> Continuamente profumato l&#39;animale con ACSF CarboGen-gorgogliare (a circa 4 ° C) durante l&#39;esecuzione di una laminectomia del lato dorsale, ed esponendo il midollo spinale dalla fine rostrale (Figura 1B). Per fare ciò, inserire la punta di forbici sottile tra l&#39;osso e il midollo spinale e tagliare l&#39;osso a poco a poco dalla fine rostrale, facendo attenzione a stare lontano dalla sostanza bianca. Alternate su ciascun lato mentre con una pinzetta per tenere lontano il gruppo di osso già tagliato (Figura 1B1). </li><li> Utilizzando le più piccole forbici primavera disponibili e pinzette, sollevare la dura e tagliaresu entrambi i lati sostenendo la parte allentata della dura per evitare di danneggiare il midollo spinale con le forbici. Tagliare lungo l&#39;asse rostro-caudale. NOTA: La dura è una membrana continua trasparente semi; a questa età la pia madre è troppo fragile e si sfaldi durante la dissezione e taglio (Figura 1B2). </li><li> Una volta che la dura madre è uso rimosso un vetro smussato o punta di plastica per spingere delicatamente il cavo sul lato sinistro della scanalatura formata dalla colonna vertebrale mezzo taglio, e tagliare le radici ventrali e dorsali sul lato destro, partendo dal lato rostrale , lontano da dove entrano il cavo (alcuni mm almeno, Figura 1B2). </li><li> Ripetere l&#39;operazione sul lato sinistro, sempre passando da rostrale a caudale. Se mancino, partire dal lato sinistro e poi spostarsi verso il lato destro. </li></ol></li><li> Incorporare in agar <ol><li> Infilare il cavo della colonna vertebrale. Utilizzare un perno insetto più piccolo da definireil cavo con dorsale superficie e rimuovere delicatamente qualsiasi pezzo di membrana ancora collegato ad esso (Figura 1C1). </li><li> Una volta puliti, tagliare entrambe le estremità (Figura 1C2). Inserire un perno insetto piegato nella parte anteriore del cavo di manipolare il cordone e notare il suo orientamento (freccia in Figura 1C2). Poi il trasferimento del midollo spinale a una soluzione K-gluconato ghiacciata. NOTA: Questa soluzione imita la composizione intracellulare del QCS e impedisce alle cellule di morire di shock osmotico una volta che i motoneuroni saranno tagliati 26. </li><li> Una volta che il midollo spinale è all&#39;interno della soluzione intracellulare, prendere il bicchiere con l&#39;agar dal bagno secco e raffreddarlo su una miscela di acqua e ghiaccio. </li><li> Continuate a mescolare mentre la misurazione della temperatura. Quando la temperatura raggiunge i 38 ° C immergere il midollo spinale, tenendolo per il perno di insetti e posizionarlo lato rostrale verso il basso. Assicurarsi che il midollo spinale è come straight possibile, lontano dalle pareti, parte caudale leggermente verso l&#39;alto (Figura 1D1). </li><li> Lasciare il bicchiere nella miscela di acqua e ghiaccio per consentire l&#39;agar solidificare il più rapidamente possibile. Assicurarsi che rimanga al suo posto e che il cavo è più diritta possibile (Figura 1D1). </li></ol></li><li> Affettare <ol><li> Dopo solidificazione, tagliare il blocco agar contenente il midollo spinale in modo tale che la base del blocco è ad un angolo di 35 ° con la parte lombare del cavo (freccia in Figura 1D2). La superficie dorsale deve essere rivolto lontano dalla base (Figura 1D2). NOTA: Questo è un passo fondamentale nella procedura, per mantenere la continuità delle piscine motoneurone alle radici ventrali da cui escono. </li><li> Incollare il blocco nella camera del vibratome con colla cianoacrilato. Immergerlo in soluzione K-gluconato e aggiungere slushed soluzione K-gluconato congelato per mantenereil bagno fresco (al di sotto di 2 ° C). </li><li> Tagliare 350 - 400 micron di spessore fette di regione lombare (identificabili dalla sua curvatura e diametro maggiore). Nel suo corretto orientamento (vedi 1.4.1.), Utilizzare la lama per tagliare dalla dorsale alla superficie ventrale e rendere fette continuamente più rostrale. In genere, ci sono 4-5 fette adatti con radici ventrali si estendono o più di 2 mm. Utilizzare i seguenti parametri: 10 ° angolo, frequenza di vibrazione di 70 Hz e 10 mm / min velocità di taglio. </li></ol></li><li> incubazione <ol><li> Trasferire le fettine di ACSF a 34 ° C. Dopo circa 30 minuti, raffreddare le fette fino a RT e iniziare la sessione di registrazione. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig1.jpg" /> Figura 1. Dissezione A1:. La rimozione della pelle del dorso per esporre la colonna dorsale A2:Taglio delle spalle e le costole per liberare la dorsale della colonna B1:. Colonna vertebrale appuntato sulla capsula di Petri silicone-riempita (lato dorsale fino, lato caudale sinistra) B2:. Lo stesso con il midollo spinale esposto e sezionato C1:. Midollo spinale isolato . (lato rostrale sinistra) C2: midollo spinale pronto per essere incorporato (fino lato ventrale, lato rostrale a sinistra). Nota il perno di insetto più piccolo sul lato rostrale D1:.. Midollo spinale nel bicchiere agar (lato rostrale Dow, lato ventrale rivolto verso il basso) D2: Tagliare blocco di agar con il midollo spinale incorporato. Nota l&#39;angolo di 35 ° le forme del midollo spinale con la base del blocco e l&#39;ampliamento lombare (freccia). Barre di scala 1 cm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54525/54525fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 2. Posizionamento del Slice nella Camera NOTA: Veradici ntral sono di dimensioni variabili. <ol><li> Preparare una scatola di vari pipette con puntali di diametro da 40 a 170 micron in anticipo. Per preparare pipette di aspirazione, preparare molte pipette con un lungo cono. Con un coltello diamante, effettuare un taglio in posizioni diverse. Poi sotto un microscopio da dissezione, romperlo colpendo la punta con una pinzetta. </li><li> Rimuovere la camera dal microscopio registrazione e posizionarlo sotto un microscopio da dissezione. </li><li> Selezionare una slice che contiene una radice ventrale lunghezza sufficiente (2 mm o più) per essere montato su un elettrodo di stimolazione di aspirazione. Selezionare il corretto orientamento della fetta con le radici ventrali verso l&#39;alto (Figura 2A) e delicatamente tagliare l&#39;agar intorno alle radici ventrali lasciando il resto del agar intorno fetta (Figura 2B). NOTA: Perché la agar è più solido rispetto alle fetta, questo permetterà i fili di ancoraggio della fetta di riposare sul agar, piuttosto che sulla fetta e quindi l&#39;unanchor non danneggia il tessuto. Assicurarsi che i fili della ancoraggio della fetta sono sopra la piscina motoneuroni (in rosso nella figura 2C). </li><li> Montare la camera posteriore sul microscopio e continuamente profumato camera di registrazione con ACSF ad una velocità di 1 - 2 ml / min, a temperatura ambiente. Usando una pipetta di vetro riempito con ACSF e collegato ad una siringa, succhiare uno della radice ventrale (freccia in Figura 2C). Al fine di ottenere una buona stimolazione della radice ventrale, la punta della pipetta deve essere stretto intorno alla radice ventrale. Un polo dovrebbe essere l&#39;elettrodo stimolante e l&#39;altro nella vasca (o connesso al riferimento elettrodo patch-bloccaggio). </li><li> Ottenere registrazione patch-clamp della cellula-tipo desiderato e registrare l&#39;effetto di stimolazione della radice ventrale come descritto previsouly 10. <ol><li> Qui, utilizzare un amplificatore per l&#39;acquisizione dati. Filtro registrazioni cellule intere a 3 kHz. Digitalizzare a 10 kHz. Compensare resistenza ponte in curreModalità nt morsetto. </li></ol></li></ol><img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54525/54525fig2.jpg" /> Figura 2. ventrale Root Preparazione A: fetta midollo spinale lombare incorporato nel agar con la radice ventrale rivolto verso l&#39;alto. B: la fetta del midollo spinale lombare con le radici ventrali liberati dal agar C:. Fetta midollo spinale lombare con un elettrodo stimolante strettamente collocato intorno alle radici ventrali (freccia) . Si noti la posizione delle cellule Renshaw che esprimono fluorescenza rossa nel chrna2-Cre del mouse 28 incrociata con la giornalista del mouse R26 Tom 17. Barre scala 1 mm. <a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/54525/54525fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

<ol>
	<li>Brooks, C. M., Downman, C. B., Eccles, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=After-potentials+and+excitability+of+spinal+motoneurones+following+antidromic+activation.">After-potentials and excitability of spinal motoneurones following antidromic activation.</a> J Neurophysiol. 13 (1), 9-38 (1950).</li><li>Bories, C., Amendola, J., Lamotte d'Incamps, B., Durand, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+electrophysiological+abnormalities+in+lumbar+motoneurons+in+a+transgenic+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early electrophysiological abnormalities in lumbar motoneurons in a transgenic mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Eur J Neurosci. 25 (2), 451-459 (2007).</li><li>Takahashi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+currents+in+visually+identified+motoneurones+of+neonatal+rat+spinal+cord.">Membrane currents in visually identified motoneurones of neonatal rat spinal cord.</a> J Physiol. 423, 27-46 (1990).</li><li>Hori, N., Tan, Y., Strominger, N. L., Carpenter, D. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+activity+of+rat+spinal+cord+motoneurons+in+slices.">Intracellular activity of rat spinal cord motoneurons in slices.</a> J Neurosci Methods. 112 (2), 185-191 (2001).</li><li>Arai, Y., Mentis, G. Z., Wu, J. Y., O'Donovan, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ventrolateral+origin+of+each+cycle+of+rhythmic+activity+generated+by+the+spinal+cord+of+the+chick+embryo.">Ventrolateral origin of each cycle of rhythmic activity generated by the spinal cord of the chick embryo.</a> PLoS One. 2 (5), e417 (2007).</li><li>Cullheim, S., Lipsenthal, L., Burke, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+monosynaptic+contacts+between+type-identified+alpha-motoneurons+in+the+cat.">Direct monosynaptic contacts between type-identified alpha-motoneurons in the cat.</a> Brain Res. 308 (1), 196-199 (1984).</li><li>Cullheim, S., Kellerth, J. O., Conradi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+direct+synaptic+interconnections+between+cat+spinal+alpha-motoneurons+via+the+recurrent+axon+collaterals:+a+morphological+study+using+intracellular+injection+of+horseradish+peroxidase.">Evidence for direct synaptic interconnections between cat spinal alpha-motoneurons via the recurrent axon collaterals: a morphological study using intracellular injection of horseradish peroxidase.</a> Brain Res. 132 (1), 1-10 (1977).</li><li>Gogan, P., Gueritaud, J. P., Horcholle-Bossavit, G., Tyc-Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+excitatory+interactions+between+spinal+motoneurones+of+the+cat.">Direct excitatory interactions between spinal motoneurones of the cat.</a> J Physiol. 272 (3), 755-767 (1977).</li><li>Ichinose, T., Miyata, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+excitation+of+motoneurons+in+the+isolated+spinal+cord+of+newborn+rats+detected+by+whole-cell+recording.">Recurrent excitation of motoneurons in the isolated spinal cord of newborn rats detected by whole-cell recording.</a> Neurosci Res. 31 (3), 179-187 (1998).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Four+excitatory+postsynaptic+ionotropic+receptors+coactivated+at+the+motoneuron-Renshaw+cell+synapse.">Four excitatory postsynaptic ionotropic receptors coactivated at the motoneuron-Renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 28 (52), 14121-14131 (2008).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+effects+of+centripetal+impulses+in+axons+of+spinal+ventral+roots.">Central effects of centripetal impulses in axons of spinal ventral roots.</a> J Neurophysiol. 9, 191-204 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+as+a+mechanism+in+central+inhibition.">Interaction of nerve impulses in the gray matter as a mechanism in central inhibition.</a> Fed Proc. 5 (1 Pt 2), 86 (1946).</li><li>Renshaw, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+interaction+of+nerve+impulses+in+the+gray+matter+and+on+the+nature+of+central+inhibition).">Observations on interaction of nerve impulses in the gray matter and on the nature of central inhibition).</a> Am J Physiol. 146, 443-448 (1946).</li><li>Pambo-Pambo, A., Durand, J., Gueritaud, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+excitability+changes+in+lumbar+motoneurons+of+transgenic+SOD1G85R+and+SOD1G(93A-Low)+mice.">Early excitability changes in lumbar motoneurons of transgenic SOD1G85R and SOD1G(93A-Low) mice.</a> J Neurophysiol. 102 (6), 3627-3642 (2009).</li><li>Quinlan, K. A., Schuster, J. E., Fu, R., Siddique, T., Heckman, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+postnatal+maturation+of+electrical+properties+in+spinal+motoneurons+in+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Altered postnatal maturation of electrical properties in spinal motoneurons in a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> J Physiol. 589 (Pt 9), 2245-2260 (2011).</li><li>Martin, E., Cazenave, W., Cattaert, D., Branchereau, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+alteration+of+motoneuronal+morphology+induces+hyperexcitability+in+the+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Embryonic alteration of motoneuronal morphology induces hyperexcitability in the mouse model of amyotrophic lateral sclerosis.</a> Neurobiol Dis. 54, 116-126 (2013).</li><li>Hadzipasic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+degeneration+of+a+physiological+subtype+of+spinal+motor+neuron+in+mice+with+SOD1-linked+ALS.">Selective degeneration of a physiological subtype of spinal motor neuron in mice with SOD1-linked ALS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (47), 16883-16888 (2014).</li><li>Wichterle, H., Lieberam, I., Porter, J. A., Jessell, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+motor+neurons.">Directed differentiation of embryonic stem cells into motor neurons.</a> Cell. 110 (3), 385-397 (2002).</li><li>Tallini, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC+transgenic+mice+express+enhanced+green+fluorescent+protein+in+central+and+peripheral+cholinergic+neurons.">BAC transgenic mice express enhanced green fluorescent protein in central and peripheral cholinergic neurons.</a> Physiol Genomics. 27 (3), 391-397 (2006).</li><li>Manuel, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+kinetics,+high-frequency+oscillations,+and+subprimary+firing+range+in+adult+mouse+spinal+motoneurons.">Fast kinetics, high-frequency oscillations, and subprimary firing range in adult mouse spinal motoneurons.</a> J Neurosci. 29 (36), 11246-11256 (2009).</li><li>Obeidat, A. Z., Nardelli, P., Powers, R. K., Cope, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modulation+of+motoneuron+firing+by+recurrent+inhibition+in+the+adult+rat+in+vivo.">Modulation of motoneuron firing by recurrent inhibition in the adult rat in vivo.</a> J Neurophysiol. 112 (9), 2302-2315 (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Imhoff-Manuel, R. D., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+intrinsic+hyperexcitability+does+not+contribute+to+motoneuron+degeneration+in+amyotrophic+lateral+sclerosis.">Early intrinsic hyperexcitability does not contribute to motoneuron degeneration in amyotrophic lateral sclerosis.</a> Elife. 3, (2014).</li><li>Leroy, F., Lamotte d'Incamps, B., Zytnicki, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Potassium+currents+dynamically+set+the+recruitment+and+firing+properties+of+F-type+motoneurons+in+neonatal+mice.">Potassium currents dynamically set the recruitment and firing properties of F-type motoneurons in neonatal mice.</a> J Neurophysiol. 114 (3), 1963-1973 (2015).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subunit+composition+and+kinetics+of+the+Renshaw+cell+heteromeric+nicotinic+receptors.">Subunit composition and kinetics of the Renshaw cell heteromeric nicotinic receptors.</a> Biochem Pharmacol. 86 (8), 1114-1121 (2013).</li><li>Lamotte d'Incamps, B., Krejci, E., Ascher, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+shaping+the+slow+nicotinic+synaptic+current+at+the+motoneuron-renshaw+cell+synapse.">Mechanisms shaping the slow nicotinic synaptic current at the motoneuron-renshaw cell synapse.</a> J Neurosci. 32 (24), 8413-8423 (2012).</li><li>Dugue, G. P., Dumoulin, A., Triller, A., Dieudonne, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Target-dependent+use+of+co-released+inhibitory+transmitters+at+central+synapses.">Target-dependent use of co-released inhibitory transmitters at central synapses.</a> J Neurosci. 25 (28), 6490-6498 (2005).</li><li>Mentis, G. Z., Siembab, V. C., Zerda, R., O'Donovan, M. J., Alvarez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+afferent+synapses+on+developing+and+adult+Renshaw+cells.">Primary afferent synapses on developing and adult Renshaw cells.</a> J Neurosci. 26 (51), 13297-13310 (2006).</li><li>Perry, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Firing+properties+of+Renshaw+cells+defined+by+Chrna2+are+modulated+by+hyperpolarizing+and+small+conductance+ion+currents+Ih+and+ISK.">Firing properties of Renshaw cells defined by Chrna2 are modulated by hyperpolarizing and small conductance ion currents Ih and ISK.</a> Eur J Neurosci. 41 (7), 889-900 (2015).</li><li>Thurbon, D., Luscher, H. R., Hofstetter, T., Redman, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Passive+electrical+properties+of+ventral+horn+neurons+in+rat+spinal+cord+slices.">Passive electrical properties of ventral horn neurons in rat spinal cord slices.</a> J Neurophysiol. 79 (5), 2485-2502 (1998).</li><li>Zengel, J. E., Reid, S. A., Sypert, G. W., Munson, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+electrical+properties+and+prediction+of+motor-unit+type+of+medial+gastrocnemius+motoneurons+in+the+cat.">Membrane electrical properties and prediction of motor-unit type of medial gastrocnemius motoneurons in the cat.</a> J Neurophysiol. 53 (5), 1323-1344 (1985).</li><li>Cooper, S., Sherington, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gower's+tract+and+spinal+border+cells.">Gower's tract and spinal border cells.</a> Brain. 63, 123-124 (1940).</li><li>Morin, F., Schwartz, H. G., O'Leary, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+study+of+the+spinothalamic+and+related+tracts.">Experimental study of the spinothalamic and related tracts.</a> Acta Psychiatr Neurol Scand. 26 (3-4), 371-396 (1951).</li><li>Sengul, G., Fu, Y., Yu, Y., Paxinos, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinal+cord+projections+to+the+cerebellum+in+the+mouse.">Spinal cord projections to the cerebellum in the mouse.</a> Brain Struct Funct. 220 (5), 2997-3009 (2015).</li><li>Russier, M., Carlier, E., Ankri, N., Fronzaroli, L., Debanne, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A-,+T-,+and+H-type+currents+shape+intrinsic+firing+of+developing+rat+abducens+motoneurons.">A-, T-, and H-type currents shape intrinsic firing of developing rat abducens motoneurons.</a> J Physiol. 549 (Pt 1), 21-36 (2003).</li><li>Dourado, M., Sargent, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Properties+of+nicotinic+receptors+underlying+Renshaw+cell+excitation+by+alpha-motor+neurons+in+neonatal+rat+spinal+cord).">Properties of nicotinic receptors underlying Renshaw cell excitation by alpha-motor neurons in neonatal rat spinal cord).</a> J Neurophysiol. 87 (6), 3117-3125 (2002).</li><li>Mitra, P., Brownstone, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+in+vitro+spinal+cord+slice+preparation+for+recording+from+lumbar+motoneurons+of+the+adult+mouse.">An in vitro spinal cord slice preparation for recording from lumbar motoneurons of the adult mouse.</a> J Neurophysiol. 107 (2), 728-741 (2012).</li><li>Rothman, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neurotoxicity+of+excitatory+amino+acids+is+produced+by+passive+chloride+influx.">The neurotoxicity of excitatory amino acids is produced by passive chloride influx.</a> J Neurosci. 5 (6), 1483-1489 (1985).</li><li>Olney, J. W., Price, M. T., Samson, L., Labruyere, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+specific+ions+in+glutamate+neurotoxicity.">The role of specific ions in glutamate neurotoxicity.</a> Neurosci Lett. 65 (1), 65-71 (1986).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

affettare obliqua del midollo spinale è importante in quanto consente per la stimolazione unilaterale delle piscine del motoneurone e cellule Renshaw in un unico segmento vertebrale in modo affidabile, completa e specifica. Inoltre, consente una rapida identificazione, elegante e non ambigua dei motoneuroni registrati. Successivamente, si metterà in evidenza i vantaggi di questa tecnica rispetto ad altri metodi di preparazione fetta, e poi ci sottolineare le insidie ​​più comuni da evitare durante l&#39;esecuzion...

Storicamente, le registrazioni del motoneurone utilizzando sharp-elettrodi sono stati condotti in vivo su animali di grossa taglia come gatti o topi 1 o su un isolato intero midollo spinale nei topi 2. L&#39;emergere della tecnica di registrazione patch-clamp nel corso del 1980, chiamato per l&#39;accesso diretto al motoneurone somas come guarnizioni doveva essere raggiunto sotto la guida visiva. Così, il midollo spinale preparazione fetta è stato raggiunto facilmente a partire dai primi anni 1990 3. Tuttavia, la preparazione fetta precoce spesso non consentiva la stimolazione delle radici ventrali. Per quanto a nostra conoscenza, solo due studi hanno riportato la stimolazione successo delle radici ventrali a fette trasversali, e nessuno è stato ottenuto da topi 4,5. In questo articolo presentiamo una tecnica per ottenere valide fette del midollo spinale di topi neonati (P2 - P11) in cui la piscina motoneuroni conserva le sue radici ventrali partenza assoni. Sfogola stimolazione della radice ral innesca potenziale d&#39;azione antidromic di nuovo nelle somas della piscina motoneuroni in uscita dalla stessa radice ventrale. Si eccita anche gli obiettivi collaterali motoneurone, altri motoneuroni 6-10 e le cellule Renshaw 11-13. Dal momento che solo motoneuroni inviano i loro assoni le radici ventrali, usiamo la registrazione dei potenziali d&#39;azione antidromic come un modo semplice e definitivo per physiologicaly identificare motoneuroni 10. Oltre a utilizzare criteri elettrofisiologici e morfologici potenzialmente non inclusivi o fuorvianti per confermare l&#39;identità del motoneurone, recenti studi sui motoneuroni del midollo spinale anche invocato noioso e che richiede tempo post hoc colorazioni 16. Tale identificazione viene solitamente eseguita solo su un campione delle cellule registrate. Altre strategie di identificazione basano su linee di topi in cui i motoneuroni esprimono fluorescenza endogena <sup&gt; 17-19. Tuttavia, utilizzando i marcatori geneticamente codificate può essere difficile in giovane età, quando l&#39;espressione marcatore è ancora variabile o se lo studio richiede già utilizzando una linea di topi transgenici. In alternativa, azione antidromic potenziali registrazioni possono essere effettuate sistematicamente su tutti i topi dall&#39;insorgenza della registrazione cellule. Gli sperimentatori che lavorano su intatti i preparativi del midollo spinale nel gatto, ratto e nel topo, hanno usato in modo affidabile queste tecniche di identificazione dal 1950 1,2,20,21. In condizioni ottimali, siamo stati in grado di suscitare potenziali d&#39;azione antidromic praticamente da tutti i motoneuroni registrati. Inoltre, la stimolazione della radice ventrale può essere utilizzata per eccitare affidabile altre motoneuroni 22,23 o loro bersagli. le cellule Renshaw 10,24,25. Vi presentiamo qui le applicazioni della stimolazione della radice ventrale, sotto forma di azione antidromic potenziali registrazioni dal motoneurone somas, così come l&#39;eccitazione delle cellule Renshaw.

<table><tbody><tr><td>Na-kynurenate</td><td>ABCAM</td><td>ab120256</td><td>dissolves better then other brands</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>sucrose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S6014</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>G Biosciences</td><td>R040</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;nbsp;</td><td>Quality Biological</td><td>351-033-721</td><td></td></tr><tr><td>glucose&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>G5767</td><td></td></tr><tr><td>ascorbic acid&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A5960</td><td></td></tr><tr><td>Na-pyruvate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P2250</td><td></td></tr><tr><td>K-gluconate&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1847</td><td></td></tr><tr><td>EGTA&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma</td><td>A9799</td><td></td></tr><tr><td>QX-314</td><td>Alomone</td><td>Q150</td><td></td></tr><tr><td>Mg-ATP</td><td>Sigma</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>CsOH</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>Na-GTP</td><td>Sigma</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>gluconic acid</td><td>Sigma</td><td>G1951</td><td></td></tr><tr><td>Cesium hydroxide solution</td><td>Sigma</td><td>232041</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P5958</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Spring Scissors - 2.5mm&amp;nbsp;</td><td>FST</td><td>15000-08</td><td>only use for cutting the dura, might get damaged if cutting bones</td></tr><tr><td>Stimulator</td><td>A-M Systems</td><td>Isolated Pulse Stimulator Model 2100</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Campden</td><td>Vibrating Microtome 7000 - Model 7000smz-2</td><td></td></tr></tbody></table>

the preparation of oblique spinal cord slices for ventral root stimulation

registrazioni elettrofisiologiche da fette del midollo spinale hanno dimostrato di essere una tecnica preziosa per indagare su una vasta gamma di questioni, dal cellulare alla proprietà della rete. Mostriamo come preparare fette oblique vitali del midollo spinale di topi giovani (P2 - P11). In questa preparazione, i motoneuroni mantengono le loro assoni che esce dalle radici ventrali del midollo spinale. La stimolazione di questi assoni suscita back-propaganti potenziali d&#39;azione che invadono il somas motoneurone ed eccitanti collaterali del motoneurone nel midollo spinale. La registrazione dei potenziali d&#39;azione antidromic è un modo immediato, definitivo ed elegante per caratterizzare l&#39;identità del motoneurone, che supera gli altri metodi di identificazione. Inoltre, stimolando le collaterali motoneurone è un modo semplice e affidabile per eccitare i bersagli collaterali dei motoneuroni nel midollo spinale, come altri motoneuroni o Renshaw cellule. In questo protocollo, vi presentiamo le registrazioni antidromic dal motoneurone somas così come l&#39;eccitazione delle cellule Renshaw, derivante dalla stimolazione della radice ventrale.

La conferma di motoneuroni identità utilizzando Potenziali antidromica azione cellulare il targeting Motoneuroni si trovano nel corno ventrale (visibile in rosso nella Figura 2C). Inizia da fascio di assoni che formano la radice ventrale e salire fino a quando il fascio si disperde completamente e si comincia a veder...

Watch this Scientific Journal Video about The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation at JoVE.com

The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Mostriamo come preparare le fette oblique del midollo spinale nei topi giovani. Questa preparazione consente la stimolazione delle radici ventrali.

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Electrophysiological recordings from spinal cord slices have proven to be a valuable technique to investigate a wide range of questions, from cellular to ...

the-preparation-oblique-spinal-cord-slices-for-ventral-root

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.4K Views.  Centre de Neurophysique, Physiologie et Pathologie, Université Paris Descartes.  Mostriamo come preparare le fette oblique del midollo spinale nei topi giovani. Questa preparazione consente la stimolazione delle radici ventrali. 

Video: The Preparation of Oblique Spinal Cord Slices for Ventral Root Stimulation

Acute Dissociation of Lamprey Reticulospinal Axons to Enable Recording from the Release Face Membrane of Individual Functional Presynaptic Terminals

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated calcium channels (VGCCs) located in the release face membrane, is the trigger for vesicle fusion and neurotransmitter release. Crucial to the rapidity of synaptic transmission is the spatial and temporal synchrony between the arrival of the action potential, VGCCs and the neurotransmitter release machinery. The ability to directly record Ca2+&#160;currents from the release face membrane of individual presynaptic terminals is imperative for a precise understanding of the relationship between presynaptic Ca2+&#160;and neurotransmitter release. Access to the presynaptic release face membrane for electrophysiological recording is not available in most preparations and presynaptic Ca2+&#160;entry has been characterized using imaging techniques and macroscopic current measurements &#8211; techniques that do not have sufficient temporal resolution to visualize Ca2+ entry. The characterization of VGCCs directly at single presynaptic terminals has not been possible in central synapses and has thus far been successfully achieved only in the calyx-type synapse of the chick ciliary ganglion and in rat calyces. We have successfully addressed this problem in the giant reticulospinal synapse of the lamprey spinal cord by developing an acutely dissociated preparation of the spinal cord that yields isolated reticulospinal axons with functional presynaptic terminals devoid of postsynaptic structures. We can fluorescently label and identify individual presynaptic terminals and target them for recording. Using this preparation, we have characterized VGCCs directly at the release face of individual presynaptic terminals using immunohistochemistry and electrophysiology approaches. Ca2+ currents have been recorded directly at the release face membrane of individual presynaptic terminals, the first such recording to be carried out at central synapses.

Recording Ca2+ currents at the presynaptic release face membrane is key to a precise understanding of Ca2+ entry and neurotransmitter release. We present an acute dissociation of the lamprey spinal cord that yields functional isolated reticulospinal axons, permitting recording directly from the release face membrane of individual presynaptic terminals.

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Synaptic transmission is an extremely rapid process. Action potential driven influx of Ca2+&#160;into the presynaptic terminal, through voltage-gated ...

Ricerca

Neuroscienze

Intramuscular Injections Along the Motor End Plates: A Minimally Invasive Approach to Shuttle Tracers Directly into Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the development of several animal models of these neuromuscular disorders has provided the scientific community with different therapeutic scenarios aimed at delaying or reversing the progression of these conditions. By taking advantage of the retrograde machinery of neurons, one of these approaches has been to target skeletal muscles in order to shuttle therapeutic genes into corresponding spinal cord motor neurons. Although once promising, the success of such gene delivery approach has been hampered by the sub-optimal number of transduced motor neurons it has so far shown to yield. Motor end plates (MEPs) are highly specialized regions on the skeletal musculature that are in direct synaptic contact to the spinal cord &#945; motor neurons. In this regard, it is important to note that, so far, the efforts to retrogradely transfer genes into motor neurons were made without reference to the location of the MEP region in the targeted muscles. Here, we describe a simple protocol 1) to reveal the exact location of the MEPs on the surface of skeletal muscles and 2) to use this information to guide the intramuscular delivery and subsequent optimal retrograde transport of retrograde tracers into motor neurons. We hope to utilize the results from these tracing experiments in further studies into investigating retrograde transport of therapeutic genes to spinal cord motor neurons through the targeting of MEPs.

The efficacy of intramuscular uptake and retrograde transport of molecules to corresponding motor neurons depends on the location of the injection sites with respect to the motor end plates (MEPs). Here, we describe how to locate MEPs on skeletal muscles to optimise retrograde transport of tracers into motor neurons.

Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons

Diseases affecting the integrity of spinal cord motor neurons are amongst the most debilitating neurological conditions. Over the last decades, the ...

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing organisms, combined with the embryonic optical clarity, served as initial compelling attributes of this model. Over the past two decades, the success of this model has been further propelled by its amenability to large-scale mutagenesis screens and by the ease of transgenesis. More recently, gene-editing approaches have extended the power of the model.
For neurodevelopmental studies, the zebrafish embryo and larva provide a model to which multiple methods can be applied. Here, we focus on methods that allow the study of an essential property of neurons, electrical excitability. Our preparation for the electrophysiological study of zebrafish spinal neurons involves the use of veterinarian suture glue to secure the preparation to a recording chamber. Alternative methods for recording from zebrafish embryos and larvae involve the attachment of the preparation to the chamber using a fine tungsten pin1,2,3,4,5. A tungsten pin is most often used to mount the preparation in a lateral orientation, although it has been used to mount larvae dorsal-side up4. The suture glue has been used to mount embryos and larvae in both orientations. Using the glue, a minimal dissection can be performed, allowing access to spinal neurons without the use of an enzymatic treatment, thereby avoiding any resultant damage. However, for larvae, it is necessary to apply a brief enzyme treatment to remove the muscle tissue surrounding the spinal cord. The methods described here have been used to study the intrinsic electrical properties of motor neurons, interneurons, and sensory neurons at several developmental stages6,7,8,9.

Zebrafish In Situ Spinal Cord Preparation for Electrophysiological Recordings from Spinal Sensory and Motor Neurons

This manuscript describes methods for electrophysiological recordings from spinal neurons of zebrafish embryos and larvae. The preparation maintains neurons in situ and often involves minimum dissection. These methods allow for the electrophysiological study of a variety of spinal neurons, from the initial electrical excitability acquisition through the early larval stages.

zebrafish<em&gt; In Situ</em&gt; Spinal Cord Preparazione per elettrofisiologiche Le registrazioni da spinale sensoriali e motori neuroni

Zebrafish, first introduced as a developmental model, have gained popularity in many other fields. The ease of rearing large numbers of rapidly developing ...

Preparation of Acute Spinal Cord Slices for Whole-cell Patch-clamp Recording in Substantia Gelatinosa Neurons

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms underlying sensory transmission, nociceptive regulation, and chronic pain or itch development. Implementations of electrophysiological recordings together with morphological studies based on the utility of acute spinal cord slices have further improved our understanding of neuronal properties and the composition of local circuitry in SG. Here, we present a detailed and practical guide for the preparation of spinal cord slices and show representative whole-cell recording and morphological results. This protocol permits ideal neuronal preservation and can mimic in vivo conditions to a certain extent. In summary, the ability to obtain an in vitro preparation of spinal cord slices enables stable current- and voltage-clamp recordings and could thus facilitate detailed investigations into the intrinsic membrane properties, local circuitry and neuronal structure using diverse experimental approaches.

Here, we describe the essential steps for whole-cell patch-clamp recordings made from substantia gelatinosa (SG) neurons in the in vitro spinal cord slice. This method allows the intrinsic membrane properties, synaptic transmission and morphological characterization of SG neurons to be studied.

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Recent whole-cell patch-clamp studies from substantia gelatinosa (SG) neurons have provided a large body of information about the spinal mechanisms ...

Preparation of Rhythmically-active In Vitro Neonatal Rodent Brainstem-spinal Cord and Thin Slice

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a signal driving the rhythmic contraction of inspiratory muscles. Rhythmic neural activity generated in the pBC and carried to other neuronal pools to drive the musculature of breathing may be studied using various approaches, including en bloc nerve recordings and transverse slice recordings. However, previously published methods have not extensively described the brainstem-spinal cord dissection process in a transparent and reproducible manner for future studies. Here, we present a comprehensive overview of a method used to reproducibly cut rhythmically-active brainstem slices containing the necessary and sufficient neuronal circuitry for generating and transmitting inspiratory drive. This work builds upon previous brainstem-spinal cord electrophysiology protocols to enhance the likelihood of reliably obtaining viable and rhythmically-active slices for recording neuronal output from the pBC, hypoglossal premotor neurons (XII pMN), and hypoglossal motor neurons (XII MN). The work presented expands upon previous published methods by providing detailed, step-by-step illustrations of the dissection, from whole rat pup, to in vitro slice containing the XII rootlets.

This protocol both visually communicates the brainstem-spinal cord preparation and clarifies the preparation of brainstem transverse slices in a comprehensive step-by-step manner. It was designed to increase reproducibility and enhance the likelihood of obtaining viable, long lasting, rhythmically-active slices for recording neural output from the respiratory regions of the brainstem.

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

Mammalian inspiratory rhythm is generated from a neuronal network in a region of the medulla called the preB&#246;tzinger complex (pBC), which produces a ...

In Vivo Intracellular Recording of Type-Identified Rat Spinal Motoneurons During Trans-Spinal Direct Current Stimulation

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological characteristics in the intact spinal network and holds significant advantages relative to classical in vitro or extracellular recording techniques. An advantage of in vivo intracellular recordings is that this method can be performed on adult animals with a fully mature nervous system, and therefore many observed physiological mechanisms can be translated to practical applications. In this methodological paper, we describe this procedure combined with externally applied constant current stimulation, which mimics polarization processes occurring within spinal neuronal networks. Trans-spinal direct current stimulation (tsDCS) is an innovative method increasingly used as a neuromodulatory intervention in rehabilitation after various neurological injuries as well as in sports. The influence of tsDCS on the nervous system remains poorly understood and the physiological mechanisms behind its actions are largely unknown. The application of the tsDCS simultaneously with intracellular recordings enables us to directly observe changes of motoneuron membrane properties and characteristics of rhythmic firing in response to the polarization of the spinal neuronal network, which is crucial for the understanding of tsDCS actions. Moreover, when the presented protocol includes the identification of the motoneuron with respect to an innervated muscle and its function (flexor versus extensor) as well as the physiological type (fast versus slow) it provides an opportunity to selectively investigate the influence of tsDCS on identified components of spinal circuitry, which seem to be differently affected by polarization. The presented procedure focuses on surgical preparation for intracellular recordings and stimulation with an emphasis on the steps which are necessary to achieve preparation stability and reproducibility of results. The details of the methodology of the anodal or cathodal tsDCS application are discussed while paying attention to practical and safety issues.

This protocol describes in vivo intracellular recording of rat lumbar motoneurons with simultaneous trans-spinal direct current stimulation. The method enables us to measure membrane properties and to record rhythmic firing of motoneurons before, during and after anodal or cathodal polarization of the spinal cord.

In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale

Intracellular recording of spinal motoneurons in vivo provides a &#8220;gold standard&#8221; for determining the cells&#8217; electrophysiological ...

In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively thin to properly visualize and access neurons for patch-clamping or imaging, and in vitro examination of brain circuitry is limited to only what is physically present in the acute slice. To maintain the benefits of in vitro slice experimentation while preserving a larger portion of presynaptic nuclei, we developed a novel slice preparation. This &#8220;wedge slice&#8221; was designed for patch-clamp electrophysiology recordings to characterize the diverse monaural, sound-driven inputs to medial olivocochlear (MOC) neurons in the brainstem. These neurons receive their primary afferent excitatory and inhibitory inputs from neurons activated by stimuli in the contralateral ear and corresponding cochlear nucleus (CN). An asymmetrical brain slice was designed which is thickest in the rostro-caudal domain at the lateral edge of one hemisphere and then thins towards the lateral edge of the opposite hemisphere. This slice contains, on the thick side, the auditory nerve root conveying information about auditory stimuli to the brain, the intrinsic CN circuitry, and both the disynaptic excitatory and trisynaptic inhibitory afferent pathways that converge on contralateral MOC neurons. Recording is performed from MOC neurons on the thin side of the slice, where they are visualized using DIC optics for typical patch-clamp experiments. Direct stimulation of the auditory nerve is performed as it enters the auditory brainstem, allowing for intrinsic CN circuit activity and synaptic plasticity to occur at synapses upstream of MOC neurons. With this technique, one can mimic in vivo circuit activation as closely as possible within the slice. This wedge slice preparation is applicable to other brain circuits where circuit analyses would benefit from preservation of upstream connectivity and long-range inputs, in combination with the technical advantages of in vitro slice physiology.

Integration of diverse synaptic inputs to neurons is best measured in a preparation that preserves all pre-synaptic nuclei for natural timing and circuit plasticity, but brain slices typically sever many connections. We developed a modified brain slice to mimic in vivo circuit activity while maintaining in vitro experimentation capability.

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

In vitro slice electrophysiology techniques measure single-cell activity with precise electrical and temporal resolution. Brain slices must be relatively ...

Recording Network Activity in Spinal Nociceptive Circuits Using Microelectrode Arrays

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an increasingly detailed view of the circuits underpinning spinal pain processing. However, the effects of these connections for broader network activity in the DH remain less well understood because most studies focus on the activity of single neurons and small microcircuits. Alternatively, the use of microelectrode arrays (MEAs), which can monitor electrical activity across many cells, provides high spatial and temporal resolution of neural activity. Here, the use of MEAs with mouse spinal cord slices to study DH activity induced by chemically stimulating DH circuits with 4-aminopyridine (4-AP) is described. The resulting rhythmic activity is restricted to the superficial DH, stable over time, blocked by tetrodotoxin, and can be investigated in different slice orientations. Together, this preparation provides a platform to investigate DH circuit activity in tissue from na&#239;ve animals, animal models of chronic pain, and mice with genetically altered nociceptive function. Furthermore, MEA recordings in 4-AP-stimulated spinal cord slices can be used as a rapid screening tool to assess the capacity of novel antinociceptive compounds to disrupt activity in the spinal cord DH.

The combined use of microelectrode array technology and 4-aminopyridine-induced chemical stimulation for investigating network-level nociceptive activity in the spinal cord dorsal horn is outlined.

Registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi

The roles and connectivity of specific types of neurons within the spinal cord dorsal horn (DH) are being delineated at a rapid rate to provide an ...

Comprendere le risposte dei motoneuroni alla stimolazione del midollo spinale

The Ex vivo Preparation of Spinal Cord Slice for the Whole-Cell Patch-Clamp Recording in Motor Neurons During Spinal Cord Stimulation

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to execute sensorimotor behaviors, directly studying the electrical responses of motor neurons with SCS can help us understand the underlying logic of spinal motor modulation. To simultaneously record diverse stimulus characteristics and cellular responses, a patch-clamp is a good method to study the electrophysiological characteristics at a single-cell scale. However, there are still some complex difficulties in achieving this goal, including maintaining cell viability, quickly separating the spinal cord from the bony structure, and using the SCS to successfully induce action potentials. Here, we present a detailed protocol using patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to SCS with high spatiotemporal resolution, which can help researcher improve their skills in separating the spinal cord and maintaining the cell viability at the same time to smoothly study the electrical mechanism of SCS on motor neuron and avoid unnecessary trial and mistake.

Autore in primo piano: Avanzamento della stimolazione del midollo spinale - Esplorazione delle risposte cellulari dei motoneuroni attraverso l'elettrofisiologia del patch-clamp 

This protocol describes a method using a patch-clamp to study the electrical responses of motor neurons to spinal cord stimulation (SCS) with high spatiotemporal resolution, which can help researchers improve their skills in separating the spinal cord and maintaining cell viability simultaneously.

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

Spinal cord stimulation (SCS) can effectively restore locomotor function after spinal cord injury (SCI). Because the motor neurons are the final unit to ...

La preparazione di Oblique Spinal Cord Fette per ventrale Root Stimolazione

Riepilogo

Esplora Altri Video

Capitoli in questo video

Acuta dissociazione di Lamprey reticulospinal assoni per attivare la registrazione dal rilascio Volto membrana di singoli funzionali terminali presinaptici

Iniezioni intramuscolari Lungo le piastre Motor finale: un approccio mini-invasivo di navetta Tracers Direttamente nella Motor Neurons

zebrafish

Preparazione delle fette Acute del midollo spinale per la registrazione di cellule intere Patch-clamp in neuroni di sostanza Gelatinosa

Preparazione di ritmicamente-attivo In Vitro neonatale del roditore del tronco cerebrale-spinale e fetta sottile

In Vivo Registrazione intracellulare di Motoneuroni Spinali Ratti Identificati dal Tipo durante la stimolazione a corrente diretta trans-spinale

Preparazione della fetta di cuneo in vitro per imitare la connettività del circuito neuronale in vivo

Registrazione dell'attività di rete nei circuiti nocicettivi spinali utilizzando array di microelettrodi

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale

La preparazione ex vivo di una fetta di midollo spinale per la registrazione del patch-clamp a cellula intera nei motoneuroni durante la stimolazione del midollo spinale